Isolement et culture de cellules endothéliales pulmonaires des souris néonatales

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole pour l'isolement et la culture de cellules endothéliales murines pulmonaires. Cette méthode comprend mécanicien et dissociation enzymatique du tissu pulmonaire ainsi que d'un processus de purification en 2 étapes utilisant des anticorps anti-PECAM-1 et anti-ICAM-2 anticorps conjugués à des billes magnétiques, ce qui produit une population de cellules endothéliales pures d'origine essentiellement microvasculaires.

Résumé

Les cellules endothéliales de fournir un modèle de recherche utiles dans de nombreux domaines de la biologie vasculaire. Depuis son premier isolement ^1, des cellules endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) ont montré pour être pratique, facile à obtenir et à la culture, et sont donc les cellules endothéliales plus largement étudié. Cependant, pour des recherches axées sur les processus de l'angiogenèse comme les autres, la perméabilité ou plusieurs cellules endothéliales microvasculaires (ECs) sont un modèle beaucoup plus physiologiquement pertinents pour l'étude ^2. Par ailleurs, EC isolées de souris knockout fournir un outil utile pour l'analyse des protéines ex vivo la fonction. Plusieurs approches d'isoler et de la culture microvasculaires ECs de différentes origines ont été rapportés à ce jour ^3-7, mais l'isolement et la culture cohérente de pure ECS est toujours un problème technique majeur dans de nombreux laboratoires. Ici, nous fournissons un protocole étape par étape sur une méthode fiable et relativement simple d'isoler et de cultiver des cellules de souris pulmonaires endothéliales (MLECs). Dans cette approche, les tissus pulmonaires obtenues à partir de 6 - 8 jours chiots ancienne est d'abord coupé en morceaux, digérés par la collagénase / dispase (C / D) en solution et dispersés mécaniquement dans une seule cellule de suspension. MLECS sont purifiés à partir de cellules en suspension en utilisant une sélection positive avec des anti-PECAM-1 anticorps conjugué à Dynabeads utilisant un concentrateur de particules magnétiques (MPC). Ces cellules purifiées sont cultivées sur la culture de tissus enduits de gélatine (TC) plats jusqu'à ce qu'ils deviennent confluentes. A ce stade, les cellules sont encore purifiée en utilisant Dynabeads couplé à l'anti-ICAM-2 anticorps. MLECs obtenus avec ce protocole présentent un phénotype pavées, comme visualisé par microscopie optique à contraste de phase, et leur phénotype endothélial a été confirmée en utilisant une analyse FACS avec des anti-VE-cadhérine ⁸ et anti-VEGFR2 ⁹ anticorps et coloration par immunofluorescence de la VE-cadhérine. Dans nos mains, cette procédure d'isolement en deux étapes cohérente et fiable des rendements d'une population pure de MLECs, qui peut encore être cultivé. Cette méthode permettra aux chercheurs de profiter du nombre croissant de knock-out et des souris transgéniques pour une corrélation directe entre les études in vivo avec des résultats d'expériences in vitro réalisées sur MLECs isolées et contribuer ainsi à révéler des mécanismes moléculaires des phénotypes vasculaires observés in vivo.

Protocole

1. Préparation anti-PECAM-1-anticorps conjugués des billes magnétiques (Dynabeads)

1. Préparer 0,1% de BSA dans du PBS en mélangeant 50 mg de BSA dans 50 ml de PBS en utilisant un vortex jusqu'à BSA dissout. Stériliser par filtration sur filtre de 0,22 um seringue. Conserver à 4 ° C.
2. Dans la hotte de TC, le transfert de 200 pi de bien resuspendu Dynabeads IgG de mouton anti-rat dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et laver les perles: tube mont sur le MPC et laisser reposer pendant environ 1 min pour permettre aux billes de sédiments. Aspirer le surnageant, retirer le tube du MPC et de remettre en suspension les perles dans 1 ml de solution stérile de 0,1% BSA / PBS. Pipeter haut et bas pour resuspendre perles.
3. Répétez laver plus de trois fois, pour un total de quatre lavages.
4. Retirer le tube du MPC et de remettre en suspension les perles dans 500 ul de 0,1% de BSA / PBS.
5. Ajouter 10 ul rat anti-souris PECAM-1 (CD-31) anticorps pour le tube.
6. Tumble nuit à 4 ° C dans la chambre froide ou 2 heures à température ambiante.
7. Laver les billes avec stériles 0,1% BSA / PBS comme décrit dans l'étape 1.2 à quatre reprises.
8. Retirer le tube du MPC et de remettre en suspension les perles dans 200 ul de 0,1% BSA / PBS. Boutique anti-PECAM-1-anticorps conjugués Dynabeads à 4 ° C pour un maximum de 1 mois.

2. Isoler la souris cellules endothéliales pulmonaires chez les souris néonatales

Avant de procéder avec le protocole de purification des tissus, IACUC approbation du Comité de la procédure est nécessaire.

1. Préparer les éléments suivants:
   • 15 ml de 1 mg / ml C / D solution dans du DMEM. Filtre avec une seringue 0,22 um filtre et chaude à 37 ° C.
   • Tube de 50 ml conique avec 15 ml de DMEM, de stocker sur la glace
   • Isolement des médias (IM) contenant 20% de FBS et 1x pénicilline / streptomycine dans le DMEM
   • 2% de gélatine. Mélanger 2 g de gélatine bovine peau avec 100 ml d'eau dd, autoclave 15 minutes et conserver à 4 ° C. Chaude à 37 ° C pour liquéfier avant flacons TC revêtement.
2. Anesthetize trois chiots 6-8 jours anciens en utilisant une injection IP de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg). Vérifier l'efficacité de l'anesthésie et disséquer des animaux, un par un, comme suit: chiots Pin à bord, faire tremper la peau avec de l'éthanol 70% et enlever la peau de la région de la poitrine avec des ciseaux de dissection stériles. Accise de la cage thoracique afin d'exposer les poumons.
3. Aseptiquement accise lobes pulmonaires individuelles, en faisant attention de ne pas disséquer les bronches et les tissus conjonctifs visibles autour des poumons. Combiner tous les poumons glacée DMEM. Euthanasier les chiots.
4. Travailler dans la hotte TC, retirez les lobes pulmonaires du DMEM, placer dans un plat de 100 mm TC et aspirer l'excès DMEM.
5. L'aide de ciseaux stériles, émincer finement le tissu en coupant ~ 100 fois. Transfert à 15 ml chaleureuse C / D pour la solution de digestion enzymatique. Incuber 45 minutes à 37 ° C sur un agitateur.
6. Dans la hotte TC, aspirer la suspension de tissu digéré en une seringue de 20 ml avec 14 g de touffes canule jointe et triturer dans une suspension cellulaire unique, au moins 12 fois.
7. Passez la suspension de tissu à travers un tamis 70 pm cellules et laver le filtre avec 15 ml IM à arrêter la digestion.
8. Suspension cellulaire par centrifugation à 400x g pendant 5 minutes.
9. Aspirer le surnageant et remettre le culot dans 3 ml de 0,1% BSA / PBS.
10. Transfert suspension cellulaire à 5 ml tube de polystyrène à fond rond et ajouter 22,5 ul anti-PECAM-1-anticorps conjugués Dynabeads. Tumble à température ambiante pendant 12 minutes.
11. Manteau un flacon T75 avec 2 mL 2% de gélatine et de l'excès d'aspiration de la gélatine. Laisser sécher la gélatine à l'intérieur du capot de TC pendant environ 30 minutes avant de cellules de placage.
12. Après une incubation de perles est terminé (étape 2.10), répartis de façon égale en suspension de cellules des tubes Eppendorf trois et monter sur la MPC.
13. Lorsque les billes ont sédimentées en utilisant le MPC (~ 1 min), ramasser le surnageant, retirer le tube du MPC, lavez perles avec ~ 1 ml de 0,1% BSA / PBS, puis remontez sur la MPC.
14. Répétez laver quatre fois (au total 5 lavages)
15. Perles Remettre en suspension dans 1 ml de VascuLife avec des facteurs de vie EnGS-MV Kit et 1x pénicilline / streptomycine (VL) par tube, bien mélanger.
16. Plaque sur un pré-enduites flacon T75 et amener le volume total dans chaque flacon de 10 ml avec VL.
17. Changer les médias le lendemain, permettra un jour complet de la croissance, puis le changement de la moitié des médias tous les jours. Lorsque les cellules sont> 70-80% confluentes ou plus (généralement après 3-4 jours de culture), ils peuvent être triés avec des anti-ICAM-2 Dynabeads.

3. Préparation anti-ICAM-2 anticorps conjugués Dynabeads

1. Dynabeads anti-ICAM-2 anticorps conjugués sont utilisés pour purifier davantage les cellules qui ont été sélectionnés avec des anti-PECAM-1-anticorps conjugués Dynabeads et cultivée jusqu'au confluent. Cette procédure est réalisée comme décrit pour Dynabeads anti-PECAM-1-anticorps conjugués (1, ci-dessus), sauf que l'anti-souris ICAM-2 (CD-102) anticorps est utilisé à la place de l'anti-PECAM-1 anticorps.
2. Dynabeads anti-ICAM-2 anticorps conjugués peuvent être conservés à 4 ° C jusqu'àà 1 mois.

4. Le tri des cellules de poumon de la souris endothéliales avec anti-ICAM-2 Dynabeads

1. Manteau T75 flacon de culture tissulaire avec 2% de gélatine.
2. Aspirer les médias de la confluence flacon T75 avec des cellules et laver avec 8 ml de PBS.
3. Aspirer le PBS, ajouter 2 ml 0,05% de trypsine / EDTA et laissez cellules se détachent (environ 5 minutes). Tap flacons légèrement pour détacher l'aide.
4. Lorsque les cellules se sont détachées, ajouter 2 ml IM à inhiber la trypsine les cellules et gratter pour détacher les cellules adhérentes restantes. Transfert suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et centrifuger pendant 5 min à 400x g.
5. Aspirer les médias et les cellules Resuspendre le culot dans 2 ml de 0,1% BSA / PBS.
6. Transférer dans un 5 ml en polystyrène à fond rond tube et ajouter 10 ul anti-ICAM-2 Dynabeads. Tumble pendant 12 minutes à température ambiante.
7. Fractionner cellules en suspension dans deux tubes de 1,5 ml Eppendorf et monter sur le MPC.
8. Aspirer le surnageant après perles ont adhéré pendant une minute. Retirer les tubes de MPC et resuspendre chaque tube dans 1 ml de 0,1% BSA / PBS. Remontez sur le MPC.
9. Répétez laver quatre fois (total de 5 lavages).
10. Resuspendre chaque tube avec 1 ml VL et d'effectuer un comptage des cellules.
11. Cellules de la plaque à 250-350K cellules par flacon T25 et / ou 750K-1 millions de cellules par flacon T75.
12. Amener le volume à 5 ml VL dans des flacons T25 et T75 10 ml dans des flacons.
13. Changer les médias tous les jours. Les cellules peuvent être utilisés pour des expériences lorsque la culture atteint environ 80% de confluence, généralement en 2-3 jours.

5. Les résultats représentatifs

Généralement, après 6-7 jours de la préparation initiale des cellules, nous sommes en mesure d'obtenir environ 01.02 à 01.05 x 10 ⁶ cellules endothéliales pulmonaires de trois chiots 6-8 jours anciens. Cellules d'affichage typique »pavées" morphologie en microscopie optique et de montrer la VE-cadhérine (CD144) à la coloration jonctions cellule-cellule, qui est caractéristique des cellules endothéliales (figure 1). La majorité des MLECs expresse VE-cadhérine et VEGFR2 comme démontré par analyse FACS (figure 2). Habituellement, nous les utilisons pour des expériences dans les deux semaines après l'isolement initial MLEC.

Figure 1. L'analyse microscopique des MLEC monocouche confluente. (A) Image au microscope optique montre la morphologie des cellules cultivées pavées typiques des cellules endothéliales. Uniforme structures rondes situées dans la région périnucléaire de nombreuses cellules sont les billes magnétiques utilisées pour l'isolement MLEC. (B) endothélial spécifique VE-cadhérine est localisée au niveau des jonctions cellule-cellule comme indiqué en utilisant la microscopie confocale. Bar est représentatif de 20μm.

Figure 2 analyse FACS des MLECs culture marquées avec des anticorps spécifiques pour endothéliales des marqueurs spécifiques:. VE-cadhérine (CD144) ou VEGFR2, comme inculpé, suivie par la phycoérythrine anticorps secondaire conjugué, confirme l'identité de l'endothélium MLECs isolés. La ligne rouge indique isotype-spécifiques de contrôle, la ligne verte indique anti-VE-cadhérine ou anti-VEGFR2 - spécifiques IgG.

Discussion

Microvasculaire EC se sont révélés être un modèle utile dans de nombreux domaines de la biologie vasculaire et sont considérés comme physiologiquement plus pertinent d'étudier (par exemple l'angiogenèse) que largement étudié HUVEC ^3. Auparavant, il a été rapporté que microvasculaires ECS peut être obtenu à partir de rein, cœur, peau de tissu adipeux, la rétine, le cerveau, le gliome, et aussi des poumons ^{2, 4-7, 10, 11.} Toutefois, une méthode cohérente et fiable pour l'isolement des complications microvasculaires ECS est toujours requis. La procédure présentée ici est une modification d'un protocole de ^deux publiés antérieurement; elle diffère de la plupart des procédures publiées en ce qu'elle utilise les chiots au lieu d'animaux adultes. Ceci est crucial pour le succès d'isolement que les cellules de jeunes animaux ont un potentiel élevé de prolifération et de cultures dérivées de leurs tissus ont tendance à donner plus grand nombre de cellules. Une semaine anciens animaux semblent être optimales mais les jeunes souris (quatre jours d'âge) peuvent également être utilisés. En outre, nombre supérieur ou inférieur de chiots peut être utilisée si nécessaire, comme nous avons réussi à isoler MLECs d'un chiot. Cependant, tout en réduisant le haut ou vers le bas le processus d'isolement, densité de placage cellulaire doit rester inchangée, comme cela est également critique pour la prolifération cellulaire. Le processus de purification en 2 étapes du MLECs utilisant des billes magnétiques conjuguées premier anti-PECAM-1 et que les anti-ICAM-2 anticorps est beaucoup plus efficace d'obtenir des cultures pures de CE que les procédures décrites précédemment de purification en une seule étape. Ce protocole élimine la nécessité d'utiliser des techniques manuelles très laborieux, la centrifugation de gradient et FACS moins efficace de tri des cellules jeter polluants tels que les fibroblastes, les cellules sanguines et des cellules musculaires lisses. La population résultant MLEC peut être utilisé pour l'analyse in vitro des réponses angiogéniques, la perméabilité vasculaire et la transmigration des leucocytes, la cicatrisation des plaies ainsi que l'analyse biochimique des voies de signalisation. Si nécessaire, MLECs peuvent être plaqués sur différentes surfaces telles que des lamelles de fibronectine ou de la gélatine à revêtement pour les tableaux immunofluorescence ou d'électrodes pour la résistance trans-endothéliale (TER) mesures. Les résultats obtenus peuvent être comparés directement aux phénotypes observés in vivo, ce qui est particulièrement important dans le contexte de l'augmentation du nombre des huitièmes de finale et de lignées de souris transgéniques. Mise en œuvre réussie de cette méthode pour l'analyse in vitro des mécanismes cellulaires qui sous-tendent les défauts observés in vivo, a déjà été présentée ^12.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spring scissors	Fine Science Tools	15032-13
forceps	Fine Science Tools	11223-20
14G cannula	Fisher Scientific	1482516N
20 ml syringe	BD Biosciences	309661
BSA	Sigma-Aldrich	A7030-100G
anti-rat IgG Dynabeads	Invitrogen	110.35
Magnetic Particle Concentrator (MPC)	Invitrogen	123-21D
anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31)	BD Biosciences	553369
anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102)	BD Biosciences	553326
Collagenase/Dispase (C/D)	Roche Group	11097113001	100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C
DMEM	Cellgro	10-013-CV
Bovine Skin Gelatin	Sigma-Aldrich	#G9391-100G
Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL)	Lifeline Cell Technology	LL0004
0.05% Trypsin/EDTA	Mediatech, Inc.	25-052-CI
Cell strainer 70 μm nylon	Falcon BD	352350
tissue culture flask 75 cm2	Techno Plastic Products	90076