Isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati

Riepilogo

Qui, descriviamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di cellule murine endoteliali polmonari. Questo metodo comprende meccanico e dissociazione enzimatica tessuto polmonare e una 2-step processo di purificazione con anti-PECAM-1 e anti-ICAM-2 anticorpi coniugati a sfere magnetiche, che produce una popolazione pura di cellule endoteliali di origine per lo più microvascolare.

Abstract

Le cellule endoteliali forniscono un utile modello di ricerca in molte aree della biologia vascolare. Fin dal suo primo isolamento ^1, cellule endoteliali della vena ombelicale (HUVECs) hanno dimostrato di essere comodo, facile da ottenere e cultura e, quindi, sono le cellule più ampiamente studiato endoteliali. Tuttavia, per la ricerca si è focalizzata sui processi come gli altri angiogenesi, permeabilità o molti, cellule endoteliali (EC) sono un modello molto più fisiologicamente rilevanti per lo studio ^2. Inoltre, EC isolate da topi knockout per fornire un utile strumento per l'analisi ex-vivo di funzione della proteina. Diversi approcci per isolare e microvascolare cultura EC di diversa provenienza sono stati segnalati fino ad oggi ^3-7, ma consistente isolamento e la cultura della pura ECS è ancora un grave problema tecnico in molti laboratori. Qui, forniamo un passo-passo protocollo su un metodo affidabile e relativamente semplice di isolare e coltura delle cellule endoteliali del polmone del mouse (MLECs). In questo approccio, tessuto polmonare ottenuti da 6 - a 8 giorni di cuccioli di età è prima tagliato a pezzi, digerito con collagenasi / dispasi (C / D) la soluzione e disperse meccanicamente in cella singola sospensione. MLECS sono purificati dalla sospensione cellulare tramite selezione positiva con l'anti-PECAM-1 coniugato a Dynabeads utilizzando un concentratore di particelle magnetiche (MPC). Tali cellule purificate sono coltivati ​​su gelatina rivestita coltura tissutale (TC) piatti fino a diventare confluenti. A quel punto, le cellule sono ulteriormente purificato con Dynabeads accoppiato ad anti-ICAM-2 anticorpi. MLECs ottenuti con questo protocollo mostra un fenotipo ciottoli, come visualizzato in contrasto di fase microscopia ottica, e il loro fenotipo endoteliale è stata confermata con analisi FACS con anti-VE-caderina ⁸ e anti-VEGFR2 ⁹ anticorpi e colorazione di immunofluorescenza di VE-caderina. Nelle nostre mani, questa procedura in due fasi isolamento in modo coerente e affidabile produce una popolazione pura di MLECs, che può essere ulteriormente coltivate. Questo metodo permetterà ai ricercatori di sfruttare il crescente numero di topi transgenici e knockout per correlare direttamente studi in vivo con i risultati di esperimenti in vitro eseguiti su MLECs isolato, contribuendo così a svelare i meccanismi molecolari del fenotipo vascolare osservata in vivo.

Protocollo

1. Preparazione biglie magnetiche anti-PECAM-1 anticorpo-coniugato (Dynabeads)

1. Preparare 0,1% BSA in PBS mescolando 50 mg in 50 ml di BSA PBS usando un vortice fino a BSA si dissolve. Sterilizzare per filtrazione attraverso filtro 0,22 micron siringa. Conservare a 4 ° C.
2. Nel cofano TC, trasferire 200 ul di ben risospeso pecora anti-topo IgG Dynabeads in una provetta Eppendorf da 1,5 ml e lavare le perle: il tubo di Monte MPC e lasciate riposare per circa 1 minuto per consentire le perle di sedimento. Aspirare il surnatante, rimuovere il tubo dal MPC e risospendere le sfere in 1 ml di sterile 0,1% BSA / PBS. Pipetta su e giù per risospendere le sfere.
3. Ripetere il lavaggio altre tre volte, per un totale di quattro lavaggi.
4. Rimuovere la provetta dal MPC e risospendere le sfere in 500 ml di 0,1% BSA / PBS.
5. Aggiungere 10 microlitri di ratto anti-topo PECAM-1 (CD-31) anticorpi al tubo.
6. Caduta durante la notte a 4 ° C nella stanza fredda o 2 ore a temperatura ambiente.
7. Lavare le perline con sterile 0,1% BSA / PBS come descritto al punto 1,2 quattro volte.
8. Rimuovere la provetta dal MPC e risospendere le sfere in 200 l 0,1% BSA / PBS. Conservare anti-PECAM-1 anticorpo-coniugato Dynabeads a 4 ° C per un massimo di 1 mese.

2. Isolare topo le cellule endoteliali polmonari di topi neonati

Prima di procedere con il protocollo di purificazione del tessuto, IACUC approvazione del Comitato delle procedura è necessaria.

1. Preparare la seguente:
   • 15 ml di 1 mg / ml C / D soluzione in DMEM. Filtro con siringa da 0,22 micron filtro e calda a 37 ° C.
   • Tubo da 50 ml con 15 ml di DMEM, memorizzare sul ghiaccio
   • Isolamento Media (IM) contenente 20% FBS e 1 penicillina / streptomicina in DMEM
   • 2% di gelatina. Mix 2 g di pelle bovina gelatina con 100 ml di acqua gg, autoclave 15 minuti e conservare a 4 ° C. Calda a 37 ° C per liquefare prima del rivestimento fiaschi TC.
2. Anestetizzare tre cuccioli di 6-8 giorno di vita con una iniezione IP di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Controllare l'efficacia di anestesia e sezionare gli animali uno per uno, come segue: cuccioli Pin a bordo, bagnare la pelle con il 70% etanolo e togliere la pelle dalla zona del torace con le forbici dissezione sterile. Accise la gabbia toracica per esporre polmoni.
3. Asetticamente accise lobi polmonari individuale, facendo attenzione a non sezionare i bronchi e visibile qualsiasi tessuto connettivo intorno ai polmoni. Unire tutti polmoni ghiacciata DMEM. Eutanasia dei cuccioli.
4. Lavorare nel cofano TC, rimuovere lobi polmonari da DMEM, posto in un piatto da mm 100 TC e aspirare l'eccesso DMEM.
5. Usando forbici sterili, tritare finemente il tessuto tagliando ~ 100 volte. Trasferimento a 15 ml caldo C / D soluzione per la digestione enzimatica. Incubare 45 minuti a 37 ° C su un rotatore.
6. Nel cofano TC, aspirare la sospensione tessuto digerito in una siringa da 20 ml con 14 g grumi cannula collegata e triturare in una sospensione singola cella, almeno 12 volte.
7. Passare la sospensione dei tessuti attraverso un filtro a 70 micron di cellule e lavare il filtro con 15 ml di IM per fermare la digestione.
8. Pellet sospensione cellulare mediante centrifugazione a 400x g per 5 minuti.
9. Aspirare il surnatante e risospendere pellet in 3 ml 0,1% BSA / PBS.
10. Trasferimento sospensione cellulare a 5 ml a fondo rotondo in polistirene e aggiungere 22,5 microlitri anti-PECAM-1 anticorpo-coniugato Dynabeads. Tumble a temperatura ambiente per 12 minuti.
11. Un cappotto T75 pallone con 2 ml al 2% di gelatina e aspirare l'eccesso di gelatina. Lasciare asciugare gelatina all'interno della cappa TC per circa 30 minuti prima di cellule placcatura.
12. Dopo l'incubazione tallone è completo (passo 2.10), divisi equamente sospensione cellulare in tre provette Eppendorf e montata sul MPC.
13. Quando le microsfere sono sedimentate con il MPC (~ 1 min), raccogliere il supernatante, rimuovere tubo da MPC, lavare perline con ~ 1 ml 0,1% BSA / PBS, e poi rimontare sul MPC.
14. Ripetere il lavaggio quattro volte (totale 5 lavaggi)
15. Perline Risospendere in 1 ml di VascuLife con EnGS-Mv Vita Fattori Kit e 1x penicillina / streptomicina (VL) per tubo, mescolando bene.
16. Piastra su un preverniciato T75 pallone e portare il volume totale in ogni pallone a 10 ml con VL.
17. Cambiare i media il giorno successivo, 1 giornata piena di crescita, e quindi modificare la metà dei mezzi di comunicazione a giorni alterni. Quando le cellule sono> 70-80% confluenti o più (di solito dopo 3-4 giorni di cultura), possono essere ordinati con anti-ICAM-2 Dynabeads.

3. Preparazione anti-ICAM-2 anticorpo-coniugato Dynabeads

1. Dynabeads anti-ICAM-2 anticorpo-coniugato vengono utilizzati per purificare ulteriormente le cellule che sono state selezionate con anti-PECAM-1 anticorpo-coniugato Dynabeads e colto fino confluenti. Questa procedura viene eseguita come descritto per Dynabeads anti-PECAM-1 anticorpo-coniugato (1, sopra), tranne che anti-topo ICAM-2 (CD-102) viene usato al posto degli anticorpi anti-PECAM-1 anticorpi.
2. Dynabeads anti-ICAM-2 anticorpo-coniugato può essere conservato a 4 ° C per un massimoa 1 mese.

4. Ordinamento cellule polmonari endoteliali Mouse con anti-ICAM-2 Dynabeads

1. Cappotto T75 cultura fiasco del tessuto con il 2% di gelatina.
2. Aspirare il supporto dal confluenti T75 pallone con le cellule e lavare con 8 ml di PBS.
3. Aspirare il PBS, aggiungere 2 ml 0,05% tripsina / EDTA e lasciare che le cellule staccare (circa 5 minuti). Toccare fiaschi leggermente per aiutare distacco.
4. Quando le cellule sono staccati, aggiungere 2 ml IM di inibire le cellule tripsina e raschiare di staccare tutte le cellule rimanenti aderente. Trasferimento sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e spin down per 5 min a 400x g.
5. Aspirare i media e risospendere pellet di cellule in 2 ml 0,1% BSA / PBS.
6. Trasferire in un polistirolo da 5 ml a fondo rotondo tubo e aggiungere 10 microlitri anti-ICAM-2 Dynabeads. Biancheria per 12 minuti a temperatura ambiente.
7. Split sospensione cellulare in due provette Eppendorf da 1,5 ml e montata sul MPC.
8. Aspirare il surnatante dopo perline hanno aderito per un minuto. Rimuovere i tubi da MPC e risospendere ogni tubo in 1 ml 0,1% BSA / PBS. Rimontare il MPC.
9. Ripetere il lavaggio quattro volte (totale di 5 lavaggi).
10. Risospendere ogni provetta contenente 1 ml VL ed eseguire un conteggio delle cellule.
11. Cellule piastra a 250-350K cellule per T25 pallone e / o 750K-1 milioni di cellule per T75 pallone.
12. Portare il volume a 5 VL ml in fiasche T25 e T75 in 10 ml fiaschi.
13. Cambiare i media a giorni alterni. Le celle possono essere utilizzati per esperimenti quando la cultura raggiunge circa l'80% confluenza, di solito in 2-3 giorni.

5. Rappresentante Risultati

In genere, dopo 6-7 giorni dalla preparazione iniziale delle cellule, siamo in grado di ottenere circa 1,2-1,5 x 10 ⁶ cellule endoteliali polmonari da tre 6-8 cuccioli giorno di vita. Cellule visualizzazione tipica morfologia "ciottoli" al microscopio ottico e mostrare VE-caderina (CD144) colorazione a giunzioni cellula-cellula, che è caratteristico per le cellule endoteliali (Figura 1). Maggioranza di esprimere MLECs VE-caderina e VEGFR2 come dimostrato da analisi FACS (Figura 2). Di solito, li usiamo per esperimenti entro due settimane dopo l'isolamento iniziale MLEC.

Figura 1. Analisi al microscopio di confluenti monostrato MLEC. (A) immagine microscopia evidenzia morfologia ciottoli di cellule in coltura tipica per le cellule endoteliali. Uniforme strutture rotondo situato nella zona perinucleare di molte cellule sono le sfere magnetiche utilizzate per l'isolamento MLEC. (B) endoteliali specifici VE-caderina è localizzato presso la cellula-cellula incroci, come indicato usando la microscopia confocale. Bar è rappresentativo di 20μm.

Figura 2 analisi FACS di MLECs colto etichettati con anticorpi specifici per l'endotelio-specifici marcatori:. VE-caderina (CD144) o VEGFR2, come accusato, seguita da ficoeritrina anticorpo secondario coniugato, conferma l'identità di MLECs endoteliali isolate. Linea rossa indica isotipo-specifici di controllo, la linea verde indica anti-VE-caderina o anti-VEGFR2 - specifica-IgG.

Discussione

Microvascolari EC hanno dimostrato di essere un modello utile in molte aree della biologia vascolare e si crede di essere più fisiologicamente rilevanti per lo studio (angiogenesi ad esempio) che ampiamente studiato HUVECs ^3. In precedenza, è stato riportato che microvascolare EC possono essere ottenute da reni, cuore, tessuto adiposo della pelle, della retina, del cervello, i gliomi, ma anche polmone ^{2, 4-7, 10, 11.} Tuttavia, un metodo coerente e affidabile per l'isolamento di microvascolare ECS è ancora necessaria. La procedura qui presentata è una modifica di un protocollo precedentemente pubblicato ^2; si differenzia dalla maggior parte delle procedure pubblicate in quanto utilizza cuccioli invece di animali adulti. Questo è fondamentale per il successo isolamento di cellule da giovani animali hanno un potenziale di proliferazione maggiore e culture deriva dal loro tessuti tendono a produrre un numero maggiore di cellule. Una settimana di vita gli animali sembrano essere ottimali, ma più giovani topi (giorno-vecchio 4) può anche essere usato. Inoltre, i numeri più alti o più bassi di cuccioli può essere utilizzata, se necessario, in quanto siamo riusciti a isolare MLECs da un cucciolo. Tuttavia, mentre la scala verso l'alto o verso il basso il processo di isolamento, placcatura densità cellulare deve rimanere invariato, in quanto questo è anche fondamentale per la proliferazione cellulare. Il 2-step del processo di purificazione MLECs utilizzando biglie magnetiche coniugate prima anti-PECAM-1 e di anti-ICAM-2 anticorpi è molto più efficiente ad ottenere puro culture CE rispetto alla precedentemente descritte passo-passo le procedure di purificazione. Questo protocollo elimina la necessità di utilizzare tecniche manuali molto laborioso, centrifugazione gradiente e FACS meno efficiente di smistamento per le cellule scartando contaminanti, come i fibroblasti, cellule del sangue e cellule muscolari lisce. La popolazione risultante MLEC può essere utilizzato per l'analisi in vitro delle risposte angiogenici, permeabilità vascolare e la trasmigrazione dei leucociti, la guarigione della ferita e l'analisi biochimica delle vie di segnalazione. Se necessario, MLECs può essere placcato su superfici diverse, come coprioggetto fibronectina o gelatina rivestite di immunofluorescenza o array di elettrodi per la trans-endoteliale resistenza (TER) misurazioni. Risultati ottenuti possono essere direttamente confrontati con i fenotipi osservate in vivo, che è particolarmente importante nel contesto del crescente numero di eliminazione diretta e le linee di topi transgenici. Il successo di questo metodo per l'analisi in vitro dei meccanismi cellulari alla base difetti osservate in vivo, è già stato presentato ^12.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spring scissors	Fine Science Tools	15032-13
forceps	Fine Science Tools	11223-20
14G cannula	Fisher Scientific	1482516N
20 ml syringe	BD Biosciences	309661
BSA	Sigma-Aldrich	A7030-100G
anti-rat IgG Dynabeads	Invitrogen	110.35
Magnetic Particle Concentrator (MPC)	Invitrogen	123-21D
anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31)	BD Biosciences	553369
anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102)	BD Biosciences	553326
Collagenase/Dispase (C/D)	Roche Group	11097113001	100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C
DMEM	Cellgro	10-013-CV
Bovine Skin Gelatin	Sigma-Aldrich	#G9391-100G
Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL)	Lifeline Cell Technology	LL0004
0.05% Trypsin/EDTA	Mediatech, Inc.	25-052-CI
Cell strainer 70 μm nylon	Falcon BD	352350
tissue culture flask 75 cm2	Techno Plastic Products	90076