신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

요약

여기, 우리는 murine 폐동맥 내피 세포의 격리와 문화 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 정비사 및 효소 폐 조직 분리뿐만 아니라 안티 - PECAM - 1과 대부분 microvascular 원산지 순수한 내피 세포 인구를 생산 자성 비즈에 복합 백신 ICAM - 2 항체를 사용하여 2 단계 정화 과정으로 구성됩니다.

초록

내피 세포는 혈관 생물학의 여러 분야에서 유용한 연구 모델을 제공합니다. 처음으로 고립 ^{1 일} 이후, 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs) 가장 널리 연구 내피 세포 수 있습니다 따라서, 구하는 문화를 쉽고 편리하게하는 표시하고 있습니다. 그러나, angiogenesis, 투자율이나 많은 사람과 같은 프로세스에 초점을 맞춘 연구, microvascular 내피 세포 (내장 컴퓨터 시스템)은 ² 연구 훨씬 더 생리학 관련성이 높은 모델입니다. 또한, 녹아웃 마우스에서 분리된 내장 컴퓨터 단백질 기능의 예 생체내 분석을위한 유용한 도구를 제공합니다. 몇 가지 접근 방법은 격리와 문화 microvascular 다른 원산지의 항법 것은 날짜를 ^3-7로보고 있지만, 순수 항법의 일관성 고립과 문화는 여전히 많은 실험실에서 중요한 기술적 문제되었습니다. 여기서 우리는 분리하고 culturing 마우스 폐 내피 세포 (MLECs)의 안정적이고 비교적 간단한 방법에 대한 단계별 절차를 제공합니다. 이 방법에서는 폐 조직은 6에서 얻은 - 오래된 새끼가 처음 collagenase / dispase (C / D) 솔루션과 함께 소화, 조각으로 절단 및 단일 세포 현탁액으로 기계적 분산됩니다 8 일 수 있습니다. MLECS은 자기 입자 농축기 (MPC)를 사용 Dynabeads에 복합 백신 PECAM - 1 항체와 긍정적인 선택을 사용하여 세포 현탁액에서 정화 수 있습니다. 그들이 합류되기 전까지는 이러한 정화 세포 (TC) 요리 젤라틴 코팅 조직 문화에 양식 있습니다. 그 시점에서, 세포는 더 이상 반 ICAM - 2 항체에 결합 Dynabeads를 사용하여 정화하고 있습니다. 이 프로토콜과 함께 얻은 MLECs는 위상 대비 가벼운 현미경에 의해 같은 시각 코블스톤 표현형을 전시, 그들의 내피 표현형는 안티 - VE - cadherin ⁸ 방지 VEGFR2 ⁹ 항체 및 VE - cadherin의 immunofluorescent 얼룩과 외과 분석을 사용하여 확인되었습니다. 우리 손에,이 두 단계 절연 절차는 지속적으로 안정 추가로 교양 수 MLECs의 순수한 인구를 산출. 이 방법은 연구자가 녹아웃 직접 격리 MLECs에서 수행 체외 실험에서 결과와 생체내 연구에 연관시키는 유전자 변형 생쥐의 증가를 활용하기 때문에 생체내에서 관찰 혈관 phenotypes의 분자 메커니즘을 공개하는 데 도움이있게됩니다.

프로토콜

1. 안티 PECAM - 1 항체 - 복합 자석 구슬을 준비 (Dynabeads)

1. BSA가 해소 때까지 소용돌이를 사용하여 50 ML PBS에서 50 MG BSA를 혼합하여 PBS에 0.​​1 % BSA를 준비합니다. 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 필터링하여 소독. 4 스토어 ° C.
2. TC 후드에서 1.5 ML Eppendorf 튜브에 잘 resuspended 양을 안티 쥐 IgG의 Dynabeads 200 μl를 전송하고 구슬을 씻으 : 마운트 튜브를 MPC와 퇴적물에 비즈를 허용하도록 약 1 분 앉아 보자. 뜨는 기음, MPC에서 튜브를 제거하고 멸균 0.1 % BSA / PBS 1 ML에있는 구슬을 resuspend. 구슬을 resuspend하기 위해 아래 피펫합니다.
3. 네 세척의 총 세 번 씻어 반복합니다.
4. MPC에서 튜브를 제거하고 0.1 % BSA / PBS 500 μl의 구슬을 resuspend.
5. 튜브 10 μl 쥐 방지 마우스 PECAM - 1 (CD - 31) 항체를 추가합니다.
6. 상온에서 추운 방 또는 2 시간에서 4 ° C에서 하룻밤 텀블.
7. 같은 단계 1.2 네 번에서 설명한 멸균 0.1 % BSA / PBS로 비즈를 씻으십시오.
8. MPC에서 튜브를 제거하고 200 μl 0.1 % BSA / PBS에있는 구슬을 resuspend. 4 스토어 방지 PECAM - 1 항체 - 복합 Dynabeads 최대 일개월하는 C.

2. 신생아 생쥐에서 분리 폐 내피 세포 마우스

전에 조직 정화 프로토콜과 함께 진행하는 프로 시저의 IACUC위원회의 승인이 필요합니다.

1. 다음 사항을 준비 :
   • DMEM 1 MG / ML C / D 솔루션 15 ML. 37 필터 따뜻한 0.22 μm의 주사기와 필터 ° C.
   • 50 ML 원뿔 튜브 15 ML DMEM, 얼음에 저장과
   • DMEM에 최고 20 % FBS 및 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함한 절연 미디어 (IM)
   • 젤라틴 2%. 4 100 ML DD 물, 압력솥 15 분 저장 ° C.와 소 피부 2g는 ​​젤라틴 믹스 37 따뜻한 ° C 코팅 TC의 flasks 전에 녹일 수 있습니다.
2. 케타민을 (100 MG / kg)과 xylazine (10 MG / kg)의 IP 주사로 3 6~8일 오래된 새끼를 마취. 다음과 같이 마취의 효과를 확인하고 동물 하나씩 해부하다 : 보드에 핀 새끼는 멸균 해부 가위로 가슴 영역에서 피부를 70 % 에탄올로 피부를 흡수하고 제거합니다. 폐가 노출 엑사이스 갈빗대.
3. 무균 엑사이스 개별 폐 엽 (叶), 조심하는 것은 기관지와 폐 주변에 보이는 결합 조직을 해부하다하지. 얼음처럼 차가운 DMEM의 모든 폐를 결합합니다. 새끼를 안락사.
4. TC 후드에서 근무 DMEM, 100mm TC 요리의 장소에서 폐 엽 (叶)을 제거하고 여분의 DMEM을 대기음.
5. 멸균 가위를 사용하여 ~ 100 번 절단하여 가늘게 조직을 말하다. 효소 소화 15 ML 따뜻한 C / D 솔루션에 전송합니다. 회전에서 37 ° C에서 45 분 알을 품다.
6. TC 후드에서 단일 세포 현탁액에 14g​​ 정맥 붙어 씹다 대단히 짧은 시간, 최소한 12 시간을 20 ML의 주사기로 들어가서 소화 조직 현탁액을 대기음.
7. 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 조직 현탁액을 통과하고 소화를 중지 15 ML 메신저로 스트레이너 씻으십시오.
8. 5 분 400x g에서 원심 분리하여 펠렛의 세포 현탁액.
9. 3 ML 0.1 % BSA / PBS에 대기음 뜨는 및 resuspend 펠릿.
10. 5 ML 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 22.5 μl 방지 PECAM - 1 항체 - 복합 Dynabeads를 추가합니다. 12분에 대한 실온에서 텀블.
11. 코트 2 ML 2퍼센트 젤라틴과 젤라틴 대기음 초과와 T75 플라스크. 이전 도금 세포 ~ 30 분 정도에 대한 TC 후드 내부 건조 젤라틴 수 있습니다.
12. 비드 배양이 완료되면 (단계 2.10) 세 Eppendorf 튜브에 동일 세포 현탁액을 분할하여 MPC에 탑재합니다.
13. 구슬은 MPC를 (~ 1 분)를 사용하여 sedimented있을 때, 뜨는 수집 MPC에서 튜브를 제거와 구슬을 씻어 ~ 1 ML 0.1 % BSA / PBS 다음 MPC를 탑재.
14. 네번 (총 5 세척)을 씻어 반복
15. EnGS - MV 생활 요인 Kit 및 관 당 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (VL)와 VascuLife 1 ML에 Resuspend 구슬이 잘 혼합.
16. 미리 코팅 T75 플라스크에 플레이트와 VL 10 ML 각 플라스크 총 볼륨을 가지고.
17. 미디어에게 다음날을 변경, 성장의 한 하루를 허용하고 다른 모든 일 미디어의 절반을 변경합니다. 세포 (보통 문화의 3~4일 후)> 70-80% 합류 이상의 경우, 그들은 반 ICAM - 2 Dynabeads와 함께 정렬할 수 있습니다.

3. 준비 방지 ICAM - 2 항체 - 복합 Dynabeads

1. 안티 ICAM - 2 항체 - 복합 Dynabeads가 추가 합류 때까지 반 PECAM - 1 Dynabeads 항체 - 복합과 교양과 선택되어 세포를 정화하는 데 사용됩니다. 이 절차는 그 반대 마우스 ICAM - 2 (CD - 102)가 항체가 백신 PECAM - 1 항체 대신 사용 제외하고, 안티 PECAM - 1 항체 - 복합 Dynabeads (1 위)에 대한 설명으로 수행됩니다.
2. 안티 ICAM - 2 항체 - 복합 Dynabeads는 ° C 최대 4 저장할 수 있습니다일개월 수 있습니다.

4. 안티 ICAM - 2 Dynabeads와 마우스 폐 내피 세포 정렬

1. 2퍼센트 젤라틴과 코트 T75 조직 문화 플라스크.
2. 세포와 합류 T75 술병에서 미디어를 대기음 8 ML PBS로 세척.
3. 대기음 PBS, 2 ML 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가하고 (5 분) 세포가 분리하자. 분리 원조로 가볍게 flasks을 누릅니다.
4. 세포가 분리되면 남아있는 자기편 세포를 분리하는 트립신과 다쳤고, 세포를 억제 2 ML IM를 추가합니다. 15 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 400x G.에서 5 분 스핀 다운
5. 2 ML 0.1 % BSA / PBS에있는 미디어 및 resuspend 세포 펠렛을 대기음.
6. 5 ML의 폴리스티렌 왕복 아래 튜브로 환승 10 μl 방지 ICAM - 2 Dynabeads를 추가합니다. RT 12 분 텀블.
7. MPC 두 1.5 ML Eppendorf 튜브 및 마운트에 세포 현탁액을 분할.
8. 구슬 한 분만 준수 후에 뜨는을 대기음. MPC에서 튜브를 제거하고 1 ML 0.1 % BSA / PBS에 각 튜브를 resuspend. MPC에 리마운트.
9. 네 번 (5 씻어 총) 씻어 반복합니다.
10. 1 ML VL 각 튜브를 Resuspend 및 셀 개수를 수행합니다.
11. T25 플라스크 및 / 또는 T75 플라스크 당 750K - 1000000 세포 당 250 350K 전지에서 플레이트 세포.
12. T25 flasks 5 ML의 VL, 그리고 T75 flasks 10 ML에 볼륨을 가져와.
13. 매일 미디어를 변경합니다. 문화가 보통 2~3일에 약 80 % confluency에 도달하면 세포는 실험을 위해 사용될 수 있습니다.

5. 대표 결과

일반적으로 세포의 초기 준비 6-7일 후, 우리는 1.2에 대해 얻을 수 있습니다 - 셋 6~8일 오래된 새끼에서 1.5 X 10 ⁶ 폐 내피 세포는. 세포는 빛을 현미경 아래에 전형적인 "조약돌"형태를 표시하고 내피 세포 (그림 1)에 대한 특징입니다 VE - cadherin (CD144) 세포 세포 분기점에서 얼룩을 보여줍니다. MLECs 표현 VE - cadherin과 VEGFR2의 대부분은 외과 분석 (그림 2)에서 보여주었다. 보통, 우리는 초기 MLEC 격리 이후 두 주 이내에 실험에 사용합니다.

그림 1. 합류 MLEC의 monolayer의 미세 분석. (A) 라이트 현미경 이미지는 내피 세포에 대한 전형적인 교양 세포의 조약돌 형태를 보여줍니다. 많은 세포의 perinuclear 지역에 위치하고 균일한 원형 구조는 MLEC 절연에 사용되는 자성 비즈입니다. (B) 내피 특정 VE - cadherin은 같은 공촛점 현미경을 사용하여 표시된 셀 전지 분기점에서화된입니다. 바 20μm의 대표입니다.

그림 2 내피 특정 마커에 대한 특정 항체로 분류 교양 MLECs의 외과 분석 :. phycoerythrin - 복합 이차 항체 다음 VE - cadherin (CD144) 또는 VEGFR2로 기소, 절연 MLECs의 내피 신원을 확인합니다. 레드 라인 isotype 특정 컨트롤을 나타냅니다, 녹색 라인은 나타냅니다 방지 VE - cadherin 또는 방지 VEGFR2 - 특정 - IgG.

토론

Microvascular 항법은 혈관 생물학의 여러 분야에서 유용한 모델로 입증하고 널리 공부 HUVECs ^세 이상 (예 : angiogenesis) 공부에 더 생리학 관련성이 높은 것으로하고 있습니다. 이전, 그것은 microvascular 내장 컴퓨터가 신장, 심장, 피부, 망막, 뇌, gliomas, 지방 조직뿐만 아니라 폐 ^{2, 4-7, 10, 11에서} 구할 수있는 것으로보고되었습니다. 그러나, microvascular 내장 컴퓨터의 격리에 대한 일관성 있고 신뢰할 수있는 방법은 여전히​​ 필요합니다. 여기에 제시 절차는 이전에 게시된 프로토콜 ^2의 수정이며 그것이 새끼 대신 성인 동물을 사용하는 대부분의 출판 절차와는 다릅니다. 어린 동물에서 세포가 높은 확산 가능성을 가지고 자신의 조직에서 파생된 문화가 세포의 높은 숫자를 얻을하는 경향으로 이것은 절연 성공을 위해 매우 중요합니다. 일주일 오래된 동물 최적으로 보이지만, 어린 생쥐 (하루 지난 4)도 사용할 수 있습니다. 우리는 하나 펍에서 MLECs를 분리에 성공으로도, 새끼의 높거나 낮은 숫자는 필요한 경우 사용할 수 있습니다. 그러나, 격리 프로세스를 확장 또는 아래 반면, 세포 도금 밀도는 또한 세포 증식에​​ 중요로 변경되어 있어야합니다. 안티 PECAM - 1 최초로 복합 자기 구슬을 사용하여 MLECs 및 방지 ICAM - 2 항체보다 2 단계 정화 과정은 앞에서 설명한 단일 단계 정화 절차를보다 순수한 EC 문화를 얻는에 훨씬 효율적입니다. 이 프로토콜은 매우 힘드는 매뉴얼 기술, 기울기 원심 분리 및 섬유아 세포, 혈액 세포 및 평활근 세포로 폐기 오염 전지 정렬 덜 효율적인 외과를 사용할 필요가 없습니다. 그 결과 MLEC 인구는 angiogenic 반응, 혈관 투과성 및 백혈구 윤회의 체외 분석, 치료뿐만 아니라 신호 경로의 생화 학적 분석을 상처를 사용할 수 있습니다. 필요한 경우, MLECs 그러한 횡단 내피 저항 (터) 측정 immunofluorescence 또는 전극 어레이에 대한 fibronectin이나 젤라틴 코팅 coverslips 등 다양한 표면에 도금 수 있습니다. 얻은 결과는 직접 녹아웃 및 유전자 변형 마우스 라인의 증가의 맥락에서 특히 중요합니다 생체내에서 관찰 phenotypes 비교할 수 있습니다. 생체내에서 관찰된 결함을 기본 세포 구조의 체외 분석에이 방법의 성공적인 구현은 이미 ^12를 발표했습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spring scissors	Fine Science Tools	15032-13
forceps	Fine Science Tools	11223-20
14G cannula	Fisher Scientific	1482516N
20 ml syringe	BD Biosciences	309661
BSA	Sigma-Aldrich	A7030-100G
anti-rat IgG Dynabeads	Invitrogen	110.35
Magnetic Particle Concentrator (MPC)	Invitrogen	123-21D
anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31)	BD Biosciences	553369
anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102)	BD Biosciences	553326
Collagenase/Dispase (C/D)	Roche Group	11097113001	100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C
DMEM	Cellgro	10-013-CV
Bovine Skin Gelatin	Sigma-Aldrich	#G9391-100G
Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL)	Lifeline Cell Technology	LL0004
0.05% Trypsin/EDTA	Mediatech, Inc.	25-052-CI
Cell strainer 70 μm nylon	Falcon BD	352350
tissue culture flask 75 cm2	Techno Plastic Products	90076