Un test basé sur Matrigel Tube Formation d'évaluer l'activité Vasculogenic de cellules tumorales

Résumé

Un essai de formation de tube est utilisé pour évaluer l'activité vasculaire des cellules tumorales.

Résumé

Au cours des dernières décennies, un essai de formation de tube en utilisant le facteur de croissance réduite Matrigel a été typiquement employées pour démontrer l'activité angiogénique des cellules endothéliales vasculaires in vitro, ^1-5. Toutefois, les preuves de plus en plus récemment, a montré que ce test n'est pas limité à tester le comportement des cellules endothéliales vasculaires. Au lieu de cela, il a également été utilisé pour tester la capacité d'un certain nombre de cellules tumorales pour développer un phénotype vasculaire ^6-8. Cette capacité est compatible avec leur comportement vasculogenic identifiés chez des animaux xenotransplanted, un processus connu sous le nom vasculogenic mimétisme (VM) ^9. Il ya une multitude de preuves démontrant que des cellules tumorales à médiation VM joue un rôle vital dans le développement tumoral, indépendant de l'angiogénèse des cellules endothéliales ^{6, 10-13.} Par exemple, les cellules tumorales ont été trouvés à participer dans le sang perfusé, la formation de canaux vasculaires dans des échantillons de tissus provenant de patients atteints de mélanome et le glioblastome ^{8, 10, 11.} Ici, nous avons décrit ce test réseau tubulaire comme un outil utile dans l'évaluation de l'activité vasculogenic des cellules tumorales. Nous avons constaté que certaines lignées cellulaires tumorales, comme le mélanome B16F1 cellules, les cellules de glioblastome U87, et le cancer du sein MDA-MB-435 cellules sont capables de former des tubules vasculaires, mais certains n'ont pas, comme le cancer du côlon cellules HCT116. Par ailleurs, ce phénotype vasculaire est dépendante du nombre de cellules plaquées sur le Matrigel. Par conséquent, ce test peut servir utilitaire puissant pour dépister le potentiel vasculaire d'une variété de types cellulaires incluant les cellules vasculaires, les cellules tumorales ainsi que d'autres cellules.

Protocole

1. Un test basé sur Matrigel Tube Formation d'évaluer l'activité Vasculogenic de cellules tumorales

1. Préparation des cellules tumorales et les cellules endothéliales microvasculaires: les cellules tumorales du cerveau telles que les cellules U87, les cellules de mélanome B16F1, le cancer du sein MDA-MB-435, et les cellules du côlon HCT116 ont été cultivées dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS et pénicilline / streptomycine (tous d'Invitrogen ). Cellules endothéliales microvasculaires humaines en ligne les cellules endothéliales (HMVECs) ont été cultivées dans EBM2 moyennes (Lonza) supplémenté avec 1 ug / ml d'hydrocortisone et 1 ng / ml de facteur de croissance épidermique, 10% de FBS et pénicilline / streptomycine. Les cellules ont été lavées avec du PBS à trois reprises et détaché avec 0,05% de trypsine / EDTA (Invitrogen). Après centrifugation à 2000 rpm pendant 5 min, culots de cellules ont été lavées à nouveau avec du PBS. Ensuite, le culot cellulaire ont été comptés avec un hémocytomètre.
2. Préparation de Matrigel: Une aliquote de facteur de croissance réduite de Matrigel (BD Bioscience) a été réchauffé à la température ambiante. Avant de complètement dégelé, il a été transféré sur la glace et son liquide a été maintenu sur la glace pendant au moins 10 min. Ensuite, 50 ul de Matrigel a été plaqué au plaques de 96 puits à un niveau horizontal qui permet le Matrigel à répartir uniformément, et incubées pendant 30 min à 37 ° C.
3. La formation du tube: Cellules (1-2 x 10 ⁴⁾ ont été re-suspendu avec DMEM sans sérum pour les cellules tumorales ou EBM-2 pour les cellules endothéliales, et chargé sur le haut de la Matrigel. Si ce test a été utilisé pour mesurer les effets de certains agents sur le développement des tubules, ces agents (stimulateurs ou inhibiteurs) ont été ajoutés dans le milieu sans sérum. Chaque groupe conditionnelle contenue 4-6 puits.
4. Image et analyse de données: Après incubation à 37 ° C pendant la nuit, chaque puits a été analysée directement sous un microscope. Si les tubules étaient nécessaires pour la fixation, 100 ul de formol à 10% de solution saline solution a été ajoutée en douceur et dix minutes plus tard, il était prêt pour l'analyse. Sous un microscope à contraste de phase 10x, tubules dans chaque domaine ont été imagées et une moyenne de 3 à 5 tubules champs aléatoires dans chaque puits a été compté.

2. Les résultats représentatifs:

HMVECs ont été utilisées comme contrôle positif, étant donné que ces tubules ont été développés à partir claires corps cellulaires allongées qui se connectent au réseau sous forme de polygones. Cellules B16F1, U87, et MDA-MB-435 développé tubules vasculaires semblables à ceux formés par HMVECs, mais cellules HCT116 n'a pas (figure 1). Une cellule de formation du tube dose-dépendante a été testé dans les cellules U87. Comme le montre la figure 2, 10000 cellules formées tubules abandonnées. Une fois les cellules ont été doublés, un solide réseau vasculaire est comparable à ceux observés dans HMVECs. En revanche, les cellules de moins de 5000 a échoué à former un phénotype vasculaire.

Figure 1. Formation de tubes induite par HMVECs, U87, MDA-MB-435, et cellules B16F1, mais pas les cellules HCT116. Toutes les cellules (2 x 10 ⁴⁾ ont été chargés sur Matrigel et incubées pendant la nuit. Tubules ont été imagées en utilisant le contraste de phase. HMVECs ont été utilisées comme contrôle positif. Un représentant de 3-5 champs a été montré. Bar: 100 um.

Figure 2. U87 cellulaire induite par les tubules dans un certain nombre cellulaire dépendante manière. Nombres différents de cellules U87, comme indiqué dans les coins ont été utilisés pour la formation du tube. HMVECs ont été utilisés pour un contrôle positif. Bar: 100 mm.

Discussion

Pour ce test pour réussir, la qualité de Matrigel devrait être testée en premier. Un petit échantillon peut être obtenu à partir de BD Bioscience pour pré-lancer le test en utilisant HMVECs. Produits de lots différents peuvent afficher des qualités dissemblables dans lesquelles certains lots ne fournissent pas une condition optimale pour la formation du tube. Deuxièmement, toutes les bulles doivent être évitées lors d'une aliquote de Matrigel est chargé dans des plaques 96 puits, parce que les bulles ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue
DMEM	Invitrogen	11995
FBS	Invitrogen	16000-044
Le facteur de croissance réduite Matrigel	BD Bioscience	47743-720
EBM2 kit	Lonza	CC-3156
Microscope Nikon Eclipse TS100	Nikon