Un Matrigel-Based Formazione Assay tubo per valutare l'attività vascolare delle cellule tumorali

Riepilogo

Un test formazione del tubo viene usato per valutare l'attività vascolare delle cellule tumorali.

Abstract

Nel corso degli ultimi decenni, un saggio di formazione del tubo utilizzando il fattore di crescita-è stato ridotto Matrigel tipicamente impiegato per dimostrare l'attività angiogenica delle cellule dell'endotelio vascolare in vitro ^1-5. Tuttavia, l'evidenza di recente crescita ha dimostrato che questo saggio non si limita a testare il comportamento per le cellule endoteliali vascolari. Invece, è stato anche utilizzato per testare la capacità di un certo numero di cellule tumorali di sviluppare un fenotipo vascolare ^6-8. Questa capacità è stata coerente con il loro comportamento vascolare identificato in animali xenotransplanted, un processo noto come mimetismo vascolare (VM) ^9. C'è una moltitudine di prove che dimostrano che cellule tumorali mediata VM svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo del tumore, indipendentemente angiogenesi delle cellule endoteliali ^{6, 10-13.} Per esempio, le cellule tumorali sono stati trovati a partecipare al perfuso sangue, la formazione di canali vascolari in campioni di tessuto da pazienti affetti da melanoma e glioblastoma ^{8, 10, 11.} Qui, abbiamo descritto questa analisi tubolare rete come uno strumento utile nella valutazione dell'attività vascolare delle cellule tumorali. Abbiamo scoperto che alcune linee cellulari tumorali come il melanoma B16F1 cellule, le cellule di glioblastoma U87, e il cancro al seno MDA-MB-435 cellule sono in grado di formare tubuli vascolare, ma alcuni non lo fanno come il cancro del colon HCT116 cellule. Inoltre, questo fenotipo vascolare dipende dal numero di cellule placcato sul Matrigel. Pertanto, questo test può servire come potente utility per lo screening del potenziale vascolare di una varietà di tipi cellulari tra cui le cellule vascolari, le cellule tumorali oltre che altre cellule.

Protocollo

1. Un Matrigel-Based Formazione Assay tubo per valutare l'attività vascolare delle cellule tumorali

1. Preparazione delle cellule tumorali e cellule endoteliali: le cellule tumorali del cervello, come le cellule U87, B16F1 cellule di melanoma, cancro al seno MDA-MB-435, e le cellule del colon HCT116 sono state coltivate in DMEM supplementato con 10% FBS e la penicillina / streptomicina (tutti da Invitrogen ). Delle cellule endoteliali linea di cellule endoteliali microvascolari (HMVECs) sono state coltivate in EBM2 medio (Lonza) integrata con 1 mg / ml di idrocortisone e 1 ng / ml fattore di crescita epidermico, il 10% FBS e la penicillina / streptomicina. Le cellule sono state lavate con PBS per tre volte e distaccato con 0,05% tripsina / EDTA (Invitrogen). Dopo la centrifugazione con 2.000 rpm per 5 minuti, pellet cellulari sono stati lavati di nuovo con PBS. Poi, le cellule pellet sono stati contati con un emocitometro.
2. Preparazione Matrigel: Una frazione del fattore di crescita ridotto Matrigel (BD Bioscience) è stato riscaldato a temperatura ambiente. Prima di tutto scongelati, è stato trasferito su ghiaccio e il suo liquido è stato tenuto in ghiaccio per almeno 10 min. Di 50 ml di Matrigel è stato placcato da piastre a 96 pozzetti a livello orizzontale che permette al Matrigel per distribuire uniformemente, e incubate per 30 minuti a 37 ° C.
3. Formazione del tubo: Cells (1-2 x 10 ⁴⁾ sono stati nuovamente sospesi con DMEM senza siero per le cellule tumorali o EBM-2 per le cellule endoteliali, e caricate sulla parte superiore del Matrigel. Se questo test è stato utilizzato per misurare gli effetti di alcuni agenti di sviluppo tubulo, questi agenti (stimolatori o inibitori) sono stati aggiunti al mezzo privo di siero. Ogni gruppo condizionale contenute 4-6 pozzi.
4. Immagini e analisi dei dati: A seguito di incubazione a 37 ° C durante la notte, ogni pozzetto è stato analizzato direttamente al microscopio. Se tubuli erano necessari per la fissazione, 100 ml di formalina al 10% salina a base di soluzione è stata gentilmente aggiunto e dieci minuti dopo, era pronta per l'analisi. Sotto un microscopio con contrasto di fase 10x, tubuli in ogni campo sono stati immaginati e una media di tubuli 3-5 campi aleatori in ogni pozzetto è stato contato.

2. Rappresentante dei risultati:

HMVECs sono stati usati come controllo positivo, in quanto tali tubuli sono stati sviluppati da chiare corpi cellulari allungati che si connettono alla rete forma poligonale. Cellule B16F1, U87, e MDA-MB-435 sviluppato tubuli vascolari simili a quelle formate da HMVECs, ma HCT116 cellule non (Figura 1). Una cellula dose-dipendente formazione del tubo è stato testato in U87 cellule. Come dimostrato nella figura 2, 10.000 cellule formano tubuli interrotto. Una volta che le cellule sono state raddoppiate, una solida rete vascolare era paragonabile a quelli osservati in HMVECs. Al contrario, le cellule meno di 5.000 non è riuscito a formare un fenotipo vascolare.

Figura 1. Metropolitana di formazione indotta da HMVECs, U87, MDA-MB-435, e B16F1 cellule, ma non HCT116 cellule. Tutte le cellule (2 x 10 ⁴⁾ sono stati caricati su Matrigel e incubate durante la notte. Tubuli erano ripreso con contrasto di fase. HMVECs sono stati usati come controllo positivo. Un rappresentante di 3-5 campi è stato mostrato. Bar: 100 micron.

Figura 2. U87 cellulare indotta tubuli in un numero dipendente dalla cellula modo. U87 diverso numero di cellule, come indicato negli angoli sono stati utilizzati per la formazione del tubo. HMVECs sono stati utilizzati per un controllo positivo. Bar: 100 mm.

Discussione

Perché questo test per avere successo, la qualità del Matrigel deve essere testato prima. Un piccolo campione possono essere ottenute presso Bioscience BD per pre-eseguire il test utilizzando HMVECs. Prodotti lotti diversi possono visualizzare qualità dissimili in cui alcuni lotti non forniscono una condizione ottimale per la formazione del tubo. In secondo luogo, tutte le bolle dovrebbe essere evitato quando un'aliquota del Matrigel viene caricato in piastre a 96 pozzetti, perché le bolle possono interrompere l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
DMEM	Invitrogen	11995
FBS	Invitrogen	16000-044
Fattore di crescita ridotto Matrigel	BD Bioscience	47743-720
EBM2 kit	Lonza	CC-3156
Nikon ECLIPSE TS100 microscopio	Nikon