Матригель основе труб Формирование Пробирной для оценки Vasculogenic активность опухоли

Резюме

Анализ трубки образование используется для оценки сосудистой активности опухолевых клеток.

Аннотация

За последние несколько десятилетий, анализ трубки формирование использованием фактора роста снижается Матригель был обычно используются для демонстрации ангиогенных деятельности сосудистых эндотелиальных клеток в пробирке ^1-5. Однако в последнее время все больше доказательств показал, что этот анализ не ограничивается тест сосудистой поведение для эндотелиальных клеток. Вместо этого, он также был использован для тестирования способности количество опухолевых клеток развивать сосудистой фенотипа ^6-8. Эта возможность была в соответствии с их vasculogenic поведения, определенные в xenotransplanted животных, процесс, известный как vasculogenic мимикрии (VM) ^9. Существует множество доказательств, свидетельствующих о том, что опухоли клеточный В. М. играет жизненно важную роль в развитии опухоли, независимо от ангиогенеза эндотелиальные ячейки ^{6, 10-13.} Например, опухолевые клетки были обнаружены на участие в крови перфузии, сосудистые образования канала в образцах тканей от меланомы и глиобластомы пациентов ^{8, 10, 11.} Здесь мы описали это трубчатые анализа сети в качестве полезного инструмента в оценке vasculogenic активности опухолевых клеток. Мы обнаружили, что некоторые линии опухолевых клеток, таких как меланома B16F1 клеток глиобластомы U87 клеток, и рак молочной железы MDA-MB-435 клетки способны образовывать сосудистой канальцев, но некоторые не такие, как рак толстой кишки HCT116 клеток. Кроме того, это сосудистые фенотип зависит от числа клеток высевали на Матригель. Таким образом, этот анализ может служить мощная утилита для скрининга сосудистых потенциал различных типов клеток, включая клетки сосудистых, опухолевых клеток, а также другие клетки.

протокол

1. Матригель основе труб Формирование Пробирной для оценки Vasculogenic активность опухоли

1. Подготовка опухолевые клетки и клетки эндотелия капилляров: опухоль головного мозга клетки, такие как U87 клеток, клетки меланомы B16F1, рак молочной железы MDA-MB-435 и толстой кишки клетки HCT116 выращивали в DMEM с добавлением 10% ЭТС и пенициллина / стрептомицина (все из Invitrogen ). Эндотелиальная клеточной линии человеческих клеток эндотелия капилляров (HMVECs) культивировали в EBM2 среды (Lonza) с добавлением 1 мкг / мл гидрокортизона и 1 нг / мл эпидермального фактора роста, 10% ЭТС и пенициллина / стрептомицина. Клетки промывали PBS в три раза и апартаменты с 0,05% трипсин / ЭДТА (Invitrogen). После центрифугирования при 2000 оборотов в минуту в течение 5 мин, сотовые гранулы промывали снова с PBS. Затем осаждали клетки подсчитывали с гемоцитометра.
2. Матригель подготовки: аликвоту фактор роста снижается Матригель (BD Bioscience) нагревали до комнатной температуры. Прежде чем полностью оттаять, оно было передано на лед и жидкий находился на льду в течение не менее 10 мин. Затем 50 мкл Матригель высевали в 96-луночных на горизонтальном уровне, что позволяет Матригель распространять равномерно, и инкубировали 30 мин при 37 ° C.
3. Труба образование: Ячейки (1-2 х 10 ⁴⁾ были вновь приостановлены с бессывороточной DMEM для опухолевых клеток или ДМ-2 для эндотелиальных клеток, и загружены на вершине Матригель. Если этого анализа был использован для измерения воздействия некоторых агентов на трубочку развития, эти средства (стимуляторы или ингибиторы) были добавлены к бессывороточной среды. Каждая условная группа, содержащаяся 4-6 скважин.
4. Изображение и анализ данных: После инкубации при температуре 37 ° С в течение ночи, каждый также был проанализирован непосредственно под микроскопом. Если канальцы были необходимы для фиксации, 100 мкл 10%-ного формалина солевой решение на базе мягко добавил и десять минут спустя, он был готов для анализа. Под микроскопом с 10-кратным фазового контраста, канальцы в каждой области были обследованы и в среднем от 3-5 канальцев случайных полей в каждой лунке подсчитывали.

2. Представитель Результаты:

HMVECs были использованы в качестве положительного контроля, так как эти канальцы были разработаны на основе ясно удлиненных тел ячейки, которые подключаются к форме многоугольника сети. B16F1, U87, и MDA-MB-435 разработан клетки сосудистой трубочки, аналогичные образована HMVECs, но HCT116 клетки не (рис. 1). Клетка дозозависимое трубки образование было испытано в U87 клеток. Как показано на рисунке 2, 10000 ячеек, образованных прекращено канальцев. Как только клетки в два раза, твердых сосудистая сеть была сопоставима с тем, которые наблюдаются в HMVECs. В противоположность этому, клетки менее 5000 не смогли сформировать сосудистой фенотипа.

Рисунок 1. Труба образованию индуцированных HMVECs, U87, MDA-MB-435, а B16F1 клеток, но не HCT116 клеток. Все клетки (2 х 10 ⁴⁾ были погружены на Матригель и инкубировали в течение ночи. Трубочки были обследованы использованием фазового контраста. HMVECs были использованы в качестве положительного контроля. Представитель 3-5 полей было показано. Бар: 100 мкм.

Рисунок 2. U87 ячейки вызванных канальцев в число клеток-зависимым образом. Различное число U87 клетки, как указано в углах были использованы для трубки образования. HMVECs были использованы для положительного контроля. Бар: 100 мм.

Обсуждение

Для того чтобы этот анализ, чтобы преуспеть, качество Матригель должны быть проверены в первую очередь. Маленький образец может быть получен из BD Bioscience предварительного запуска методом с использованием HMVECs. Различные продукты партия может появиться разнородных качеств, в которых неко...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
DMEM	Invitrogen	11995
FBS	Invitrogen	16000-044
Фактор роста снижается Матригель	BD Bioscience	47743-720
EBM2 комплект	Lonza	CC-3156
Nikon Eclipse TS100 микроскопом	Nikon