Un dosage quantitatif de l'insuline exprimer formant colonie Progéniteurs

Résumé

Un test en trois dimensions qui permet clonogénique pancréatique comme géniteurs à se différencier en insuline exprimer colonies est décrite. Cette méthode tire parti des milieux semi-solides contenant des facteurs de la méthylcellulose, Matrigel et la croissance, dans lequel seule progéniteurs prolifèrent et se différencient In vitro, Qui permet la quantification du nombre de progéniteurs fonctionnelle dans une population.

Résumé

Le domaine de souches pancréatiques et la biologie de cellules progénitrices ont été entravés par un manque d'essais in vitro fonctionnelles et quantitatives qui permettent l'analyse de la cellule unique. Analyses des progéniteurs simples sont d'une importance cruciale car elles fournissent des moyens définitive à démontrer sans équivoque le potentiel lignée des progéniteurs individuels. Bien que les méthodes ont été conçues pour générer des «pancreatospheres" en culture en suspension de cellules uniques, plusieurs limitations existent. Premièrement, il est temps pour réaliser le dépôt cellule unique pour un grand nombre de cellules qui, à son tour les commandes de gros volumes de milieux de culture et de l'espace. Deuxièmement, la numération de l'pancreatospheres qui en résulte est une main-d'œuvre, surtout lorsque la fréquence des progéniteurs pancreatosphere-initiation est faible. Troisièmement, le dosage pancreatosphere n'est pas une méthode efficace pour permettre à la fois la prolifération et la différenciation des progéniteurs du pancréas dans la même culture et, à nouveaustricting l'utilité du dosage.

Pour surmonter ces limitations, un dosage de milieux semi-solides pour la colonie basée progéniteurs pancréatiques a été élaboré et est présentée dans ce rapport. Cette méthode tire parti d'un concept existant à partir du dosage de colonies hématopoïétiques, dans lequel la méthylcellulose est utilisé pour fournir viscosité pour les médias, permettant les cellules progénitrices de rester dans un espace tridimensionnel car ils subissent la prolifération ainsi que la différenciation. Pour enrichir l'insuline exprimant formant colonie progéniteurs d'une population hétérogène, nous avons utilisé les cellules qui expriment Neurogenin (NGN) 3, un pancréas endocrine de cellules progénitrices marqueur. Murin souches embryonnaires (ES) dérivés de cellules Ngn3 cellules exprimant taggés avec le journaliste améliorée protéine fluorescente verte ont été triés et autant que 25 000 cellules par puits ont été étalées dans peu d'attachement des boîtes de culture de 24 puits. Chaque puits contenait 500 ul de milieux semi-solides avec les principaux éléments suivants: a rencontréhylcellulose, Matrigel, la nicotinamide, Exendin-4, activine ßB, et des milieux conditionnés provenant murines ES dérivées de cellules pancréatiques, comme des cellules. Après 8 à 12 jours de culture, de l'insuline exprimant colonies ayant une morphologie distinctive ont été formés et pourrait encore être analysés pour l'expression des gènes du pancréas en utilisant RT-PCR quantitative et coloration immunoflourescent pour déterminer la composition lignée de chaque colonie.

En résumé, notre analyse permet de détecter facilement la colonie et la quantification des progéniteurs fonctionnelle au sein d'une population hétérogène de cellules. En outre, le format de milieux semi-solides permet une présentation uniforme des composants de la matrice extracellulaire et les facteurs de croissance pour les cellules, permettant progéniteurs à proliférer et à se différencier in vitro. Ce test fournit la colonie des opportunités uniques pour des études mécanistiques des cellules progénitrices du pancréas au niveau de la cellule unique.

Protocole

1. La différenciation des cellules ES murines au pancréas-comme les cellules in vitro de générer des milieux conditionnés (CM) pour le dosage de la colonie

Procédures pour l'entretien de cellules murines ES, le corps embryoïdes (EB) la formation en culture en suspension, et la culture attache une différenciation plus poussée ont été décrits précédemment ^1-3 et ne sont pas l'objet du présent rapport. Une présentation schématique des étapes impliquées dans notre protocole de différenciation est montré dans la figure 1.

Afin d'obtenir de haute qualité des milieux conditionnés, il est important de d'abord générer de 6 jours anciens EBS dans laquelle au moins 30-40% d'entre eux sont d'un diamètre d'au moins 150 um. Plus l'EBS doit contenir des taches sombres sous le microscope à lumière, suggérant une différenciation accrue (figure 2). Sélection de haute qualité sérum de veau foetal (FCS) est essentiel pour générer un tel EBS. De haute qualité beaucoup FCS sont choisis en fonction de leur capacité à soutenir le differentiations d'EBS vers l'insuline 1, glucagon et d'expression du gène d'amylase 2A dans les étapes ultérieures (jours 18-20) détectés par RT-PCR. Par ailleurs, lorsque le jour-6 EBS sont transférées de la culture en suspension à la culture de fixation (environ 80 à 100 EB par puits dans 6 assiettes bien) il est important de tourner doucement les plaques de recueillir l'EBS jours-6 dans le centre du puits. Pour des raisons inconnues, les manœuvres qui améliorent les contacts cellule-cellule entraîner un meilleur développement du pancréas cellules ressemblant à des EBS dans l'étape de culture de fixation ultérieure.

1. Sur 13 jours de culture, de remplacer le milieu de culture d'attachement (DMEM/F-12 (1:1), le remplacement KO 15% de sérum, 2 mM de L-glutamine, 50 U / ml de pénicilline, 50 pg / ml de streptomycine) avec la culture d'attachement frais nicotinamide médias mM containing10, 0,1 nM Exendin-4, et 10 ng / mL humaine recombinante activine SSB (toutes les concentrations sont finales).
2. Sur 16 jours de culture, de recueillir les médias de l'étape 1.1 et la filtrer à travers une épaisseur de 0,2 um polyéthersmembranes ulfone. De ce point en avant les médias recueillies seront appelés milieux conditionnés (CM). Aliquoter le CM en 15 tubes Falcon ml et stocker à -80 ° C jusqu'au moment de la culture semi-solide (voir la section 3 ci-dessous).

2. Obtention du pancréas-comme progéniteurs dans la suspension cellulaire unique en utilisant un trieur de cellules activé par fluorescence

Un knock-in en ligne de cellules murines ES, ⁴ désignés comme Ngn3-EGFP, où le gène rapporteur EGFP remplacé un allèle du locus Ngn3 a été différenciée comme décrit précédemment. Ngn3 ² est un facteur de transcription de base hélice-boucle-hélice (bHLH) contenant . exprimée par les progéniteurs endocrines pancréatiques au cours du développement Jour ^5-16 cultures ont été triés pour obtenir normalement différenciés Ngn3-EGFP ⁺ et Ngn3-EGFP ^-. cellules ^1,2

1. La dissociation des cellules différenciées en une suspension cellulaire unique.
   1. Incuber jour-16 cultures wie 0,25% de trypsine-EDTA (3 min, 37 ° C) pour déloger les cellules à partir des puits de culture.
   2. Ajouter 10% de SVF pour arrêter l'activité trypsine.
   3. Laver les cellules avec du magnésium et du calcium sans tampon phosphate salin (PBS) contenant 0,1% d'albumine sérique bovine (BSA), et centrifuger à 300 xg pendant 5 min.
   4. Enlever le surnageant et incuber les cellules avec des touffes de 4 mg / ml de collagénase B et 2000 U / ml désoxyribonucléase (DNase) I (30 min, 37 ° C) pour produire une suspension cellulaire unique. Utiliser une pipette 1000 uL de perturber les culots cellulaires toutes les 10 min de hâter le processus de dissociation.
   5. Laver les cellules avec du PBS contenant 0,1% de BSA, et centrifuger à 300 xg pendant 5 min.
   6. Enlever le surnageant et remettre les cellules en PBS contenant 0,1% de BSA.
2. Préparation des cellules pour le tri.
   1. Ajouter 2 ul de DNase I (1 MU / ml) pour chaque ml de suspension cellulaire afin de prévenir réagrégation de cellules lors du tri.
   2. Passez la suspension cellulaire unique à travers un de 40 m à 70 umesh à éliminer les agrégats à grandes cellules.
   3. Ajouter DAPI (1 pg / ml de concentration finale) de la suspension cellulaire unique.
   4. Acquérir des données de cytométrie en flux sur un trieur de cellules. Une trieuse de cellules MoFlo MLS (Beckman Coulter) a été utilisée pour ce rapport.
   5. Elimination des populations de cellules pour le tri. Ngn3-EGFP ⁺ et Ngn3-EGFP ^- les cellules sont déclenchées d'abord avec diffusion vers l'avant par rapport à diffusion latérale (figure 3A), suivie par DAPI vs diffusion latérale (figure 3B), largeur d'impulsion vs diffusion latérale (figure 3C), et enfin FL1 vs auto-fluorescence (figure 3D). La porte de tri final des Ngn3-EGFP ⁺ cellules est intentionnellement déplacée vers la droite (figure 3E; flèche) afin de limiter la contamination des Ngn3-EGFP ^- cellules au cours de tri. Pour gating contrôle négatif, soit le jour-6 EB à partir Ngn3-EGFP lignée ES ou le même stade, le jour-16 de la culture d'une lignée non transgénique, telles que TL1 cellules ES (figure 3D, panneau de gauche), peuvent être utilisés.
3. Trier Ngn3-EGFP ⁺ et Ngn3-EGFP ^{- cellules.}

3. Placage cellules triées pour la culture semi-solide

1. Préparation de Matrigel.
   1. Aliquoter le Matrigel à 1 ml par tube et conserver à -20 ° C avant utilisation.
   2. Aliquotes congelés doivent être placés à 4 ° C la glace la nuit ou pendant 3 heures à dégeler juste avant l'utilisation. Aliquotes décongelées doivent demeurer sur la glace pendant la préparation de la culture semi-solide pour éviter de re-solidification.
2. Solution de méthylcellulose (3,3%) de préparation.
   Poudre de méthylcellulose peut pas être autoclavés. Afin d'obtenir une solution de méthylcellulose exempte de bactéries, l'utilisation propre des bateaux de pesage et de barreaux d'agitation autoclavés, béchers, fioles et autres matériels au cours du processus de préparation.
   1. Un jour avant la préparation de la solution de méthylcellulose, magasin de 200 ml de l'eau distillée stérile doubles à 4 ° C. Aussi, préparer 500 ml de 2x DMEM/F12 médias (préparer en dissolvant poudre DMEM / F-12 en doublé d'eau distillée) contenant 100 U / ml de pénicilline et100 pg / mL de streptomycine et conserver à 4 ° C.
   2. Le jour de la préparation de méthylcellulose, ajouter 500 ml d'eau distillée stérile double pour un bécher de 1000 ml en verre avec un morceau de papier d'aluminium sur le dessus. Faire bouillir pendant au moins 30 min pour débarrasser l'eau des bulles d'air.
   3. Placer un barreau de grande taille (au moins 3 pouces de longueur) dans une fiole en verre 2000 ml.
   4. Mesurer 300 ml d'eau bouillante et de le transférer dans le ballon.
   5. Placer le ballon sur une plaque d'agitation (sans chauffage). Verser l'eau chaude pour éviter de générer des bulles d'air.
   6. Peser 33 g de poudre de méthylcellulose et très lentement de l'ajouter à l'eau chaude. L'eau chaude est nécessaire de mouiller la poudre de méthylcellulose et l'aide efficace de la dissolution subséquente de la température froide.
   7. Continuez à remuer la poudre jusqu'à ce que la température est réduite à environ 40-45 ° C.
   8. Ajoutez les 200 ml d'eau stérile froide distillée deux fois au mélange de méthylcellulose de refroidissement. Immédiatementaprès, vous devriez commencer à voir la solution tour transparente et visqueuse, ce qui indique que la méthylcellulose se dissout dans la phase aqueuse. Swirl main le ballon à s'assurer que la solution est bien mélangée.
   9. Ajoutez les 500 ml froide 2x DMEM/F12 médias. Continuer à tourbillonner à la main pour mélanger.
   10. Placer le ballon sur une plaque d'agitation dans une chambre froide et remuez lentement la solution de méthylcellulose pendant 24-48 heures.
   11. Aliquoter la solution dans 125 ml par bouteille de stockage, et stocker à -20 ° C. Un échantillon doit être distribué dans une PetriDish stériles et placés dans des incubateurs à 37 ° C au test de stérilité. Solution de méthylcellulose décongelés peuvent être conservés au réfrigérateur pour un maximum de 2 mois.
3. Conditionné préparation des milieux.
   CM dégel (voir section 1) juste avant l'utilisation. Gardez la CM sur la glace durant la préparation de la culture semi-solide.
4. Préparer les facteurs de croissance suivants: 1,0 M nicotinamide, 0,1 uM Exendin-4, 10 pg / mL humaine recombinante activine ßB, et 10 & mu, g / ml de VEGF-A. Stocker le nicotinamide et Exendin-4 à -20 ° C et l'activine ßB et le VEGF-A à -80 ° C, et les décongeler immédiatement avant utilisation. Tous les milieux semi-solides de culture composants doivent être conservés sur la glace pendant le placage. Il est à noter que l'ajout de VEGF-A a été trouvé plus tard n'est pas nécessaire pour la formation de colonies ^2.
5. Préparation de sérum de veau foetal. FCS devrait être inactivé par la chaleur avant utilisation. Incuber la FCS pendant 30 minutes à 56 ° C dans un bain d'eau pour inactiver les protéines du complément. Si la bouteille stock initial FCS détient plus de 500 ml on aliquote dans des flacons 125 ml. L'augmentation de la surface assurera le chauffage, même et approfondie de l'ensemble du volume. Laisser les bouteilles refroidir à température ambiante pendant au moins 1 heure avant de stocker à -20 ° C. FCS est décongelé 0,2 um filtrée avant utilisation.
6. Mélanger les composants culture avec des cellules triées.
   Gardez les cellules et tous les composants semi-solide des médias sur la glace pendant la préparation, à tout moment pour éviter la solidification duMatrigel. Toutes les fournitures qui entrent en contact avec notamment Matrigel, embouts de pipette, des seringues et des aiguilles, doivent être froids. Placez ces fournitures à -20 ° C au moins une demi-heure avant utilisation.
   1. Déterminer la quantité de cellules à ensemencer par puits dans une plaque à 24 puits. Jusqu'à 25 000 cellules peuvent être plaquées par 24 puits. On pourrait effectuer une titration de la densité cellulaire dans les premières expériences pour déterminer le nombre de semis optimale des cellules.
   2. Ajoutez les composants de la culture dans un tube de 5 ml en polystyrène avec un capuchon pression dans la séquence décrite dans le tableau 1 (à noter que les cellules sont ajoutés en dernier pour éviter la stimulation prématurée). Ajouter la méthylcellulose 3,3% dans les tubes en polystyrène première et la dernière cellules triées. Notez que la solution de méthylcellulose 3,3% doit être établi et ajouté aux tubes en polystyrène avec une aiguille de calibre 16 ½ et une seringue convenablement marqués graduée. En général, afin de mesurer correctement le volume de solutions visqueuses, telles que la méthylcellulose 3,3% Solution et le mélange de culture final, il est important d'aspirer une solution dans la seringue en premier, puis immédiatement repousser la solution hors d'expulser l'air. La solution de méthylcellulose 3,3% peut être ramené à température ambiante si elle est trop difficile de tirer. Cependant, s'assurer qu'il est refroidi sur la glace après avoir été distribué dans des tubes en polystyrène et avant l'ajout de Matrigel.
7. Assiette des médias semi-solide contenant des cellules triées.
   1. Après s'être assuré les bouchons des tubes de polystyrène sont bien en place, serrer des tubes par les mains vigoureusement et de manière approfondie. Les bulles d'air seront générés au cours de ce processus.
   2. Placer les tubes sur la glace pendant 5 min ou jusqu'à ce que les bulles d'air de petite surface.
   3. Utiliser une seringue de 1 ml avec un 16 ½ ou 18 ½ aiguille de calibre pour aspirer le contenu. Suivez les conseils de 3.6.2 pour attirer le volume exact de solution visqueuse sans air dans les seringues.
   4. Lentement Distribuer 500 uL des médias dans chaque 24 puits. Utilisezl'attachement à faible plaques à 24 puits seulement. Ajouter le support directement au centre du puits. Les milieux semi-solides seront automatiquement répartis dans les puits. Pour chaque échantillon expérimental, des puits quadruplicated sont couramment utilisés en vue d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Seuls les 4 colonnes intime d'une orientation horizontale de 24 puits de plaques sont utilisées pour la culture. Remplir les puits restants avec de l'eau stérile pour l'aide d'humidification de la culture cellulaire contenant.
   5. Incuber les cellules à 37 ° C et CO ₂ 5% de l'air.
   6. Retard addition de facteurs de croissance. Il est possible d'ajouter des facteurs de croissance après l'initiation de la culture. De telles manœuvres peuvent être utilisés pour lutter contre les effets survie de certains facteurs de croissance. Des solutions de facteur de croissance jusqu'à 100 pi par puits peut être dégoutté par une seringue de 1 ml avec un G 26 3 / 8 aiguille et a permis de diffuser dans les médias semi-solide.

4. Observer la formation de colonies sous les micros de lumièreface

Les cellules doivent être observés immédiatement après le placage de s'assurer que des cellules individuelles sont aléatoirement et uniformément répartis dans le puits. Si la plupart des cellules ou des colonies qui en résultent sont distribués à la marge du puits, cela indique que la distribution de la presse semi-solide dans le puits était trop énergique (voir section 3.7.4). En raison de la densité des colonies du ménisque effet à la marge du puits de culture peuvent être plus élevés comparés à ceux résidant dans le centre.

1. La quantification nombre de colonies. Grâce à la fonction 3-dimensionnelle des médias, les colonies apparaissent à différents points focaux. Ainsi, un ajustement de l'orientation pour chaque colonie peut être nécessaire lors de l'observation en microscopie optique. Fixez une grille sous le 24 et lors du comptage, afin d'éviter l'enregistrement de la colonie de deux fois la même. Une grille peut être obtenue en coupant le mur d'une PetriDish NUNC (Cat. No.169558). Un objectif 10x sur un microscope à lumière doit être utilisé pour obsErve et de compter les colonies.

5. Les résultats représentatifs:

Des expériences antérieures avaient montré que démarrant à 2,5 x 10 ⁵ cellules murines ES R1 (dans les médias de 50 ml au total) on peut s'attendre à générer environ 5000 taille appropriée jours-6 EBS. Les cellules ES Ngn3-EGFP ont été moins efficaces, les cellules 4 fois plus ont été nécessaires pour générer de taille semblable EBS par jour 6. Parce que 25 jours-6 EB contiennent une moyenne de 1,88 ± 0,67 x 10 ⁵ cellules, ¹ environ 37,6 x 10 ⁶ cellules peuvent être obtenues à partir de 5000 EBS. Pendant la culture d'attachement des cellules sont attendus pour étendre 2,72 ± 0,32 fois. ¹ Ainsi, 5000 jours-6 EbS rendement d'environ 100 x 10 ⁶ jours-16 cellules avant le tri. Après gating, les cellules Ngn3-EGFP ⁺ représenteront environ 10% de la population totale-16 jours de cellule (section 2.2.5 et du texte du Protocole figure 3).

Exemple de la photomicrogrAPHS d'insuline exprimant colonies dérivées de cellules ES murines est montré dans la figure 4. Ces colonies ont une morphologie distinctive; petit (~ 60 à 100 um) colonies rondes avec des cellules individuelles dans les colonies qui sont petites, sombres, et non la lumière réfléchie. Dans notre précédente publication, ^deux temps réel RT-PCR et double coloration par immunofluorescence des colonies individuellement cueillies à la main a révélé l'expression de l'insuline, de peptide-C et le glucagon. Ces résultats démontrent la capacité des simples Ngn3-EGFP ⁺ cellules à se différencier en cellules contenant au moins deux hormones îlot simultanément, ressemblant primitive de la première vague, comme les cellules endocrines.

Le dosage de la colonie pour les cellules dispersées unique permet l'étude de ces progéniteurs qui ont la capacité d'initier la prolifération et la différenciation in vitro (figure 5). Ainsi, c'est un test qui permet de mesurer la fonction intrinsèque des cellules progénitrices individuels. Les progéniteurs qui ont le capabilité de devenir insulino-exprimant les colonies sont appelées insuline exprimer unités formant colonie (ICFUs) (figure 5). Conformément à l'idée que les cellules progénitrices Ngn3 marques endocrines du pancréas en développement, ⁵ Ngn3-EGFP ^+, mais pas Ngn3-EGFP ^-. Cellules dérivées de cellules MES populations sont enrichis pour la ICFUs ² Toutefois, la fréquence de ces progéniteurs est encore faible; environ 0,1% à 0,6% du total Ngn3-EGFP ⁺ population isolée de 16 jours de culture sont ^deux ICFUs en soit, une nette différence dans l'efficacité formant colonie est prévu, avec Ngn3-EGFP ⁺ cellules les plus élevés, suivis par le. cellules pré-triés, puis l'Ngn3-EGFP ^- cellules.

Figure 1. Chronologie des tests in vitro des cellules ES différenciation pancréatique, comme les cellules murines. Pour conditionnée médias (CM) génération, ES murines cells sont cultivées en suspension avec 15% de FCS pour les six premiers jours avec des doses décroissantes de monothioglycérol (6,0 x 10 ^-3 M pour les deux premiers jours et 6,0 x 10 ^-4 M pour les quatre jours suivants) pour générer EBS. Jour-6 EB (80-100 par puits) sont ensuite transférés à l'attachement à 6 puits plats contenant 15% de sérum de remplacement KO. 5% de FCS peut être ajoutée entre les jours 6-10 de la culture à hâter l'attachement de l'EBS. La nicotinamide, Exendin-4, et humaine recombinante activine ßB sont ensuite ajoutés aux médias le 13 jours de culture (voir section 1.1). Les médias sont collectées sur 16 jours de culture et à ce stade est devenu un milieu conditionné. Jour 16 cellules sont ensuite triées et étalées dans les médias semi-solide pour le dosage de la colonie.

Figure 2. Photomicrographie représentant des grands organismes de jours-6 embryoïdes dérivés des cellules souches embryonnaires murines. Idéal jours-6 EBS sont au moins 150 um de diamètrecentres ETER et ont assombri (flèches). Expression de marqueurs début progénitrices du pancréas (comme PDX-1 et Sox9) est renforcée dans ces ^trois EBS (données non présentées).

Figure 3. Tri portes pour MES dérivés de cellules jours-16 Ngn3-EGFP cellules exprimant. (A) portes Forward Scatter et latéraux, indicatif de la taille des cellules et la granularité, respectivement, d'éliminer les débris cellulaires non. (B) DAPI est utilisé pour identifier les cellules mortes, qui sera une coloration positive lorsqu'il est excité à 405-413 nm et émission détectée avec un filtre à 450/40. (C) de largeur d'impulsion, la largeur de l'impulsion de diffusion vers l'avant électroniques, révèle doublets, qui devraient être éliminées avant d'être passé par le trieur de cellules activé par fluorescence. (D) Elimination des EGFP (canal FL1) par rapport à l'aide d'autofluorescence jour-16 cellules d'une lignée cellulaire de contrôle parental comme le TL1 (panneau de gauche) illumine la fluorescence et donc la vraie Ngn3-EGFP ^{population cellulaire + (panneau de droite). (E) La flèche rouge montre manuelle décalage vers la droite de la porte de l'EGFP + juste avant le tri pour augmenter la séparation des cellules faussement positives. Evénements dans les deux (D) et (E) sont déclenchés en fonction des régions (R1 - R3) montré dans (AC).}

Microphotographies représentant la figure 4. Exprimant de l'insuline dans les colonies semi-solide de la culture. Les colonies sont distribués de façon aléatoire et apparaissent comme des petits sombre, non-lumière pôles de réflexion. Des colonies individuelles peuvent ensuite être analysés pour l'expression des gènes et des protéines par RT-PCR et des analyses d'immunohistochimie, respectivement (non représentés; voir la vidéo).

Figure 5. Un dosage de la colonie qui permet des évaluations fonctionnelles et quantitative des cellules progénitrices unique. Numération des colonies qui en résulte est utilisé pour calculer la fréquence des cellules progénitrices chez les cellules totales plaqué. La composition de cellules dans chaque colonie est une indication du potentiel lignée de l'ancêtre d'initiation. L'utilisation de ce test, nous avons constaté que Ngn3-EGFP ⁺ des cellules dérivées de cellules souches embryonnaires murines ont été enrichis pour l'insuline exprimant unités formant colonie (ICFUs), les cellules progénitrices qui ont la capacité de se différencier en insuline exprimer colonies ^2.

Tableau 1. Milieux semi-solides de la culture et de composants ordre d'addition.

Discussion

Colony dosages qui permettent des évaluations quantitatives et fonctionnelles des progéniteurs pancréatiques individuels ont été limités jusqu'ici, ce qui a grandement entravé les progrès dans les études des souches pancréatiques et la biologie de cellules progénitrices. L'essence d'un dosage de la colonie, c'est qu'il mesure la capacité intrinsèque des cellules progénitrices, plutôt qu'uniquement de leur phénotype, permettant à la fonctionnalité et le potentiel lignée des cellules progénitrices d'être observé. Il est également un outil quantitatif qui peut déterminer le nombre de progéniteurs dans une population donnée. Dans le domaine des cellules souches hématopoïétiques, des dosages colonie ont joué un rôle important dans l'identification, ainsi que déchiffrer les exigences du facteur de croissance, des interactions et des mécanismes régissant l'engagement de la lignée de ces cellules. ⁶ Dans le domaine de la biologie des cellules pancréatiques progénitrices, ⁷ organes du pancréas ^{, 8} ou ^{9 à 13} en vrac cultures ont été imaginés, toutefois, de tels dosages biologiques ne traitent pas questions au niveau de la cellule unique. Sans analyses cellule unique, l'existence de souches pancréatiques multi-potentiels / progéniteurs ne peut être prouvé sans équivoque ^14.

Ici, nous montrons que l'insuline exprimant formant colonie progéniteurs peuvent être analysés en utilisant un modèle tridimensionnel, Matrigel contenant, système de culture semi-solide. Bien qu'un système de culture en suspension ^15,16 a été développé qui permet seule progéniteurs pancréatiques adultes à proliférer et se différencier en "pancreatospheres", notre test colonie offre des avantages supplémentaires. Premièrement, notre semi-solide culture médiatique système permet le placage de jusqu'à 25.000 cellules triées par 500 ul par les milieux de culture de 24 puits tout en maintenant la formation de colonies résultant de la gamme linéaire. ² En revanche, le dosage pancreatosphere suspension nécessite l'utilisation d'une seule méthode de dépôt de cellules de la trieuse de cellules pour permettre des analyses cellule unique, et donc un volume plus important de la culture médiatique et de l'espace incubateursont nécessaires. Par conséquent, notre analyse colonie est relativement facile et rentable d'effectuer lorsqu'un grand nombre de cellules différentes doivent être comparées simultanément à des activités progénitrices. Deuxièmement, notre semi-solide de médias permet une distribution uniforme des composants de la matrice extracellulaire et les facteurs de croissance, ce qui permet à la fois la prolifération et de différenciation de se produire dans le même puits. En revanche, il est plus difficile de fournir un tel environnement, en particulier la matrice, à des cellules en culture en suspension. Nous sommes conscients que notre méthode ne peut pas être définitivement prouvé que chaque colonie est dérivé d'une seule cellule, comme deux progéniteurs peuvent être positionnés au hasard près de l'autre et forment une colonie. Toutefois, ce problème peut être surmonté par une analyse secondaire en utilisant la manipulation seule cellule. Direct cueillette manuelle des cellules triées unique pourrait définitivement démontrer l'origine cellule unique de chaque colonie.

En résumé, l'insuline exprimant formant colonie activité de progéniteurs dans les milieux semi-solides décrite ici fournit des occasions uniques pour des études mécanistiques des progéniteurs pancréatiques au niveau cellulaire unique. Par exemple, dans un rapport antérieur, nous avons trouvé que l'ajout de Matrigel, un mélange brut de protéines de la matrice extracellulaire, dans la culture des médias est nécessaire pour la formation de l'insuline par les cellules exprimant colonies ⁺ Ngn3-EGFP, ² suggérant la matrice extracellulaire est important pour ceux progéniteurs. L'utilisation de ce test colonie, il sera désormais possible de disséquer et de définir les exigences spécifiques de matrice pour une telle activité. En plus d'étudier les progéniteurs des cellules dérivées de souches embryonnaires de souris, nous étudions actuellement si ce système de test in vitro soutient également la formation d'autres colonies distinctes provenant du pancréas et du foie de souris en périnatalité et pour adultes, ainsi que du tissu pancréatique humain cadavérique dénuée d'îlots.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matériel / Réactif	Société	Catalogue Nombre	Commentaires
1X DMEM / F-12 (01:01)	Mediatech	15 à 090-CV
Sérum de veau foetal	Tissue Culture Biologicals	201	Se reporter à la section 1.1
L-glutamine	Gibco	25030-081
1X PBS Dulbecco	Mediatech	21 à 031-CV
De sérum bovin Albumine	Sigma	A8412	7,5%
Matrigel	Becton Dickinson	356231	Croissance réduite Facteur
Méthylcellulose	Sinetsu Chimique, Tokyo, Japon		1500 centipoises (Haute viscosity)
Nicotinamide	Sigma	N0636
Homme Recombinant Activine ßB	R & D Systems	659-AB-025
Exendin-4	Sigma	E7144
Homme Recombinant Le VEGF-A	R & D Systems	293-VE-010
Plaques à 24 puits	Costar	3473	Ultra-faible Pièce jointe
60mm boîte de Pétri avec grille	Nunc	169558