Un dosaggio quantitativo di insulina che esprimono formante colonia Progenitori

Riepilogo

Un tridimensionale test clonogenica che permette pancreatico-come progenitori di differenziarsi in insulino-colonie che esprimono è descritto. Questo metodo si avvale di semi-solidi supporti contenenti fattori di metilcellulosa, Matrigel e di crescita, in cui progenitori singolo proliferare e differenziarsi In vitro, Permettendo la quantificazione del numero di cellule progenitrici funzionale in una popolazione.

Abstract

Il campo di staminali pancreatiche e biologia delle cellule progenitrici è stata ostacolata dalla mancanza di test in vitro funzionali e quantitativi che consentono l'analisi della singola cellula. Le analisi di singoli progenitori sono di importanza fondamentale in quanto forniscono modi definitiva per dimostrare in modo inequivocabile il potenziale stirpe dei progenitori individuali. Anche se i metodi sono stati studiati per generare "pancreatospheres" nella cultura sospensione da singole cellule, esistono diverse limitazioni. In primo luogo, è tempo per eseguire la deposizione singola cellula per un gran numero di cellule, che a sua volta comandi di grandi volumi di terreni di coltura e dello spazio. In secondo luogo, numerazione delle pancreatospheres risultante è alta intensità di lavoro, specialmente quando la frequenza del pancreatosphere-inizio progenitori è bassa. In terzo luogo, il test pancreatosphere non è un metodo efficace per consentire sia la proliferazione e la differenziazione di cellule progenitrici del pancreas nella stessa cultura e, ristricting l'utilità del test.

Per superare queste limitazioni, un semi-solido saggio colonia dei media based per progenitori del pancreas è stato sviluppato e viene presentato in questo rapporto. Questo metodo si avvale di un concetto esistente dal saggio colonia ematopoietiche, in cui viene utilizzato metilcellulosa per fornire ai media viscosità, permettendo alle cellule progenitrici di soggiornare in uno spazio tridimensionale che subiscono la proliferazione e differenziazione. Per arricchire l'insulina che esprimono formanti colonia progenitori da una popolazione eterogenea, abbiamo utilizzato le cellule che esprimono neurogenina (NGN) 3, un marcatore del pancreas endocrino delle cellule progenitrici. Staminali di embrioni murini (ES) derivati ​​dalle cellule Ngn3 cellule che esprimono taggati con la maggiore giornalista proteina fluorescente verde sono stati ordinati e ben 25.000 cellule per pozzetto sono stati placcati in basso attaccamento 24-bene i piatti della cultura. Ogni pozzetto conteneva 500 microlitri di semi-solido dei media con i seguenti componenti principali: ha incontratohylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activina βB e mezzo condizionato raccolti da topo ES derivati ​​dalle cellule pancreatiche-come le cellule. Dopo 8 a 12 giorni di cultura, insulino-esprimendo le colonie con morfologia distintivi sono formati e potrebbe essere ulteriormente analizzati per l'espressione del gene del pancreas con RT-PCR quantitativa e colorazione immunoflourescent per determinare la composizione lignaggio di ogni colonia.

In sintesi, il nostro saggio colonia permette la facile individuazione e quantificazione dei progenitori funzionale all'interno di una popolazione eterogenea di cellule. Inoltre, il semi-solido formato multimediale permette di presentazione uniforme dei componenti della matrice extracellulare e fattori di crescita per le cellule, permettendo progenitori di proliferare e differenziarsi in vitro. Questo test colonia offre opportunità uniche per gli studi meccanicistici delle cellule progenitrici del pancreas a livello di singola cellula.

Protocollo

1. Differenziazione delle cellule staminali embrionali murine per pancreatico-come le cellule in vitro per generare i media condizionati (CM) per il dosaggio colonia

Procedure per il mantenimento delle cellule staminali murine, embrionali corpo (EB) la formazione della cultura della sospensione, e la cultura attacco per ulteriore differenziazione sono state precedentemente descritte ^1-3 e non sono il focus di questa relazione. Una presentazione schematica delle fasi coinvolte nel nostro protocollo di differenziazione è mostrato in Figura 1.

Al fine di ottenere i media condizionata di alta qualità, è importante per generare primi 6 giorni di età EBS in cui almeno il 30-40% di loro sono con un diametro di almeno 150 micron. Il più grande EB dovrebbe contenere macchie scure sotto il microscopio ottico, il che suggerisce una maggiore differenziazione (Figura 2). Selezione di alta qualità siero di vitello fetale (FCS) è fondamentale per generare tale EBS. Di alta qualità lotti FCS sono selezionati in base alla loro capacità di sostenere la differentiationi di EB verso insulina 1, il glucagone e l'espressione del gene 2A amilasi nelle fasi successive (giorno 18-20), come rilevato da analisi RT-PCR. Inoltre, quando il giorno-6 EBS sono trasferiti da cultura a cultura sospensione attacco (circa 80-100 EB per pozzetto in 6 piastre) è importante per ruotare delicatamente per raccogliere i piatti del giorno-6 EB al centro dei pozzetti. Per ragioni sconosciute, manovre che aumentano la cellula-cellula contatti sfociano in un migliore sviluppo del pancreas-come le cellule da EB nella fase successiva cultura attaccamento.

1. Il giorno di cultura 13, sostituire il supporto allegato cultura (DMEM/F-12 (1:1), la sostituzione ad eliminazione diretta il 15% di siero, 2 mM L-glutammina, 50 U / mL penicillina, 50 mg / mL streptomicina) con la cultura attacco fresco mezzi di comunicazione containing10 nicotinamide mM, 0,1 nM exendin-4 e 10 ng / mL umano ricombinante activina SSB (tutte le concentrazioni sono definitive).
2. Il giorno di cultura 16, raccogliere i mezzi di comunicazione dal punto 1.1 e filtrarlo attraverso un 0,2 micron polieteriulfone membrana. Da questo punto in avanti i media raccolti saranno denominati mezzi condizionati (CM). Aliquota del CM in tubi Falcon da 15 ml e conservarlo a -80 ° C fino a poco prima di semi-solida cultura (vedi sezione 3).

2. Ottenere pancreatico-come progenitori in sospensione singola cella utilizzando un sorter fluorescenza cellula attivata

Un knock-in linea di cellule staminali murine, ⁴ designati come Ngn3-EGFP, in cui il gene reporter EGFP sostituito un allele del locus Ngn3 è stato differenziato come descritto in precedenza. Ngn3 ² è una base elica-loop-elica (bHLH) contenente fattore di trascrizione . espressa da progenitori endocrini del pancreas durante lo sviluppo ^{di 5} giorni-16 culture erano normalmente ordinati per ottenere differenziati Ngn3-EGFP ⁺ e Ngn3-EGFP ^-. cellule ^1,2

1. Dissociazione di cellule differenziate in una sospensione singola cella.
   1. Incubare giorni-16 wi culture° 0,25% tripsina-EDTA (3 min, 37 ° C) per rimuovere le cellule dai pozzi cultura.
   2. Aggiungere il 10% FCS per fermare le attività tripsina.
   3. Lavare le cellule con magnesio e calcio senza tampone fosfato salino (PBS) contenente 0,1% di sieroalbumina bovina (BSA), e centrifugare a 300 xg per 5 min.
   4. Rimuovere il surnatante e incubare le macchie cella con 4 mg / ml collagenasi B e 2000 U / mL deossiribonucleasi (DNasi) I (30 min, 37 ° C) per produrre una sospensione singola cella. Utilizzare una pipetta 1000 microlitri di disturbare il pellet cellulare ogni 10 minuti per accelerare il processo di dissociazione.
   5. Lavare le cellule con PBS contenente 0,1% di BSA, e centrifugare a 300 xg per 5 min.
   6. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in PBS contenente 0,1% BSA.
2. Preparazione delle cellule per l'ordinamento.
   1. Aggiungere 2 microlitri DNasi I (1 mU / mL) per ogni ml di sospensione cellulare per evitare riaggregazione delle cellule durante l'ordinamento.
   2. Passare la sospensione singola cellula attraverso un m 40-70 micronESH per rimuovere aggregati a grandi cellule.
   3. Aggiungi DAPI (1 mg / ml concentrazione finale) alla sospensione singola cella.
   4. Acquisire dati citometria a flusso su un cell sorter. Un MoFlo MLS (Beckman Coulter) cell sorter è stato utilizzato per questo rapporto.
   5. Gating di popolazioni di cellule per l'ordinamento. Ngn3-EGFP ⁺ e Ngn3-EGFP ^- cellule sono gated primo con dispersione in avanti rispetto a scatter laterale (Figura 3A), seguita da DAPI vs dispersione laterale (Figura 3B), larghezza di impulso vs dispersione laterale (Figura 3C), e infine FL1 vs auto-fluorescenza (Figura 3D). Il cancello sorta di finale Ngn3-EGFP ⁺ cellule è intenzionalmente spostata a destra (Figura 3E; freccia) in modo da limitare la contaminazione dei Ngn3-EGFP ^- cellule durante l'ordinamento. Per gating controllo negativo, sia di giorno-6 da EB Ngn3-EGFP linea ES o la stessa fase, giorno-16 da una cultura non-transgenici linea, come le cellule ES TL1 (Figura 3D, pannello di sinistra), può essere utilizzato.
3. Ordina Ngn3-EGFP ⁺ e Ngn3-EGFP ^{- cellule.}

3. Cellule placcatura ordinati per semi-solida cultura

1. Matrigel preparazione.
   1. Aliquota del Matrigel a 1 ml per tubo e conservare a -20 ° C prima dell'uso.
   2. Aliquote congelato deve essere posto a 4 ° C il ghiaccio durante la notte o per 3 ore per scongelare solo prima dell'uso. Aliquote scongelati devono rimanere sul ghiaccio durante la semi-solida preparazione culturale per evitare risolidificazione.
2. Metilcellulosa soluzione (3,3%) di preparazione.
   Polvere di metilcellulosa non possono essere sterilizzati in autoclave. Al fine di ottenere i batteri senza soluzione di metilcellulosa, l'uso pulito imbarcazioni pesatura e bar mescolare in autoclave, bicchieri, flaconi e altri componenti hardware durante il processo di preparazione.
   1. Un giorno prima della preparazione della soluzione di metilcellulosa, memorizzare 200 ml di acqua sterile bidistillata a 4 ° C. Inoltre, preparare 500 ml di 2x DMEM/F12 media (preparare sciogliendo polvere DMEM / F-12 in raddoppiato acqua distillata) contenente 100 U / mL penicillina e100 mg / ml streptomicina e conservare a 4 ° C.
   2. Il giorno della preparazione metilcellulosa, aggiungere 500 ml di acqua sterile bidistillata in un recipiente di vetro 1000 ml con un pezzo di foglio di alluminio sulla parte superiore. Far bollire per almeno 30 minuti per liberare l'acqua di bolle d'aria.
   3. Posto un grande bar scalpore imprese (almeno 3 cm di lunghezza) in un pallone da 2000 ml in vetro.
   4. Misurare 300 ml di acqua bollente e trasferirlo al pallone.
   5. Porre il pallone su un piatto mescolare (senza riscaldamento). Mescolare lentamente l'acqua calda per evitare di generare bolle d'aria.
   6. Pesano 33 grammi di polvere di metilcellulosa e molto lentamente aggiungere l'acqua calda. L'acqua calda è necessario bagnare la polvere di metilcellulosa in modo efficiente e di aiuto allo scioglimento conseguente freddo.
   7. Continuare a mescolare la polvere fino a quando la temperatura è ridotta a circa 40-45 ° C.
   8. Aggiungere i 200 ml di acqua fredda sterile bidistillata alla miscela metilcellulosa raffreddamento. Immediatamentedopo, si dovrebbe cominciare a vedere la soluzione volta trasparente e viscoso, indicando che metilcellulosa si sta dissolvendo in fase acquosa. Turbolenza mano il pallone per assicurare la soluzione è accuratamente mescolato.
   9. Aggiungere i 500 ml freddo 2x DMEM/F12 media. Continuare a turbolenza a mano per mescolare.
   10. Porre il pallone su un piatto mescolate in una stanza fredda, e mescolare lentamente la soluzione di metilcellulosa per 24-48 ore.
   11. Aliquota della soluzione in 125 ml per bottiglia di stoccaggio, e conservare a -20 ° C. Un campione deve essere erogato in una petridish sterile e posto in 37 ° C incubatore per testare la sterilità. Soluzione di metilcellulosa scongelato può essere conservato in frigorifero per un massimo di 2 mesi.
3. Condizionato la preparazione dei media.
   CM disgelo (vedi sezione 1) al momento dell'uso. Tenere il CM su ghiaccio in tutto semi-solida preparazione culturale.
4. Preparare i seguenti fattori di crescita: 1,0 M nicotinamide, 0,1 mM exendin-4, 10 mcg / ml umana ricombinante activina βB, e 10 & mu, g / mL di VEGF-A. Conservare il nicotinamide e exendin-4 a -20 ° C e activina βB e VEGF-A a -80 ° C, e scongelare immediatamente prima dell'uso. Tutte le semi-solido terreno di coltura componenti devono essere tenuti in ghiaccio durante la placcatura. Va notato che l'aggiunta di VEGF-A è stata successivamente trovata non è necessario per la formazione di colonie ^2.
5. Vitello preparazione siero fetale. FCS deve essere inattivato con il calore prima dell'uso. Incubare la FCS per 30 minuti a 56 ° C a bagnomaria per inattivare proteine ​​del complemento. Se la prima bottiglia magazzino FCS detiene più di 500 aliquote mL in 125 ml. La superficie maggiore assicurerà il riscaldamento uniforme e completo dell'intero volume. Lasciare le bottiglie raffreddare a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima di riporre a -20 ° C. Scongelati FCS è 0.2μm filtrata prima dell'uso.
6. Miscelare i componenti della cultura con cellule ordinati.
   Mantenere le cellule e tutti i semi-solidi componenti multimediali su ghiaccio durante la preparazione in ogni momento per impedire la solidificazione delMatrigel. Tutte le forniture che entrano in contatto con incluso Matrigel, puntali per pipette, siringhe e aghi, devono essere freddi. Luogo tali forniture a -20 ° C almeno mezz'ora prima dell'uso.
   1. Determinare la quantità di cellule da seminare per bene in un 24-pozzetti. Fino a 25.000 cellule possono essere placcati per 24 pozzetti. Si potrebbe eseguire una titolazione della densità cellulare in esperimenti iniziali per determinare il numero ottimale di cellule semina.
   2. Aggiungere i componenti della cultura di un tubo di polistirolo 5 ml con tappo a scatto in sequenza descritta nella Tabella 1 (si noti che le cellule sono aggiunte negli ultimi per evitare il rapido stimolazione). Aggiungere la metilcellulosa 3,3% per i tubi in polistirolo prima e l'ultima in ordine cellule. Si noti che la soluzione di metilcellulosa 3,3% deve essere redatto e inserito i tubi in polistirolo con un ago calibro 16 ½ e una siringa graduata adeguatamente contrassegnati. In generale, al fine di misurare correttamente il volume di soluzioni viscose, come il 3,3% di metilcellulosa soldistribuzione pesi e la miscela di cultura finale, è importante per aspirare una soluzione nella siringa per prima, e poi subito a spingere fuori la soluzione per espellere l'aria. La soluzione di metilcellulosa 3,3% può essere portata a temperatura ambiente se è troppo difficile da tirar fuori. Tuttavia, assicurarsi che sia raffreddato sul ghiaccio dopo che è stato distribuito nei tubi in polistirolo e prima che l'aggiunta di Matrigel.
7. Piastra semi-solido supporti contenenti cellule ordinati.
   1. Dopo aver assicurato i tappi dei tubi in polistirolo sono saldamente in posizione, agitare i tubi con le mani vigorosamente e accuratamente. Le bolle d'aria saranno generati durante questo processo.
   2. Collocare le provette in ghiaccio per 5 minuti o finché la superficie piccole bolle d'aria.
   3. Utilizzare una siringa 1 ml con un ½ calibro 16 ½ o 18 ago per aspirare il contenuto. Segui i consigli in 3.6.2 per disegnare il volume esatto di soluzione viscosa senza aria in siringhe.
   4. Lentamente erogare 500 uL di media in ogni 24-bene. Usol'allegato 24-bassa e piatti unici. Aggiungere il supporto direttamente al centro del pozzo. Il semi-solido media saranno automaticamente distribuiti nei pozzetti. Per ogni campione sperimentale, i pozzi quadruplicata sono normalmente utilizzati per ottenere risultati statisticamente significativi. Solo il 4 colonne più interno di un orientamento orizzontale 24-pozzetti vengono utilizzati per la cultura. Riempire i pozzetti rimanenti con acqua sterile per aiutare l'umidificazione della cella contenente la cultura.
   5. Incubare le cellule a 37 ° C di CO ₂ e il 5% d'aria.
   6. Ritardato l'aggiunta di fattori di crescita. E 'possibile aggiungere fattori di crescita dopo l'inizio della cultura. Tali manovre possono essere utilizzati per affrontare gli effetti sopravvivenza di determinati fattori di crescita. Soluzioni di fattore di crescita fino a 100 ul per pozzetto possono essere gocciolato tramite una siringa da 1 ml con un 26 G 3 / 8 ago e il permesso di diffondere in semi-solido dei media.

4. Osservando la formazione di colonie sotto la micro lucefar fronte

Le cellule devono essere osservate subito dopo la placcatura per garantire che le singole cellule sono casualmente e distribuiti uniformemente in tutto il pozzetto. Se la maggior parte delle cellule o le colonie risultanti sono distribuite al margine dei pozzi, questo indicherà che l'erogazione della semi-solido dei media nei pozzi era troppo forte (vedi paragrafo 3.7.4). A causa della densità colonia effetto menisco ai margini dei pozzi cultura può essere più elevato rispetto a coloro che risiedono in centro.

1. Colony numero quantificazione. A causa della 3-dimensionale caratteristica dei media, le colonie apparirà in diversi punti focali. Così, un adeguamento del fuoco per ogni colonia può essere richiesto durante l'osservazione al microscopio ottico. Fissare una griglia sotto il 24-bene quando conta al fine di evitare la registrazione della colonia due volte lo stesso. Una griglia può essere ottenuta tagliando la parete di una petridish NUNC (Cat. No.169558). Una lente obiettivo 10x su un microscopio ottico dovrebbe essere usato per obsErve e contare le colonie.

5. Rappresentante dei risultati:

Precedenti esperimenti avevano dimostrato che a partire da 2,5 x 10 ⁵ cellule ES murine R1 (in 50 mL totale media) ci si potrebbe aspettare di generare circa 5000 dimensioni adeguate giorni-6 EBS. Il Ngn3-EGFP cellule staminali embrionali sono state meno efficienti; cellule 4 volte di più sono stati necessari per generare dimensioni simili EB di giorno 6. Perché 25 giorni-6 EB contengono una media di 1,88 ± 0,67 x 10 ⁵ cellule, ¹ di circa 37,6 x 10 ⁶ cellule possono essere ottenute da 5000 EBS. Durante cultura allegato le cellule si prevede di espandere 2,72 ± 0,32 volte. ¹ Così, 5000 giorni-6 EB produrrà circa 100 x 10 ⁶ giorno 16 celle prima della cernita. Dopo gating, il Ngn3-cellule EGFP ⁺ costituiranno circa il 10% della popolazione totale giorno-16 celle (sezione Testo Protocollo 2.2.5 e Figura 3).

Esempio di photomicrogrAPHS di insulina che esprimono colonie derivate da cellule staminali embrionali murine è mostrato in Figura 4. Queste colonie hanno una morfologia caratteristica, di piccole dimensioni (~ 60-100 micron) colonie rotonda con le singole cellule nelle colonie che sono piccoli, scuri e non riflettenti la luce. Nella nostra precedente pubblicazione, ² real-time RT-PCR e doppia colorazione di immunofluorescenza di colonie singolarmente a mano rivelata espressione di insulina, C-peptide e glucagone. Questi risultati dimostrano la capacità del singolo Ngn3-EGFP ⁺ cellule di differenziarsi in cellule che contengono almeno due ormoni isolotto contemporaneamente, simile primitivo prima ondata, come cellule endocrine.

Il test colonia per dispersi cellule unico permette ai progenitori di studio per coloro che hanno la capacità di avviare la proliferazione e la differenziazione in vitro (Figura 5). Quindi, questo è un test in grado di misurare la funzione intrinseca delle cellule progenitrici individuali. I progenitori che hanno la capabilità di diventare insulina che esprimono le colonie sono chiamati insulina che esprimono unità formanti colonia (ICFUs) (Figura 5). Coerente con l'idea che Ngn3 segna cellule progenitrici endocrine nel pancreas sviluppo, ⁵ Ngn3-EGFP ^+, ma non Ngn3-EGFP ^-. Cellule MES derivati ​​dalle cellule popolazioni sono arricchiti per il ICFUs ² Tuttavia, la frequenza di questi progenitori è ancora bassa, circa 0,1% al 0,6% del totale Ngn3-EGFP ⁺ popolazione isolata dal giorno 16 la cultura sono ICFUs ² Indipendentemente da ciò, una chiara differenza nel formanti colonie efficienza è previsto, con Ngn3-EGFP ⁺ celle il più alto, seguita da. cellule preordinati, e poi il Ngn3-EGFP ^- cellule.

Figura 1. Timeline di differenziazione in cellule ES murine in vitro di cellule simil-pancreatiche. Per condizionata media (CM) generazione, ES murine cells sono coltivate in sospensione con il 15% FCS per i primi sei giorni con dosi decrescenti di monotioglicerolo (6,0 x 10 m ^-3 per i primi due giorni e 6,0 x 10 ^{-4 m} per i successivi quattro giorni) per generare EBS. Giorno-6 EB (80-100 per pozzetto) sono quindi trasferite in allegato 6 e piatti contenente 15% siero sostituzione eliminazione diretta. 5% FCS possono essere aggiunti tra i giorni 6-10 di cultura per accelerare l'attaccamento di EBS. Nicotinamide, exendin-4 e umano ricombinante activina βB sono poi aggiunti i media il giorno di cultura 13 (vedi sezione 1.1). I media vengono raccolte il giorno 16 e cultura, a questo punto è diventato mezzi condizionati. Giorno 16 cellule vengono poi ordinati e placcato in semi-solido supporto per il dosaggio colonia.

Figura 2. Microfotografia rappresentante di grandi corpi giorni-6 embrionali derivate da cellule staminali embrionali murine. Ideale giorni-6 EBS sono almeno 150 micron di diametrocentri di diametro e hanno oscurato (frecce). Espressione di marcatori precoci progenitrici del pancreas (come PDX-1 e SOX9) è stato migliorato in questi EBS (dati non riportati) ^3.

Figura 3. Ordinamento cancelli per MES derivati ​​dalle cellule giorno-16-EGFP Ngn3 cellule che esprimono. (A) porte scatter in avanti e laterale, indicativo della dimensione della cella e la granularità rispettivamente, eliminare i detriti non cellulari. (B) DAPI viene utilizzato per identificare le cellule morte, che sarà macchiata positivo quando sono eccitati a 405-413 nm ed emissione rilevati con un filtro 450/40. (C) larghezza di impulso, la larghezza degli impulsi elettronici scatter in avanti, rivela doppietti, che deve essere eliminato prima di essere passato attraverso il selezionatore fluorescenza cellula attivata. (D) Soppressione dei EGFP (canale FL1) rispetto autofluorescenza mediante giorno 16 celle da una linea di cellule di controllo dei genitori come TL1 (pannello di sinistra) si illumina fluorescenza vero e quindi la Ngn3-EGFP ^{cell + popolazione (pannello di destra). (E) freccia rossa indica manuale destro spostamento del cancello EGFP + poco prima selezione per aumentare la separazione di cellule falsi positivi. Eventi a entrambi (D) e (E) sono gated in base alle regioni (R1 - R3) mostrato in (CA).}

Microfotografie Rappresentante Figura 4. Dell'insulina che esprimono colonie in semi-solida cultura. Le colonie sono distribuiti in modo casuale e appaiono come piccole scure, gruppi di riflessione non-luce. Singole colonie possono essere successivamente analizzati per l'espressione dei geni e delle proteine ​​mediante RT-PCR e analisi immunoistochimica, rispettivamente (non mostrato, vedi video).

Figura 5. Un test colonia che permette valutazioni funzionali e quantitativa delle cellule progenitrici singolo. Numerazione delle colonie risultante è usato per calcolare la frequenzauency delle cellule progenitrici tra le cellule totali placcato. La composizione di cellule all'interno di ogni colonia è indicativo del potenziale lignaggio del progenitore di apertura. Da questo test, abbiamo riscontrato che Ngn3-EGFP ⁺ cellule derivate da cellule staminali embrionali murine sono state arricchite di insulina che esprimono unità formanti colonia (ICFUs), le cellule progenitrici che hanno la capacità di differenziarsi in insulino-colonie che esprimono ^2.

Tabella 1. Semisolide Media Cultura Componenti e Ordine di aggiunta.

Discussione

Saggi di colonia che permettono una valutazione quantitativa e funzionale di cellule progenitrici del pancreas singoli sono stati limitati finora, che ha notevolmente ostacolato il progresso negli studi di staminali pancreatiche e biologia delle cellule progenitrici. L'essenza di una colonia è saggio che misura la capacità intrinseca delle cellule progenitrici, e non solo loro fenotipo, permettendo la funzionalità e le potenzialità lignaggio delle cellule progenitrici da osservare. E 'anche uno strumento quantitativo che può determinare il numero di progenitori in una data popolazione. Nel campo delle cellule staminali ematopoietiche, saggi di colonia hanno avuto un ruolo importante nella identificazione, così come decifrare i requisiti di fattori di crescita, interazioni e dei meccanismi che regolano l'impegno lignaggio di queste cellule. ⁶ Nel campo della biologia delle cellule progenitrici del pancreas, organo del pancreas ^{7 , 8} o alla rinfusa culture ^13/09 sono stati ideati, tuttavia, tali dosaggi non affrontano biologico Questi,ons a livello di singola cellula. Senza analisi di singola cellula, l'esistenza di multi-potenzialità staminali pancreatiche / progenitori non può essere dimostrata in modo inequivocabile. ¹⁴

Qui mostriamo che l'insulina che esprimono formanti colonia progenitori possono essere analizzati utilizzando una tridimensionale, Matrigel contenenti semi-solido sistema di coltura. Anche se un sistema di coltura sospensione ^15,16 è stata sviluppata che permette singolo progenitori pancreatici adulti di proliferare e differenziarsi in "pancreatospheres", il nostro test colonia offre ulteriori vantaggi. In primo luogo, la nostra semi-solido sistema di cultura mediatica permette di placcatura fino a 25.000 cellule ordinati per 500 terreni di coltura per 24 microlitri bene mantenendo la conseguente formazione di colonie nel range lineare. ² Al contrario, il saggio pancreatosphere sospensione richiede l'uso di singolo deposizione metodo delle celle dal cell sorter per consentire analisi di singola cellula, e quindi un maggior volume di cultura media e incubatore spaziosono obbligatori. Pertanto, il nostro saggio colonia è relativamente facile e conveniente per condurre quando un gran numero di cellule differenti devono essere confrontati contemporaneamente per le attività delle cellule progenitrici. In secondo luogo, la nostra semi-solido dei media consente una distribuzione uniforme dei componenti della matrice extracellulare e fattori di crescita, che consente sia la proliferazione e la differenziazione avvenga nel pozzo stesso. Al contrario, è più difficile fornire un ambiente del genere, specialmente la matrice, di cellule in coltura sospensione. Siamo consapevoli che con il nostro metodo non può essere definitivamente provato che ogni colonia è derivata da una singola cellula, come due progenitori possono essere posizionate in modo casuale vicini l'uno all'altro e formano una colonia. Tuttavia, questo problema può essere superato attraverso l'analisi secondaria utilizzando la manipolazione singola cella. Diretto la raccolta manuale delle singole cellule ordinati potrebbe definitivamente dimostrare l'origine singola cella di ogni colonia.

In sintesi, l'insulina che esprimono formanti colonia attività di progenitors in semi-solido dei media descritto nel presente documento offre opportunità uniche per studi meccanicistici di cellule progenitrici del pancreas a livello di singola cellula. Per esempio, in un rapporto precedente abbiamo trovato che l'aggiunta di Matrigel, una miscela grezza di proteine ​​della matrice extracellulare, nella cultura dei media è necessario per la formazione di insulina che esprimono colonie da Ngn3-cellule EGFP ^{+, 2} suggerendo la matrice extracellulare è importante per quei progenitori. Da questo test colonia, sarà ora possibile analizzare ulteriormente e definire i requisiti matrice specifica per tale attività. Oltre a studiare progenitrici derivate da cellule staminali embrionali di topo, stiamo attualmente studiando se questo sistema di analisi in vitro supporta anche la formazione di altre colonie distintivo derivato dal pancreas e nel fegato di topi perinatale e adulti, così come da tessuto pancreatico umano cadavere privo di isolotti.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiale / Reagente	Azienda	Catalogo Numero	Commenti
DMEM 1X / F-12 (1:1)	Mediatech	15-090-CV
Siero di vitello fetale	Tissue Culture Biologicals	201	Consultare la Sezione 1,1
L-glutammina	Gibco	25030-081
1X PBS Dulbecco	Mediatech	21-031-CV
Siero bovino Albumina	Sigma	A8412	7,5%
Matrigel	Becton Dickinson	356231	Crescita ridotta Fattore
Metilcellulosa	Sinetsu Chimica, Tokyo, Giappone		1.500 centipoise (High-viscosity)
Nicotinamide	Sigma	N0636
Umano Ricombinante Activin βB	R & D Systems	659-AB-025
Exendin-4	Sigma	E7144
Umano Ricombinante VEGF-A	R & D Systems	293-VE-010
24-pozzetti	Co-star	3473	Ultra-low Attaccamento
60 millimetri Petri Dish con griglia	Nunc	169558