Visualisation et analyse du flux sanguin et la consommation d'oxygène dans la microcirculation hépatique: Application à un modèle de l'hépatite aiguë

Résumé

Un système optique est développé pour visualiser la microcirculation hépatique avec érythrocytes FITC marqués et pour mesurer la pression partielle d'oxygène dans le microvaisseaux avec assistée par laser Phosphorimétrie. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les mécanismes physiologiques et pathologiques en analysant la structure microvasculaire, le diamètre, la vitesse d'écoulement du sang, et la tension d'oxygène.

Résumé

Il ya un écart considérable entre l'offre et la demande en oxygène dans le foie, car la consommation d'oxygène hépatique est relativement élevé, mais environ 70% de l'approvisionnement sanguin hépatique est mal oxygéné sang de la veine portail dérivé du tractus gastro-intestinal et la rate. L'oxygène est livrée à des hépatocytes par le sang s'écoulant d'une branche terminale de la veine porte à une veinule centrale via sinusoïdes, ce qui rend un gradient d'oxygène en lobules hépatiques. Le gradient d'oxygène est un paramètre important physique qui implique l'expression d'enzymes en amont et en aval de la microcirculation hépatique, mais le manque de techniques pour mesurer la consommation d'oxygène dans la microcirculation hépatique a retardé l'élucidation des mécanismes relatifs à métabolisme de l'oxygène dans le foie. On a donc utilisé marqué FITC érythrocytes de visualiser la microcirculation hépatique et utilisé assistée par laser Phosphorimétrie pour mesurer la pression partielle d'oxygène dans le microvaisseaux là. Noncontact et continue de mesure optique permet de quantifier les vitesses d'écoulement de sang, les diamètres des navires, et les gradients d'oxygène liés à la consommation d'oxygène dans le foie. Dans un modèle de l'hépatite aiguë nous avons fait en administrant de l'acétaminophène pour les souris que nous avons observées pression d'oxygène a augmenté dans les deux veinules portales et central, mais un gradient d'oxygène a diminué dans les sinusoïdes, indiquant que la nécrose des hépatocytes dans la zone péricentral pourrait modifier la pression d'oxygène et affecter l'expression de l'enzyme dans la zone périportale. En conclusion, nos méthodes optiques pour l'hémodynamique hépatique de mesure et de la consommation d'oxygène peut révéler des mécanismes liés à la maladie hépatique.

Protocole

1. Étiquetage érythrocytes avec l'isothiocyanate de fluorescéine isomère I (FITC)

Tous les protocoles expérimentaux que nous avons utilisées ont été approuvées par le Comité de protection des animaux de Keio University School of Medicine.

1. Anesthésier un souris donneuses, et après avoir fait une incision coeliotomie retirer le sang total de la veine cave inférieure avec une seringue de 1 ml contenant petite quantité d'héparine. La souris a été immédiatement euthanasié par injection de pentobarbital sodique (100 mg / kg ip).
2. Laver le sang total deux fois avec du PBS (pH 7,4) par centrifugation pendant 5 min à 400 g dans un rotor à oscillation-seau.
3. Dissolvez 10 mg de FITC dans 5 ml de 100 mM de Na ₂ HPO ₄ et filtrer avec une membrane ayant des pores de 0,22 um.
4. Dans un tube à essai mélanger 1 ml de la solution de FITC avec 0,15 ml de 3 mM de glucose, 0,25 ml de 180 mM NaH ₂ PO ₄ ml, et 1,5 de 100 mM de Na ₂ HPO _4. Ajouter 0,2 ml de la RColombie-Britannique à granulés, et appuyez sur le tube pour mélanger.
5. Garder le tube pendant 2 heures à 4 ° C, puis laver les hématies colorées dans du PBS deux fois.
6. Mettez une petite quantité de la suspension de RBC sur une herbe diapositive et de voir si les globules rouges semblent en bonne santé (à savoir que leur forme et la taille sont normaux) et que l'intensité de fluorescence est suffisante.
7. Suspendre l'0,1 ml de globules rouges dans 0,9 ml de PBS à pH 7,4, et de garder la suspension à 4 ° C jusqu'à l'injection.

2. Préparation de l'oxygène colorant sensible

1. Dissoudre 500 mg de BSA dans 10 ml de PBS à pH 7,4.
2. Ajouter 30 mg de Pd (II)-méso-tétra (4-carboxyphényl) porphine (Pd-TCPP) à la solution de SAB et agitation pendant une nuit.
3. (Facultatif) Extrait BSA lié Pd-TCPP par écoulement par gravité en utilisant la chromatographie ou une colonne de centrifugation pour le séparer de libre-Pd TCPP.
4. Centrifuger la solution pour éliminer non dissous Pd-TCPP, et filtrer le surnageant avec un filtre à membrane ayant des pores de 0,22 pm.
5. Magasin de 1 ml aliquotes dans des tubes à -20 ° C. Éviter la répétition des cycles gel-dégel.

3. Préparation des animaux

1. Pour l'observation microscopique de la microcirculation de préparer une plaque en plastique avec un trou de 20 mm de diamètre, et la bande d'un verre de 30 mm carrés couverture carrée sur le trou.
2. Anesthésier une souris, retirez la fourrure, et préparer la peau. Placer un cathéter dans la queue vain l'injection de drogues en utilisant une aiguille 30 G connecté à un polyéthylène de 10 cm (PE 10) cathéter rempli de PBS hépariné.
3. Après incision médiane, d'étendre un lobule principale du foie sur la plaque en plastique et placez la souris en décubitus sternal.
4. Établir des feuillets d'une pellicule de petites cuisine (3 mm x 8 mm) et la tuile entre eux autour du bord du lobe hépatique d'inhiber le déplacement du foie avec la respiration et l'empêcher de séchage.
5. Observez la microcirculation hépatique sous un microscope (à lumière transmise), et de confirmer que le bdébit lood n'a pas la stase dans le champ de vision pendant au moins 15 min.
6. Injecter lentement 0,2 ml de globules rouges marqués par fluorescence pour l'observation du flux sanguin ou 0,2 ml de Pd-TCPP solution pour pO ₂ de mesure. Cette quantité de globules rouges marqués au FITC comptera pour 1/50 de tous les globules rouges en circulation dans la région visualisée.

4. Visualisation de l'écoulement du sang

1. Exciter l'FITC en l'irradiant avec de la lumière lampe à mercure qui a traversé un filtre passe-bande (450-490 nm) ^1.
2. Enregistrez l'image fluorescente avec une caméra CCD.

5. pO ₂ Mesure

Pd-TCPP phosphorescence est relativement faible et devrait être détectés avec un détecteur à haute sensibilité. Toutes les expériences doivent être effectuées dans une pièce sombre.

1. Les pics d'absorption de Pd-TCPP sont à 410 nm et 532 nm, de sorte que la longueur d'onde de seconde harmonique à 532 nm est recommandé pour l'excitation. Cette longueur d'onde peut être générée par un laser Nd: YAG impulsion laser ^2.
2. Faites passer le faisceau de laser Nd: YAG dans le port approprié sur le microscope inversé, et d'ajuster le point de faisceau à une position centrale dans le plan focal. La résolution spatiale dépend de la taille du spot laser, ce qui est changé en passant le faisceau à travers un trou d'épingle.
3. À détecter la phosphorescence, attacher un filtre passe-long (> 620 nm) et un tube photomultiplicateur (PMT) à l'autre port du microscope. Le PMT devrait être sensible aux longueurs d'onde rouges, en particulier autour de 700 nm.
4. Échantillonner le signal de phosphorescence (500 points échantillonnés à 200 kHz) et calculer la constante de temps de la décroissance en ajustant une fonction exponentielle de la désintégration.
5. Pour l'étalonnage préparer deux ensemble d'échantillons de Pd-TCPP solution avec pO ₂ 150 mmHg et 0 mmHg. Ajouter dithionite de sodium 1% en volume à utiliser pour produire l'absence d'oxygène. Maintenir le pH des échantillons à 7,4 et la températureture à 37 ° C pendant l'étalonnage.
6. Fixer le Stern-Volmer constante de temps k _q et de l'oxygène sans décroissance de la luminescence τ ₀ dans l'équation (1) ^3. Dans notre cas, avec Pd-TCPP solutions à 37 ° C et un pH de 7,4, k _q est de 374 mmHg ^-1 s ^-1 et τ ₀ est de 0,74 ms. Ces paramètres de mesure dépendent de l'équipement (c.-à-laser, détecteur, d'autres dispositifs optiques) et la méthode de traitement du signal, afin d'étalonnage est nécessaire dans chaque système ^de mesure ^4.
   τ ₀ / τ = ​​1 + k _q • τ ₀ • pO ₂ (1)
7. Régler la souris sur la plaque sur la platine du microscope, observer la microcirculation hépatique, et d'ajuster la position de la cible des microvaisseaux au point de la tache laser.

6. Modèle de l'hépatite

1. Souris rapide avec un accès gratuit à l'eau durant la nuit.
2. Préparer un20 mg par ml de solution d'acétaminophène (APAP) dans le DMSO.
3. Injecter par voie intrapéritonéale à elle 1 ml/100 g de poids corporel (soit 200 mg / kg de poids corporel). Après l'injection, la souris peut être donné libre accès à la nourriture et l'eau ^5.
4. 24 heures après l'injection, anesthésier la souris et d'exposer le foie en faisant une incision médiane. Si l'hépatite est atteint, la nécrose dans la région péricentral sera facilement visible à l'œil nu.

7. Les résultats représentatifs

Des exemples d'images de la microcirculation hépatique sont représentés à la figure 1, où (a) est une image de lumière transmise et (b) est une image de fluorescence. Individuels érythrocytes marqués au FITC sont observées dans le film vidéo, et des veinules de portail, sinusoïdes, et des veinules centrales sont reconnus par les directions d'écoulement de sang.

Comme le montre la figure 2, le spot laser irradiant une veinule centrale à travers une lentille de l'objectif x100 était Approximimmédiatement 10 microns de diamètre. Intravasculaire pO ₂ dans la microcirculation hépatique a été mesuré dans C57BL mâle / 6 souris, et la figure 3 (a) montre les relations entre pO ₂ et le diamètre des vaisseaux dans les veinules portales et centrale. Le gradient de pO ₂ à partir du portail aux veinules centrales indique que les globules rouges libèrent de l'oxygène de manière efficace tout en passant par des sinusoïdes. Comme le montre la figure 3 (b), la moyenne était de 59,8 pO ₂ mmHg dans les vaisseaux, 48,2 mmHg portail de sinusoïdes, et de 38,9 mmHg dans les veinules centrales.

Lorsque nous avons produit une hépatite aiguë par injection intrapéritonéale APAP, intravasculaire pO ₂ a été significativement plus élevées dans chaque partie de la microcirculation hépatique: p <0,05 dans les veines portes et p <0,01 dans les sinusoïdes et les veines centrales (figure 3 (c)).

Figure 1. Faible grossissement images montrant la microcirculation hépatique, avec (a) la lumière transmise et (b) de fluorescence.

Figure 2. Image de spot laser irradiant une veinule ciblée central pour pO ₂ de mesure.

Figure 3. PO ₂ gradient dans la microcirculation hépatique des souris témoins sains et des souris atteintes d'une lésion hépatique induite par l'acétaminophène. (A) montre pO ₂ par rapport diamètre du vaisseau pour le portail veinules (PV) et le centre de veinules (CV), et (b) montre le gradient d'oxygène à partir de PV pour CV par sinusoïdes (s). La pO ₂ différence entre PV et CV reflète la consommation d'oxygène des hépatocytes ou d'autres cellules du parenchyme. (C) montre que dans des conditions hépatite induite par l'administration APAP, pO ₂ a été significativement plus élevée dans les PV, S, et le CV et la pO ₂gradient a diminué, ce qui indique que la consommation d'oxygène hépatique a été compromise.

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Discussion

Fournir de l'oxygène vers les tissus est un rôle essentiel de la microcirculation, et beaucoup de documents décrivent les maladies liées à l'anatomie et la rhéologie des microvaisseaux ^6. Le flux sanguin du foie est une combinaison de sang artériel et veineux. Environ 30% du flux sanguin vers le foie est bien oxygéné du sang fourni par l'artère hépatique et l'autre 70%, fourni par la veine porte, est la sortie du sang mal oxygéné veineux de la rate et du tractus gastro ^7.

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
Pd (II) méso-tétra (4-carboxyphényl) porphine	Frontier Scientific, Inc	PdT790
Isothiocyanate de fluorescéine isomère I	Sigma-Aldrich Co.	F7250
L'acétaminophène	Sigma-Aldrich Co.	A7085

Nom de l'équipement	Entreprise	Numéro de catalogue
			Équipement
Tube photomultiplicateur	Hamamatsu Photonics KK	H10722-20