Визуализация и анализ потока крови и потребления кислорода в печеночной микроциркуляции: применение к модели острого гепатита

Резюме

Оптическая система была разработана для визуализации печеночной микроциркуляции с FITC-меченных эритроцитов и измерять парциальное давление кислорода в микрососудах с помощью лазера phosphorimetry. Этот метод может быть использован для исследования физиологических и патологических механизмов, с помощью анализа микрососудистых структуры, диаметр, скорость кровотока и напряжения кислорода.

Аннотация

Существует значительное расхождение между спросом и предложением кислорода в печень, потому что потребление кислорода печеночной относительно высока, но около 70% кровоснабжения печеночных слабо насыщенной кислородом крови воротной вены, полученные из желудочно-кишечного тракта и селезенки. Кислород поступает в гепатоциты от крови, текущей из терминала ветви воротной вены к центральной венулы через синусоиды, и это делает кислорода градиент в печеночных долек. Градиент кислорода является важным физическим параметром, который включает в себя выражение ферментов вверх и вниз по печеночной микроциркуляции, но отсутствие методов измерения потребления кислорода в печеночной микроциркуляции задержал выяснение механизмов, связанных с кислородного обмена в печени. Поэтому мы использовали FITC-мечеными эритроцитами для визуализации печеночной микроциркуляции и использовать с помощью лазера phosphorimetry измерять парциальное давление кислорода в микрососудах там. NoncontaКТ и непрерывного оптического измерения можно количественно скоростей кровотока, судно диаметров и кислорода градиенты, связанные с потреблением кислорода в печени. В остром гепатите модель мы сделали путем введения парацетамола для мышей мы наблюдали повышенном давлении кислорода в обоих портала и центральной венулы, но снижение кислорода градиент в синусоиды, указывая, что некроз гепатоцитов в зоне перицентральный может измениться давление кислорода и фермента влияет на выражение в зоне перипортальный. В заключение нашего оптических методов измерения печеночной гемодинамики и потребления кислорода может выявить механизмы, связанные с заболеваниями печени.

протокол

1. Маркировка Эритроциты с флуоресцеина изотиоцианат изомера I (FITC)

Все экспериментальные протоколы мы использовали, были утверждены Комитетом Animal Care в университете Кейо в Школе медицины.

1. Обезболить доноров мышей, и, сделав разрез лапаротомия снять цельной крови из нижней полой вены с 1-мл шприц, содержащий небольшое количество гепарина. Мышь была немедленно подвергнута эвтаназии натрия фенобарбитала инъекций (100 мг / кг).
2. Вымойте цельной крови в два раза с PBS (рН 7,4) центрифугированием в течение 5 минут при 400 гр в качающийся-ротором.
3. Растворите 10 мг FITC в 5 мл 100 мМ Na ₂ HPO ₄ и фильтровать с мембраной с 0.22-мкм поры.
4. В пробирке смешивают 1 мл раствора с FITC 0,15 мл 3 мМ глюкозы, 0,25 мл 180 мМ NaH ₂ PO ₄ и 1,5 мл 100 мМ Na ₂ HPO _4. Добавить 0,2 мл RДо н.э. гранул и нажмите трубки для смешивания.
5. Держите трубку в течение 2 часов при температуре 4 ° C, а затем вымыть окрашенных эритроцитов в ФБР в два раза.
6. Нанесите небольшое количество суспензии эритроцитов на слайде травы и посмотреть, если эритроциты выглядят здоровыми (то есть, что их форма и размеры нормальные), а также о том, что интенсивность флуоресценции достаточно.
7. Приостановить 0,1 мл эритроцитов в 0,9 мл PBS при рН 7,4, и сохранить подвеску на 4 ° C до инъекции.

2. Подготовка чувствительные к кислороду краска

1. Растворите 500 мг BSA в 10 мл PBS при рН 7,4.
2. Добавить 30 мг Pd (II)-мезо-тетра (4-карбоксифенил) порфина (Pd-TCPP) к решению BSA и перемешать в течение ночи.
3. (Опционально) Извлечение BSA связанных Pd-TCPP с помощью гравитационного потока хроматографии или спин колонки, чтобы отделить его от свободных Pd-TCPP.
4. Центрифуга решение для удаления нерастворенных Pd-TCPP и фильтрацию супернатанта с мембранным фильтром с 0.22-мкм поры.
5. Магазин 1-мл порции в трубах при температуре -20 ° C. Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания.

3. Подготовка животных

1. Для микроскопического наблюдения микроциркуляцию подготовить пластмассовую пластинку с отверстием диаметром 20 мм, а ленты 30 мм, квадрат квадратные стеклянные крышки с отверстием.
2. Анестезию мыши, удалить шерсть, и подготовительные кожи. Поместите катетер в хвост напрасно инъекционных наркотиков с помощью иглы 30 G связано с 10-см полиэтилена (ПЭ 10) катетер заполнены гепаринизированной PBS.
3. После того, как средний разрез, расширить основной дольки печени на пластиковой пластиной, и поместите курсор в лежачее положение грудины.
4. Подготовить небольшие промахи с кухней упаковка (3 мм х 8 мм) и плитку их по краю доли печени препятствовать перемещению печени с дыханием и сохранить его от высыхания.
5. Соблюдайте печеночной микроциркуляции под микроскопом (в проходящем свете), и убедитесь, что бlood поток не имеет застой в поле зрения, по крайней мере 15 мин.
6. Медленно вводят 0,2 мл флуоресцентно меченных эритроцитов в крови наблюдения потока или 0,2 мл Pd-TCPP решение для измерения рО _2. Это количество FITC-меченных эритроцитов составит 1/50 всех эритроцитов в обращении визуализировать региона.

4. Визуализация кровотока

1. Возбуждает FITC путем облучения его светом ртутных ламп, которая прошла через полосовой фильтр (450-490 нм) ^1.
2. Запишите флуоресцентные изображения с ПЗС-камерой.

5. рО ₂ измерения

Pd-TCPP фосфоресценции относительно слаба и должна быть определена с высокой чувствительности детектора. Все эксперименты должны быть выполнены в темной комнате.

1. Полосы поглощения Pd-TCPP это при 410 нм и 532 нм, так что второй гармоники волны 532 нм рекомендуется для возбуждения. Эта длина волны может быть порожден Nd: YAG лазерного импульса ^2.
2. Поток пучка из Nd: YAG лазера в соответствующий порт на инвертированного микроскопа и отрегулируйте световое пятно на центральное место в фокальной плоскости. Пространственное разрешение зависит от размера лазерного пятна, которые изменились, передавая пучка через отверстия.
3. Чтобы обнаружить свечение, приложите длинный фильтр (> 620 нм) и фотоумножителя (ФЭУ) на другой порт микроскопа. PMT должны быть чувствительны к красному длин волн, особенно около 700 нм.
4. Попробуйте фосфоресценции сигнала (500 точек дискретизации 200 кГц) и вычислить постоянную времени распада путем установки экспоненциальной функции к распаду.
5. Для калибровки подготовить два набора образцов Pd-TCPP решение с рО ₂ 150 мм рт.ст., 0 мм рт. Добавить дитионита натрия 1% по объему образца для получения отсутствие кислорода. Хранить рН образцов при 7.4 и температурытуры при 37 ° C во время калибровки.
6. Закрепите Штерна-Фольмера постоянной K _Q и кислород свободного времени затухания люминесценции τ ₀ в уравнении (1) ^3. В нашем случае, с Pd-TCPP решений при 37 ° С и рН 7,4, к _д 374 мм рт.ст. ^-1 с ^-1 и τ ₀ 0,74 мс. Эти измерения параметров зависят от оборудования (лазерные, детектор, другие оптические устройства) и метод обработки сигнала, поэтому калибровка необходима в каждом измерении система ^4.
   τ ₀ / τ = ​​1 + K _Q • τ ₀ • рО ₂ (1)
7. Установите мышь на тарелке на столике микроскопа, наблюдать печеночной микроциркуляции, и отрегулировать положение целевой микрососудов до точки лазерного пятна.

6. Гепатит модели

1. Быстрый мышей со свободным доступом к воде на ночь.
2. Подготовьте20 мг на мл раствора ацетаминофен (APAP) в ДМСО.
3. Вводите его intraperitonealy на 1 мл на 100 г массы тела (например, 200 мг / кг массы тела). После инъекции мыши может быть предоставлен свободный доступ к пище и воде ^5.
4. 24 часов после инъекции, анестезия мыши и подвергать печень, сделав разрез средней. Если гепатит достигается, некрозы в перицентральный регионе будет легко видна невооруженным глазом.

7. Представитель Результаты

Пример изображения печеночной микроциркуляции показано на рисунке 1, где (а) проходящего света изображение и (б) флуоресценции изображение. Индивидуальные FITC-меченных эритроцитов наблюдаются в видео фильм, и портала венул, синусоидов и центральных венул признаны направления кровотока.

Как показано на рисунке 2, лазерного пятна облучения центральной венулы через объектив x100 был approximately 10 мкм в диаметре. Внутрисосудистое рО ₂ в печеночной микроциркуляции определяли в мужской C57BL / 6, а на рисунке 3 (а) показывает отношения между рО ₂ и диаметр сосуда в портале и центральной венул. РО ₂ градиент от портала центральной венулы показывает, что эритроциты выделения кислорода эффективно при прохождении через синусоиды. Как показано на рисунке 3 (б), средняя рО ₂ была 59,8 мм рт.ст. в портале суда, 48,2 мм в синусоиды, и 38,9 мм в центральной венулы.

Когда мы произвели острого гепатита, вводя APAP intraperitonealy, внутрисосудистого рО ₂ был значительно повышен в каждой части печеночной микроциркуляции: р <0,05 в воротной вены и р <0,01 в синусоиды и центральные вены (рис. 3 (с)).

Рисунок 1. Низким увеличением яМаги показывает печеночной микроциркуляции с (а) проходящего света и (б) флуоресценции.

Рисунок 2. Изображение лазерного пятна облучения целевых центральной венулы для измерения рО _2.

Рисунок 3. РО ₂ градиент в печеночной микроциркуляции здоровых контрольных мышей и мышей с ацетаминофен вызванных печеночной травмы. () Показывает, рО ₂ по сравнению с диаметром сосудов портальных венул (PV) и центральной венулы (CV), и (б) показывает, кислорода градиент от PV к резюме через синусоиды (S). РО ₂ разница между PV и CV отражает потребления кислорода гепатоцитами или других паренхиматозных клеток. (С) показывает, что в условиях гепатит индуцированных APAP администрации, рО ₂ был значительно повышен в PV, S, и резюме и рО ₂градиент уменьшился, указывая, что потребление кислорода печеночной был скомпрометирован.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Доставка кислорода к тканям является важной роли микроциркуляцию, и многие документы описывают заболеваний, связанных с микрососудов анатомии и реология ^6. Печень поток крови представляет собой сочетание артериальной и венозной крови. Около 30% притока крови к печени хорошо кисл?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу
Pd (II) мезо-тетра (4-карбоксифенил) порфина	Пограничный Scientific, Inc	PdT790
Флуоресцеина изотиоцианат изомер я	Sigma-Aldrich Ко	F7250
Ацетаминофен	Sigma-Aldrich Ко	A7085

Наименование оборудования	Компания	Номер по каталогу
			Оборудование
фотоумножитель	Hamamatsu Photonics KK	H10722-20