En électroporations Ovo d'embryons au stade de poulet 10 HH

Résumé

Poussin dans l'électroporation in ovo est une technique qui permet la manipulation génétique de l'embryon aviaire. Les applications courantes de cette technique comprennent l'analyse fonctionnelle des gènes et des éléments activateurs putatifs. Cette vidéo montre l'électroporation du tube neural chez les embryons de poussins HH 10. Technique d'injection et la manipulation correcte d'œuf sont discutées.

Résumé

Grande taille et du développement externe de l'embryon de poulet ont longtemps fait un outil précieux dans l'étude de la biologie du développement. Avec l'avènement des techniques de biologie moléculaire, le poussin est devenu un système utile pour l'étude de la régulation des gènes et leur fonction. Par électroporation constructions d'ADN ou d'ARN dans l'embryon de poulet en développement, les gènes peuvent être exprimés ou renversé afin d'analyser en fonction des gènes in vivo. De même, constructions rapporteurs peuvent être utilisées pour la cartographie de destin ou d'examiner des éléments de gènes putatifs de régulation. Par rapport à des expériences similaires chez la souris, l'électroporation chiches a l'avantage d'être rapide, facile et peu coûteux. Cette vidéo montre d'abord comment faire une fenêtre dans la coquille de manipuler l'embryon. Ensuite, l'embryon est visualisé avec une solution diluée d'encre de Chine injectée ci-dessous l'embryon. Une aiguille de verre et une pipette sont utilisés pour injecter de l'ADN et Fast colorant vert dans le tube neural de développement, puis des électrodes de platine sont placés parallèlement à l'embryon et de courtes impulsions électriques sont administrés avec un générateur d'impulsions. Enfin, l'œuf est scellé avec du ruban adhésif et replacée dans un incubateur pour le développement ultérieur. En outre, la vidéo montre stockage des œufs et à la manipulation et discute les causes possibles de l'électroporation d'embryons suivantes perte.

Protocole

La manipulation des œufs

1. Les oeufs peuvent être conservés à 13 ° C pendant jusqu'à une semaine avant l'incubation sans perte significative de viabilité (un refroidisseur de vin est idéal pour les petits à cet effet).
2. Avant l'incubation, les oeufs permettent de se réchauffer à température ambiante, puis placer dans un incubateur humidifié de poulet mis à 37,8 ° C (100 ° F).
3. En général, nous électroporation d'embryons d'environ 48 heures après le début de l'incubation, lorsque l'embryon a atteint Hamburger et le stade de Hamilton 10.
4. Temps d'incubation peut varier selon Hamburger désiré et le stade de Hamilton. La température est critique et écart par rapport à la température d'incubation optimale va modifier le temps d'incubation et la viabilité des embryons diminuer.
5. Durant l'incubation, les œufs doivent être conservés sur leurs côtés pour que l'embryon sera bien positionné pour l'électroporation. L'embryon va flotter au-dessus du jaune et il est utile de marquer le sommet de l'œuf avec un crayon avant de fenêtrage afin que vous sachiez où couper.

Préparation

1. Chaud Leibovitz L-15 des médias à 37 ° C. Tirez capillaires en verre en aiguilles. Électrodes de position et micromanipulateur et connecter les électrodes au générateur d'impulsions.

Fenêtrage

1. En utilisant une seringue avec une aiguille perce large, percer la coquille à la petite extrémité de l'œuf.
2. Soulignant l'aiguille attentivement vers le bas pour empêcher la perturbation du jaune, retirez environ 5ml d'albumine.
3. Sceller le trou avec un petit morceau de ruban adhésif.
4. Couvrez le dessus de l'œuf avec un autre morceau de ruban adhésif (environ 4x4 cm).
5. Avec des ciseaux courbes, et en prenant soin de ne pas perturber l'embryon, découpez un trou juste assez grand pour fournir une fenêtre dans laquelle travailler.

Facultatif: Pour visualiser le tube neural, injecter la solution d'encre avec une aiguille de calibre 26 au-dessous de l'embryon (insérer l'aiguille dans l'embryon de l'extérieur de l'anneau de sang). L'encre de Chine doit être dilué 1:5 avec Tom Hanks ou comparables solution tamponnée stérile.

Injection et l'électroporation

1. Pause de la pointe capillaire pour un diamètre désiré en utilisant une pince à épiler
2. En utilisant la pipette la bouche, charge le capillaire avec le colorant vert plasmidique / Fast.
3. Position de l'embryon avec la tête vers vous et insérez l'aiguille dans le tube neural à un angle faible.
4. Injecter la solution de plasmide dans le lumen du tube neural jusqu'à ce colorant remplit tout l'espace.

Remarque: Soyez prudent de ne pas avoir plus de diamètre, puis la pointe du tube neural. En général, vous serez en mesure de dire si la taille de la pointe optimale a été obtenue par la facilité ou il est difficile de tirer de liquide dans le capillaire. S'il ya une résistance extrême, l'ouverture est probablement trop petit et la pointe doit être rompu à nouveau plus haut. S'il ya peu ou aucune résistance, l'ouverture est trop grande et une nouvelle aiguille doit être utilisé.

1. Placer une ou deux gouttes de solution stérile L-15 médias sur l'embryon.
2. Immédiatement placer les électrodes de chaque côté de l'embryon, parallèlement à la fermeture du tube neural, et le pouls 5 fois à 10-24 volts pour 50 mseconds à intervalles de 1 seconde. Vous verrez des bulles à proximité des électrodes si cela a fonctionné correctement.
3. Retirez délicatement les électrodes, mettez 5 gouttes de L-15 sur le dessus de l'embryon et le sceau de l'œuf avec du ruban adhésif. Assurez-vous que l'œuf est bien scellée, que le séchage est un contributeur majeur à la perte de l'embryon après l'électroporation.
4. Placez les oeufs dans l'incubateur de retour, côté fenêtre vers le haut, et incuber jusqu'à ce qu'ils atteignent désirée H & H étape.

Discussion

Ce protocole fournit un guide étape par étape à l'électroporation du tube neural d'embryons de poulet HH10. En plus de montrer la technique, des lignes directrices pour le stockage et la manutention des oeufs est également fourni. Cette technique présente un large éventail d'applications pour l'analyse génétique et le coût aise et peu d'expériences qui les rend possible pour de nombreux laboratoires.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken egg incubator			humidified, set to 37.80°C (100F).
Pulse generator	Genetronics	BTX T820	Square wave generator or comparable
Electrodes			our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart
Connecter cables
Micromanipulator
Dissecting scope			with large working distance
Glass capillaries			and capillary puller or commercial glass needles
Leibovitz’s L-15 media
chicken eggs			fertilized
Curved scissors
10 ml syringe
Large bore needle			16-18G
Mouth pipette
India ink
Insulin syringe/syringe
Plasmid DNA			≥ 1μg/μl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye