Em Electroporations Ovo de Estágio HH 10 embriões de galinha

Resumo

Pinto no ovo eletroporação é uma técnica que permite a manipulação genética do embrião aviária. Aplicações mais comuns desta técnica incluem a análise funcional de genes e elementos enhancer putativa. Este vídeo demonstra eletroporação do tubo neural em HH 10 embriões de galinha. Técnica de injeção e manuseio adequado de ovo são discutidos.

Resumo

Grande tamanho e desenvolvimento externo do embrião de galinha há muito tempo tornou uma ferramenta valiosa no estudo da biologia do desenvolvimento. Com o advento da técnicas da biologia molecular, a garota tornou-se um sistema útil para se estudar a regulação do gene e função. Por electroporating construções de DNA ou RNA no embrião de galinha em desenvolvimento, os genes podem ser expressos ou derrubado a fim de analisar in vivo a função do gene. Da mesma forma, constrói repórter pode ser usado para o mapeamento de destino ou para analisar elementos gene putativo de regulamentação. Comparação com experiências similares em mouse, eletroporação pintinho tem a vantagem de ser rápido, fácil e barato. Este vídeo demonstra como fazer primeiro uma janela na casca de ovo para manipular o embrião. Em seguida, o embrião é visualizado com uma solução diluída de nanquim injetado abaixo do embrião. Uma agulha de vidro e pipetas são utilizadas para injetar DNA e corante verde rápido dentro do tubo neural em desenvolvimento, em seguida, são colocados eletrodos de platina paralelo ao embrião e curta pulsos elétricos são administrados com um gerador de pulsos. Finalmente, o ovo é selada com fita adesiva e colocados de volta para uma incubadora para o desenvolvimento. Além disso, o vídeo mostra a estocagem e manuseio apropriado e discute as possíveis causas do embrião eletroporação seguintes perda.

Protocolo

Manipulação de ovos

1. Os ovos podem ser conservados a 13 ° C por até uma semana antes da incubação, sem perda significativa de viabilidade (um refrigerador do vinho pequeno é ideal para esta finalidade).
2. Antes da incubação, ovos para permitir que a temperatura ambiente, em seguida, coloque em uma galinha umidificado incubadora definido para 37,8 ° C (100 ° F).
3. Nós geralmente electroporate embriões aproximadamente 48 horas depois do início de incubação, quando o embrião atingiu Hamburger e Hamilton estágio 10.
4. Tempo de incubação pode variar de acordo com Hamburger desejado e estágio Hamilton. Temperatura é crítica e desvio da temperatura de incubação ideal irá alterar o tempo de incubação e viabilidade do embrião diminuir.
5. Durante a incubação, os ovos devem ser mantidos em seus lados para que o embrião vai ser posicionadas corretamente, de eletroporação. O embrião vai flutuar em cima da gema e é útil para marcar a parte superior do ovo com um lápis antes de janelas para que você saiba onde cortar.

Preparação

1. Quente Leibovitz L-15 media a 37 ° C. Puxe capilares de vidro em agulhas. Eletrodos posição e micromanipulador e conectar eletrodos ao gerador de pulsos.

Windowing

1. Usando uma seringa com agulha grande furo, furar a casca na extremidade pequena do ovo.
2. Apontando a agulha cuidadosamente para baixo para evitar a interrupção da gema, remover cerca de 5 ml de albumina.
3. Sele o orifício com um pequeno pedaço de fita.
4. Cobrir a parte superior do ovo com outro pedaço de fita adesiva (cerca de 4x4 cm).
5. Com uma tesoura curva, e tomando cuidado para não perturbar o embrião, cortar um buraco grande o suficiente para fornecer uma janela na qual trabalho.

Opcional: Para visualizar o tubo neural, injectar a solução de tinta com agulha de calibre 26 debaixo do embrião (inserir a agulha sob o embrião de fora do anel de sangue). Tinta da Índia devem ser diluídas 1:5 com Hanks ou comparáveis ​​solução estéril tamponada.

Injeção e Eletroporação

1. Quebre a ponta capilar para diâmetro desejado usando uma pinça
2. Usando a pipeta na boca, coloque o capilar com plasmídeo / Fast corante verde.
3. Posição do embrião com a cabeça em direção a você e inserir a agulha no tubo neural em um ângulo raso.
4. Injetar a solução de plasmídeo para o lúmen do tubo neural até dye preenche todo o espaço.

Nota: Tenha cuidado para não ter maiores ponta, em seguida, diâmetro do tubo neural. Em geral, você será capaz de dizer se o tamanho da ponta ideal tem sido alcançado por quão fácil ou difícil é para puxar líquido no capilar. Se houver resistência extrema, a abertura é provavelmente muito pequena ea ponta deve ser quebrado novamente mais acima. Se houver pouca ou nenhuma resistência, a abertura é muito grande e uma nova agulha deve ser usado.

1. Coloque 1-2 gotas de estéril L-15 media sobre o embrião.
2. Imediatamente colocar os eletrodos em ambos os lados do embrião, em paralelo com o tubo neural, e pulso 5 vezes em 24/10 volts para 50 mseconds em intervalos de 1 segundo. Você vai ver as bolhas perto dos eletrodos se funcionou corretamente.
3. Remova cuidadosamente eletrodos, coloque 5 gotas de L-15 em cima dos embriões e selar o ovo com fita adesiva. Certifique-se que o ovo é bem fechados, como secagem é um dos principais contribuintes para a perda de embrião após eletroporação.
4. Coloque os ovos de volta para a incubadora, lado da janela para cima, e incubar até chegarem desejado H & H estágio.

Discussão

Este protocolo fornece um guia passo a passo para eletroporação do tubo neural de embriões de galinha HH10. Além de mostrar a técnica, as diretrizes para o armazenamento e manuseio de ovos também é fornecido. Esta técnica tem uma ampla gama de aplicações para análise genética e do custo baixo e facilidade de experimentos torna viável para muitos laboratórios.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken egg incubator			humidified, set to 37.80°C (100F).
Pulse generator	Genetronics	BTX T820	Square wave generator or comparable
Electrodes			our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart
Connecter cables
Micromanipulator
Dissecting scope			with large working distance
Glass capillaries			and capillary puller or commercial glass needles
Leibovitz’s L-15 media
chicken eggs			fertilized
Curved scissors
10 ml syringe
Large bore needle			16-18G
Mouth pipette
India ink
Insulin syringe/syringe
Plasmid DNA			≥ 1μg/μl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye