В Ovo Electroporations Его Святейшества Стадия 10 эмбрионов куриного

Резюме

Чик в ово электропорации это техника, которая позволяет генетические манипуляции птичьего эмбриона. Общие применения этого метода относятся функциональный анализ генов и предполагаемых элементов усилителя. Это видео демонстрирует нейронных электропорации трубки в HH 10 куриных эмбрионов. Техника инъекций и надлежащее обращение с яйцом обсуждаются.

Аннотация

Большой размер и внешний развития куриного эмбриона уже давно сделали его ценным инструментом в изучении биологии развития. С появлением молекулярно-биологических методов, цыпленок стал полезной системой, в которой для изучения регуляции генов и функции. По electroporating ДНК или РНК конструкции в развивающихся куриных эмбрионов, гены могут быть выражены или сбит с целью анализа в функции гена естественных условиях. Аналогичным образом, репортер конструкций может быть использован для отображения судьбы или для изучения предполагаемых генов регуляторных элементов. По сравнению с аналогичными экспериментами в мыши, птенец электропорации имеет преимущества быть быстрым, простым и недорогим. Это видео демонстрирует первых, как сделать окно в яичной скорлупе манипулировать эмбриона. Затем эмбрион визуализируется с разбавленным раствором тушь вводили ниже эмбриона. Иглой стекло и пипетки используются для введения ДНК и быстрый зеленый краситель в развивающихся нервной трубки, то платиновые электроды расположены параллельно эмбриона и короткие электрические импульсы вводятся с генератора импульсов. Наконец, яйцо запечатанных скотчем и положил обратно в инкубатор для дальнейшего развития. Кроме того, видео показывает правильное хранение и обращение с яйцом и обсуждаются возможные причины эмбриона электропорации следующие потери.

протокол

Яйцо обработке

1. Яйца можно хранить при температуре 13 ° С не более одной недели до инкубации без значительной потери жизнеспособности (небольшой кулер вино идеально подходит для этой цели).
2. До инкубации яиц позволяют нагреться до комнатной температуры, затем поместить в увлажненной куриный инкубатор набор до 37,8 ° C (100 ° F).
3. Мы обычно electroporate эмбрионов около 48 часов от начала инкубации, когда эмбрион достиг Гамбургер и Гамильтон этапе 10.
4. Время инкубации может меняться в зависимости от желаемого Гамбургер и Гамильтон стадии. Температура имеет большое значение и отклонение от оптимальной температуры инкубации изменит времени инкубации и жизнеспособность снижение эмбриона.
5. Во время инкубации, яйца должны храниться на боку так, что эмбрион будет правильно позиционируется для электропорации. Эмбрион будет плавать сверху желтком и было бы полезно, чтобы отметить начало яйцо с карандашом перед оконной, чтобы вы знали, где резать.

Подготовка

1. Теплый Лейбовиц L-15 средств массовой информации до 37 ° C. Вытяните стеклянных капилляров в иглы. Позиция электродов и микроманипулятора и подключения электродов генератора импульсов.

Windowing

1. Использование шприц с иглой большого диаметра, прокалывают оболочку на маленький конец яйца.
2. Указывая иглу осторожно вниз, чтобы предотвратить нарушение желток, удалите около 5 мл альбумина.
3. Печать дыра с небольшой кусочек ленты.
4. Обложка верхней части яйца с другой частью ленты (около 4х4 см).
5. Использование изогнутые ножницы, и стараясь не нарушить эмбриона, вырезать отверстие достаточно большой, чтобы обеспечить окно, в котором к работе.

Дополнительно: Для визуализации нервной трубки, инъекционные чернил решение с 26 иглы под эмбриона (вставить иглу под эмбриона из-за пределов крови кольца). Тушь следует разбавить 1:5 Хэнкса или сопоставимой стерильный буферный раствор.

Инъекции и Электропорация

1. Перерыв капиллярного кончика желаемого диаметра с помощью пинцета
2. Использование рот пипеткой, нагрузка капилляр с плазмиды / Быстро зеленый краситель.
3. Позиция эмбриона с головы по направлению к себе и вставьте иглу в нервной трубки под небольшим углом.
4. Inject плазмиды раствора в просвет нервной трубки, пока краска заполняет все пространство.

Примечание: Будьте осторожны, чтобы не иметь наконечник больше, то нейронные диаметра трубы. В общем, вы сможете узнать, есть ли оптимальный размер наконечника была достигнута насколько легко или трудно тянуть жидкость в капилляр. Если есть крайняя устойчивость, открытие, вероятно, слишком мал, и кончик должен быть разбит еще раз выше. Если нет или почти никакого сопротивления, открытия слишком велик, и новая игла должна быть использована.

1. Место 1:59 капли стерильные L-15 средств массовой информации на эмбрион.
2. Сразу же месте электродами по обе стороны от эмбриона, параллельно нервной трубки, и пульс 5 раз в 10-24 вольт на 50 mseconds интервалом в 1 секунду. Вы увидите пузырьки вблизи электродов, если он работал должным образом.
3. Осторожно снимите электроды, поставить 5 капель L-15 в верхней части эмбрионов и печатью яйцо с лентой. Убедитесь, что яйца хорошо запечатаны, как сушка одной из основных причин потери эмбриона следующие электропорации.
4. Место яйца обратно в инкубатор, окна вверх, и инкубировать пока они не достигают желаемого H & H стадии.

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает пошаговое руководство для нейронных электропорации трубки HH10 куриных эмбрионов. В дополнение к показу техники, рекомендации по хранению и обработке яиц также предоставляется. Эта методика имеет широкий спектр применения для генетического анализа, а легкость и низкая ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken egg incubator			humidified, set to 37.80°C (100F).
Pulse generator	Genetronics	BTX T820	Square wave generator or comparable
Electrodes			our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart
Connecter cables
Micromanipulator
Dissecting scope			with large working distance
Glass capillaries			and capillary puller or commercial glass needles
Leibovitz’s L-15 media
chicken eggs			fertilized
Curved scissors
10 ml syringe
Large bore needle			16-18G
Mouth pipette
India ink
Insulin syringe/syringe
Plasmid DNA			≥ 1μg/μl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye