Échantillonnage humaines Peptidome salive autochtones l'aide d'une sonde d'ultrafiltration Lollipop-Like: Simplifier et améliorer la détection des peptides pour spectrométrie de masse clinique

Résumé

Considérant la salive d'échantillonnage pour l'application clinique future, une sucette en forme de l'ultrafiltration (LLUF) sonde a été fabriquée pour s'adapter à la cavité buccale humaine. Une analyse directe de la salive non digérés par NanoLC-spectrométrie de masse LTQ a démontré la capacité de sondes LLUF pour éliminer les protéines et les protéines de grandes abondance élevés, et de faire peu abondantes peptides plus détectable.

Résumé

Bien que la salive humaine protéome et peptidome ont été révélés ^1-2 ils ont été identifiés à partir de majorly digestion trypsique de protéines de la salive. Identification des peptidome indigène de la salive humaine sans digestion préalable avec des enzymes exogènes devient impératif, puisque peptides natifs dans la salive humaine fournir des valeurs possibles pour le diagnostic de la maladie, prédire l'évolution de la maladie, et le suivi de l'efficacité thérapeutique. D'échantillonnage approprié est une étape critique pour l'amélioration de l'identification de la salive humaine peptidome indigène. Les méthodes traditionnelles d'échantillonnage salive humaine impliquant centrifugation pour éliminer les débris ^3-4 peut-être trop de temps pour être applicable pour une utilisation clinique. En outre, l'enlèvement des débris par centrifugation peut être incapable de nettoyer la plupart des agents pathogènes infectées et éliminer les protéines d'abondance élevés qui entravent souvent l'identification des peptidome faible abondance.

Les approches conventionnelles protéomiques qui pritiellement utiliser électrophorèse sur gel bidimensionnelle (2-DE) des gels de conjugaison avec la digestion dans le gel sont capables d'identifier plusieurs protéines salivaires ^5-6. Cependant, cette approche n'est généralement pas suffisamment sensibles pour détecter des peptides ou protéines de faible abondance. Chromatographie en phase liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) à base de protéomique est une alternative qui permet d'identifier des protéines sans l'accord préalable 2-DE séparation. Bien que cette approche offre une plus grande sensibilité, il a généralement besoin d'échantillon avant de pré-fractionnement ⁷ et pré-digestion avec la trypsine, ce qui rend difficile pour un usage clinique.

Pour contourner l'obstacle en spectrométrie de masse en raison de la préparation des échantillons, nous avons développé une technique appelée ultrafiltration capillaire (CUF) sondes ^8-11. Les données de notre laboratoire ont démontré que les sondes du CUF sont capables de capturer des protéines in vivo à partir des micro-environnements différents chez les animaux d'une manière dynamique et minimalement invasive ^{8 -}11. Pas de centrifugation est nécessaire, car une pression négative est créée par un simple retrait de la seringue lors de la collecte de l'échantillon. Les sondes du CUF combinés avec LC-MS ont réussi à identifier des protéines tryptique-digérés ^8-11. Dans cette étude, nous avons amélioré la technique d'échantillonnage d'ultrafiltration en créant une sucette en forme de l'ultrafiltration (LLUF) sonde qui peut facilement se glisser dans la cavité buccale humaine. L'analyse directe par LC-MS, sans digestion par la trypsine ont montré que la salive humaine contient localement des fragments peptidiques de nombreux dérivés de protéines différentes. L'échantillonnage de salive avec des sondes LLUF éviter une centrifugation mais efficacement éliminé de nombreuses protéines abondance grandes et hautes. Nos résultats de spectrométrie de masse a démontré que de nombreux peptides de faible abondance est devenue détectable après filtrage des plus grosses protéines avec des sondes LLUF. Détection des peptides de faible abondance de salive était indépendante de la séparation des échantillons en plusieurs étapes avec la chromatographie. Pour l'application clinique, les sondes LLUF incorporerd avec LC-MS pourrait être utilisé à l'avenir pour surveiller la progression de la maladie de la salive.

Protocole

1. Création de sondes LLUF

1. Les membranes en polyéthersulfone (2 cm ²⁾ ont été scellés avec des palettes en polypropylène triangle (Université de Californie, San Diego) par des membranes de collage avec de l'époxy sur les frontières de palettes. Une membrane chargée négativement polyéthersulfone ayant un poids moléculaire de coupure (MWCO) à 30 kDa a été utilisé.
2. Un tube de téflon d'éthylène-propylène fluoré (diamètre intérieur / diamètre extérieur, 0.35/0.50 cm) a été fixé à un cylindre de sortie d'une palette de polypropylène triangle la sonde LLUF peut être connecté à une seringue de 20 ml.
3. Après le trempage de la membrane polyéthersulfone dans la salive humaine dans une boîte de culture (50 mm de diamètre), une pression négative a été créée par le retrait d'une seringue. La seringue à pression négative a conduit le processus d'ultrafiltration pour l'échantillonnage des protéines de la salive.
4. Les sondes ont été stérilisés avec de l'alcool 70% pendant une nuit avant d'utiliser. Afin de démontrer une bonne étanchéité, nous avons positionné les sondes LLUF dans une solutiontion contenant du bleu dextran (50 mg / ml) avec une masse moléculaire moyenne de 2.000 kDa pour 2 h. L'absence de bleu dextran dans les échantillons prélevés ont indiqué que pas de fuites mis au point lors de la fabrication de la sonde et l'échantillonnage.

2. De prélèvement de salive

1. La salive entier ont été recueillis à partir de trois volontaires sains (deux mâles et une femelle entre les âges de 20 et 40) prenant aucun médicament, sans signes apparents de ⁶ gingivite ou des cavités.
2. Après rinçage de la bouche avec de l'eau, les échantillons de salive entiers ont été recueillies par cracher, sans stimulation chimique, dans un récipient refroidi à la glace.
3. Tous les échantillons ont été regroupés et conservés dans la glace au cours de la procédure de collecte.
4. Immédiatement après la collecte, de la salive (200 pi) a été appliqué pour l'échantillonnage avec des sondes LLUF. L'échantillonnage a été effectué à une 4 ° C d'ambiance.
5. Protéines de la salive (1,0 ug / ul) avec ou sans sonde LLUF collection ont été soumis directement à la nano-LC-masse sanalyse pectrometry sans digestion tryptique. Les concentrations de protéines ont été déterminées en utilisant un dosage de protéines Bio-Rad ^12.

3. NanoLC-LTQ analyse MS

1. Les échantillons de salive non digéré (5 pi) ont été chargés directement à la colonne piège du système Eksigent NanoLC par le passeur d'échantillons, en utilisant 100% de tampon A. (2% d'acide formique acetonitrile/0.1%) Le NanoLC a été en ligne couplé à un spectromètre de masse Finnigan LTQ.
2. Après l'échantillon de chargement et de lavage, la vanne a été changé et 500 nl / min dégradé linéaire a été livré à la trappe et la colonne de séparation (10 cm de longueur, 100 id um, en interne emballées avec Synergi 4 um C18). Le gradient est de 0 à 50% de tampon B (80% acetonitrile/0.1% d'acide formique) en 45 minutes.
3. Les instruments nanoLC-LTQ MS ont été opérés dans le mode de données dépend par Xcalibur. Spectres MS / MS des quatre ions forts MS-dessus d'une intensité de 1 × 10 ⁵ ont été recueillies à l'exclusion dynamiqueactivée et l'énergie de collision fixé à 35%.
4. Chaque échantillon a été exécuté deux fois par le système NanoLC-LTQ MS. Les échantillons provenant de trois préparations différentes ont été utilisées. Ces peptides détectables dans trois échantillons distincts ont été répertoriés dans les tableaux complémentaires 1 et 2. Représentant de NanoLC-LTQ spectres SM a été illustré à la figure 3.

4. Analyse des données et la recherche de base de données des protéines

1. Chaque fichier RAW a été converti en un fichier en utilisant mzXML Readw.exe.
2. Le fichier mzXML était entrée dans un système de SEQUEST Sorcerer 2 et fouillé contre une base de données humaine générée à partir du Centre national correspondant for Biotechnology Information (NCBI) base de données en utilisant des protéines non enzymatique spécificité. La tolérance de la masse de l'ion précurseur a été fixé à 1,5 Da. Un masse moléculaire de 16 Da à la méthionine a été ajouté pour la recherche différentielle pour tenir compte de l'oxydation.
3. Après la recherche SEQUEST, les résultats ont été automatiquement filtrés, validé und affiché par PeptideProphet et ProteinProphet [Institute for Systems Biology (ISB)]. PeptideProphet estime que la probabilité globale (P) note que l'assignation peptide est «correct» vs «incorrect» sur les bases de scores SEQUEST C'est (XCORR, ΔCn, Sp, RER) et des informations complémentaires de chaque séquence peptidique identifiée. ProteinProphet calculé un score de probabilité à partir 0 à 1 pour chaque protéine sur la base de peptides affectés à spectres MS / MS.
4. Afin de minimiser les fausses identifications positives, nous avons utilisé des critères stricts de filtrage. Tout d'abord, le seuil minimum de points P est fixé à 0,8 pour tout peptide accepté d'assurer erreur très faible (beaucoup moins de 3%) et la sensibilité raisonnablement bonne. Deuxièmement, tous les peptides avec> 0,8 score de P doit avoir élevé de corrélation croisée (XCORR) scores en même temps: 1.9, 2.2, et 3.0 pour +1, +2, et +3 de charge.

5. L'élimination des bactéries orales avec des sondes LLUF

1. Pour déterminer la capacité de sondes LLUF pour enlever leles bactéries buccales, la salive avant et après LLUF sonde de collecte (article 3) a été étalé sur des plaques d'agar pour la détection bactérienne.
2. Les bactéries aérobies ont été cultivés sur un antibiotique sans Lauria-Bertani plaque de gélose (LB) à 37 ° C pendant une journée.
3. Les bactéries anaérobies ont été cultivées sur une plaque sans antibiotique Brucella agar de bouillon (BD, Sparks, MD) dans des conditions anaérobies en utilisant du gaz-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) à 37 ° C pendant une journée.

6. Les résultats représentatifs

1. Fabrication de sondes d'échantillonnage et de la salive LLUF dans un environnement imité par voie orale

Si la salive d'échantillonnage peut être effectué que sucer une sucette, la procédure permettra d'éviter la dégradation de la salive crachée dans ^13-14 dispositifs de collecte. Surtout, il deviendra également possible de surveiller les patients de façon dynamique et localement à partir de cavités buccales. En outre, si la préparation des échantillons en utilisant la salive pourrait être simplifié, les cliniciens pourraient facilement faciliter la procédure afin d'accélérer leur décision sur l'opération suivante clinique. La spectrométrie de masse est l'une des techniques les plus sensibles pour détecter les protéines et même séquence dans un très court laps de temps. Cependant, la complexité des procédures de préparation des échantillons ont entravé l'utilisation de cette technique en clinique. En outre, il est connu que les protéines d'abondance supérieur ou protéines de haut poids moléculaire dans des échantillons cliniques (par exemple l'amylase dans la salive) des protéines de faible abondance dans masque l'analyse par spectrométrie de masse ^15-16. Pour surmonter les obstacles mentionnés ci-dessus, nous avons développé un dispositif d'ultrafiltration sucette en forme de nom de sondes LLUF (Figure 1). Une membrane chargée négativement polyéthersulfone avec un MWCO à 30 kDa (figure 1A, a) a été collé à une pale polypropylène (figure 1A, b). Il a été positionné en face de la sonde LLUF avec l'intention de filtrage plus protéines dans la salive. Pour imiter l'environnement humain par voie orale (Figure 1A, g), Une éponge (figure 1A, e) a été imprégné dans la salive dans une boîte de culture (figure 1A, f). Après le retrait de la seringue entièrement (figure 1A, d), la salive filtrée commencé à se déplacer le long d'un tube connecté (figure 1A, c) et a été recueillie.

2. Identification des peptidome salive indigène par NanoLC-LTQ MS

En comparant LC chromatogrammes, nous avons trouvé chromatogrammes distincts de la salive avant et après l'échantillonnage LLUF (Figure 2), indiquant qu'il ya des compositions différentes de protéines dans la salive après l'échantillonnage LLUF. Pour déterminer les compositions de protéines, nous avons utilisé la spectrométrie de masse LTQ-NanoLC qui est connu pour être en mesure de peptides de séquences promptement partir d'un mélange de protéines multiples. Plus important encore, pour simplifier la préparation des échantillons à des fins cliniques, de la salive entière sans produit chimique ou de la digestion enzymatique a été appliquée pour NanoLC-LTQ analyse MS. De façon inattendue, nous avons 131 peptidesre identifié dans la salive non digérés (Tableau complémentaire 1). Ces peptides sont des fragments provenant de diverses protéines riches en proline, l'actine, alpha amylase, globine alpha 1, bêta globine, histain 1, la kératine 1, la mucine 7, récepteur d'immunoglobuline polymérique, satherin, et S100A9. Vingt-six peptides uniques ont été identifiés dans la salive après filtrage avec des sondes LLUF (tableau complémentaire 2). Ces peptides sont des fragments principalement issus de diverses protéines riches en proline. Des peptides dérivés de protéines tels que le récepteur d'immunoglobuline polymérique (83.24 kDa) et alpha-amylase, étaient indétectables, ce qui démontre la capacité de sondes LLUF dans l'élimination des protéines plus grandes et abondantes. Un spectre MS / MS du peptide PFIAIHAEAESKL correspondant à un peptide interne de l'alpha-amylase est illustré dans la figure 3A. Très curieusement, après avoir enlevé les grandes protéines, 18 des 26 peptides séquencés est devenu détectable dans le LLUF sonde dans l'échantillon de salive (tableau1). Ces 18 peptides ont été tirées de protéines riches en proline ou des protéines hypothétiques qui se sont terminées avec une proline (P) -. Glutamine (Q) (-PQ),-SR,-SP ou PP-C-terminale figure 3B montre une MS / MS spectre du peptide PQGPPQQGGHPRPP qui a été détecté dans le LLUF sonde dans l'échantillon de salive. Le peptide peut être dérivée de la protéine riche en proline HaeIII sous-famille 1 et 2 (Tableau 1).

Figure 1. Compositions contenant des sondes d'échantillonnage LLUF et de salive humaine entier de reproduire cavité buccale du panneau A: (a) une polyéthersulfone semi-perméable avec un MWCO de 30 kDa, (b) une palette de polypropylène, (c) une téflon tube de fluoré d'éthylène-propylène; (d) une seringue de 20 ml Groupe B:. une éponge (e) (une languette mimée) sont trempés dans une boîte de culture (f) contenant la salive humaine pour créerune cavité buccale humaine artificielle (g). La pression négative créée par résultant entièrement retirer une seringue entraîne le fluide prélevé à se déplacer le long d'un tube connecté (flèche) et vers un espace créé (flèche) dans la seringue. Bar: 2,0 cm.

Figure 2. Différentiel de LC / MS / MS chromatogrammes de la salive avant et après l'échantillonnage. LLUF protéines (1,0 ug / ul) dans la salive humaine tout entière ont été filtrées avec ou sans une sonde LLUF. Protéines sans digestion tryptique ont été directement soumis à NanoLC-LTQ MS qui était conjugué avec un système de Eksigent Nano LC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les chromatogrammes de base-pointe (avec des temps de rétention de 44 mim) de la salive avant (A) et après (B) d'échantillonnage LLUF ont été illustrés.

Figure 3. Detection de la salive par des protéines peptidome MS NanoLC-LTQ salive séquençage. avant (A) et après (B) avec des sondes d'échantillonnage LLUF ont été analysés par NanoLC-LTQ MS comme décrit dans des procédures expérimentales. Peptidome salive provenant de la salive humaine naturelle, sans digestion tryptique a été démontré dans les tableaux complémentaires 1 et 2. Un peptide (PFIAIHAEAESKL) dérivé de l'alpha-amylase a été exclusivement détectée dans un échantillon de salive sans la collecte avec des sondes LLUF (A), ce qui montre que la capacité de sondes LLUF dans l'élimination des protéines de grande taille. De nombreux peptides avec-PQ,-SR,-SP ou PP-C-terminales étaient uniquement dans les échantillons après les sondes LLUF ultrafiltration. Un (PQGPPQQGGHPRPP) de peptides issus de diverses protéines riches en proline ont été présentés (B). Spectres MS / MS avec la caractéristique "y" et les ions série «B» a confirmé les identités des deux peptides.

Figure 4. Enlèvement des bactéries orales en utilisant des sondes au cours LLUF. Une sonde a été construite LLUF comme décrit dans Matériels et méthodes. La sonde a été positionnée dans la salive humaine dans un environnement imité orale (figure 1). La seringue à la fin de LLUF sonde a été retirée pour créer une pression négative qui a conduit le processus d'ultrafiltration pour l'échantillonnage de salive. Lors de l'échantillonnage, la salive ensemble traversé de manière sélective à travers la membrane polyéthersulfone et accumulée à l'intérieur d'une seringue. La salive en entier avant de l'échantillonnage avec une sonde LLUF a servi de témoin. La salive (10 pi) avant et après LLUF sonde de prélèvement a été étalé sur des plaques d'agar pour la détection bactérienne Groupe A:. Salive avec (+ LLUF) et sans (+ LLUF) LLUF sonde de prélèvement a été étendue côte à côte sur un antibiotique sans plaque de gélose LB à 37 ° C pendant une journée Panel B:. salive avec et sans LLUF sonde de prélèvement a été étalé sur une plaque sans antibiotique Brucella agar de bouillondans des conditions anaérobies en utilisant du gaz-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) à 37 ° C pendant une journée. Les bactéries ne poussent pas sur les plaques d'agar répartis avec LLUF sonde dans l'échantillon de salive, ce qui démontre la capacité de sondes LLCF dans l'élimination aérobie ainsi que les bactéries anaérobies orales. Bar: 1,0 cm.

	Séquence peptidique / masse des peptides mesurée	Numéro d'accès	Nom
1	AGNPQGPSPQGGNKPQ GPPPPPGKPQ 2485,3	gi | 41349484	Proline-protéine riche en sous-famille des BstNI une isoforme 2 précurseur
		gi | 41349482	Proline-protéine riche en sous-famille des BstNI une isoforme 1 précurseur
		gi | 60301553	Proline-protéine riche en BstNI sous-famille des deux
2	GGHQQGPPPPPPGKPQ 1576,9	gi | 4826944	Proline-protéine riche en HaelII sous-famille 2
		gi | 9945310	Proline-protéine riche en HaelII sous-famille 1
3	GPPPAGGNPQQPQAPPA GKPQGPPPPPQGGRPP 3126,2	gi | 37537692	Proline-protéine riche en sous-famille des BstNI 4 précurseur
4	GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ 2028,3	gi | 113423660	PRÉVISIONS: protéine hypothétique
5	GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP 2077,8	gi | 113423262	PRÉVISIONS: isoforme de protéine hypothétique 5
		gi | 41349482	Protéines riches en proline BstSous-famille des Ni 1 isoforme 1 précurseur
		gi | 60301553	Proline-protéine riche en BstNI sous-famille des deux
		gi | 113423663	PRÉVISIONS: protéine hypothétique
		gi | 41349484	Proline-protéine riche en sous-famille des BstNI une isoforme 2 précurseur
		gi | 41349486	Proline-protéine riche en sous-famille des BstNI une isoforme 3 précurseur
6	GPPPPPPGKPQGPPPQ GGRPQGPPQGQSPQ 2918,5	gi | 9945310	Proline-protéine riche en HaelII sous-famille 1
7	GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ 2131,3	gi | 113423660	PRÉVISIONS: protéine hypothétique
8	GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ 2030	gi | 113423663	PRÉVISIONS: protéine hypothétique
		gi | 41349482	Proline-protéine riche en sous-famille des BstNI une isoforme 1 précurseur
		gi | 113423262	PRÉVISIONS: isoforme de protéine hypothétique 5
		gi | 60301553	Proline-protéine riche en BstNI sous-famille des deux
9	GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ 1866,6	gi | 4826944	Proline-protéine riche en HaelII sous-famille 2
10	GPPQQGGHPPPPQGRPQ 1713,8	gi | 9945310	Proline-protéine riche en HaelII sous-famille 1
		gi | 4826944	Proline-protéine riche en HaelII sous-famille 2
11	GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ 2083,1	gi | 9945310	Proline-protéine riche en HaelII sous-famille 1
		gi | 4826944	Proline-protéine riche en HaelII sous-famille 2
12	GRPQGPPQQGGHQQGP PPPPPGKPQ 2512,6	gi | 4826944	Proline-protéine riche en HaelII sous-famille 2
		gi | 9945310	Proline-protéine riche en HaelII sous-famille 1
13	NKPQGPPPPGKPQGPP PQGGSKSRSSR 2720,2	gi | 113423262	PRÉVISIONS: isoforme de protéine hypothétique 5
		gi | 113423663	PRÉVISIONS: hyprotéines pothetical
14	PQGPPQQGGHPRPP 1450,1	gi | 9945310	Proline-protéine riche en HaelII sous-famille 1
		gi | 4826944	Proline-protéine riche en HaelII sous-famille 2
15	QGRPQGPPQQGGHPRPP 1791,1	gi | 4826944	Proline-protéine riche en HaelII sous-famille 2
		gi | 9945310	Proline-protéine riche en HaelII sous-famille 1
16	SPPGKPQGPPPQ 1186,9	gi | 113423262	PRÉVISIONS: isoforme de protéine hypothétique 5
		gi | 41349482	Proline-protéine riche en sous-famille des BstNI une isoforme 1 précurseur
		gi | 60301553	Proline-protéine riche en BstNI sous-famille des deux
		gi | 113423663	PRÉVISIONS: protéine hypothétique
		gi | 41349484	Proline-protéine riche en sous-famille des BstNI une isoforme 2 précurseur
		gi | 41349486	Proline-protéine riche en sous-famille des BstNI une isoforme 3 précurseur
17	SPPGKPQGPPPQGGNQ PQGPPPPPGKPQ 2720,3	gi | 113423663	PRÉVISIONS: protéine hypothétique
		gi | 41349482	Proline-protéine riche en sous-famille des BstNI une isoforme 1 précurseur
		gi | 113423262	PRÉVISIONS: isoforme de protéine hypothétique 5
		gi | 60301553	Proline-protéine riche en BstNI sous-famille des deux
18	SPPGKPQGPPQQEGNKPQ 1870,9	gi | 37537692	Proline-protéine riche en sous-famille des BstNI 4 précurseur

Peptides Tableau 1. Étaient exclusivement détectable dans des échantillons prélevés sur LLUF.

Tableau supplémentaire 1. Cliquez ici pour voir le tableau 1 supplémentaire .

Tableau complémentaire 2. Cliquez ici pour voir le tableau complémentaire 2 .

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Discussion

Nous avons constaté que de nombreux fragments peptidiques existent dans la salive humaine non digérée. Ces fragments peptidiques sont des dérivés de diverses formes de protéines riches en proline, l'actine, alpha amylase, globine alpha 1, bêta globine, histain 1, la kératine 1, la mucine 7, récepteur d'immunoglobuline polymérique, satherin, S100A9. Il pourrait y avoir de nombreux facteurs qui contribuent à la production de peptides avec des sites de clivage indéterminées. Par exemple, certains fragm...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Le numéro de catalogue	Commentaires
Membranes en polyéthersulfone	Pall Corporation		30 kDa MWCO
Tube Téflon éthylène-propylène fluoré	Upchurch Scientific
Bleu dextran	Sigma
Nano LC système	Eksigent
Colonne C18 piège	Agilent	5065-9913
Spectromètre de masse LTQ linéaire ions piège	Thermo Fisher
Sorcerer 2	Sage-N Research
Acétonitrile 0,1% d'acide formique	JT Baker	9832-03	LC / MS de qualité
De l'eau-de 0,1% d'acide formique	JT Baker	9834-03	LC / MS de qualité