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要約

将来の臨床応用のための唾液採取を考慮して、ロリポップのような限外濾過（LLUF）プローブは、ヒトの口腔内に収まるように作製した。ナノLC-LTQ質量分析法による消化唾液の直接分析は、大規模なタンパク質や高濃度タンパク質を除去し、低豊富なペプチドは多くの検出可能なようにするLLUFプローブの能力を実証した。

要約

ヒト唾液プロテオームとペプチドーが1-2を明らかにされているが、それらはすぎなかったトリプシン唾液タンパク質の消化物から同定された。外因性の酵素による事前消化せずにヒト唾液の先住民族ペプチドーの同定は、ヒト唾液でネイティブペプチドが疾患の進行を予測し、治療効果を監視し、病気を診断するための潜在的な値を提供するので、必須となります。適切なサンプリングは、人間の土着の唾液ペプチドーの識別の強化のための重要なステップです。 3から4の残骸を削除するには、遠心分離を含むヒト唾液をサンプリングする従来の方法は時間がかかりすぎるの臨床使用のために適用可能であることかもしれません。さらに、遠心分離による瓦礫撤去は、感染した病原体のほとんどをきれいにし、多くの場合、低濃度のペプチドーの識別を妨げる高濃度タンパク質を除去することができない場合があります。

PRI、従来のプロテオミクス的手法marilyゲル内消化との結合の二次元ゲル電気泳動（2-DE）ゲルは多くの唾液タンパク質の5-6を識別することができる利用しています。しかし、このアプローチは、一般的に低濃度のペプチド/タンパク質を検出するのに十分な小文字は区別されません。液体クロマトグラフィー - 質量分析（LC-MS）ベースのプロテオミクス前の2-DE分離することなくタンパク質を識別することができる代替手段です。このアプローチは、より高い感度を提供していますが、それは一般的に臨床使用が困難になってトリプシンと以前のサンプルプレ分画7とプレ消化を必要とします。

サンプル調製のために質量分析の妨害を回避するために、我々は、キャピラリ限外濾過（CUF）プローブ8から11と呼ばれる技術を開発しました。我々の研究室からのデータは、CUFプローブは、ダイナミックかつ低侵襲な方法8の動物の様々な微小環境から、生体内でタンパク質を捕捉することが可能であることを実証-11。負圧は、サンプル収集中に撤退単に注射器によって作成されているので全く遠心分離は必要ありません。 LC-MSを組み合わせたCUFプローブが成功したトリプシン消化し ​​たタンパク質の8-11を同定した。本研究では、簡単に人間の口腔内に収まることができロリポップのような限外濾過（LLUF）プローブを作成することにより、限外ろ過サンプリング技術をアップグレードしました。トリプシン消化せずにLC-MSによる直接分析では、国産ヒト唾液は様々なタンパク質に由来する多くのペプチド断片が含まれていることを示した。 LLUFプローブと唾液をサンプリングする遠心分離を避けますが、効果的に多くの大規模、高濃度タンパク質を除去。私たちの質量分析の結果は、多くの低濃度のペプチドはLLUFプローブで大きなタンパク質をフィルタリングした後に検出されなったことを示す。低濃度の唾液ペプチドの検出は、クロマトグラフィーを持つ複数のステップのサンプルの分離独立していた。臨床応用のために、LLUFプローブが組み込まれてLC-MSとdが潜在的に唾液から疾患の進行を監視するために、将来的に使用することができます。

プロトコル

1。 LLUFプローブの作成

  1. ポリエーテルスルホン膜（2 cm 2の ） はパドルの境界線上にエポキシ樹脂接着膜により三角形のポリプロピレン製パドル（カリフォルニア大学サンディエゴ校）で密封した。 30 kDaの分子量カットオフ（MWCO）と負に帯電したポリエーテルスルホン膜を用いた。
  2. LLUFプローブは20 mlの注射器に接続することができますので、テフロンフッ素化エチレンプロピレンチューブ（内径/外径、0.35/0.50 cm）の三角形のポリプロピレンパドルのシリンダの出口に取り付けた。
  3. 培養皿（直径50mm）にヒト唾液中にポリエーテルスルホン膜を浸漬した後、負圧が注射器を取り出すことにより作成されました。負圧と注射器は、唾液からタンパク質をサンプリングするための限外ろ過プロセスを運転した。
  4. プローブは使用する前に、一晩70％アルコールで滅菌した。適切なシールを実証するために、我々触構造にLLUFプローブを配置し2時間2,000 kDaの平均分子量とブルーデキストラン（50 mg / ml）を含むる。採取した試料のブルーデキストランの不在は、漏れは、プローブの作製、サンプリング中に開発されないことを示した。

2。唾液コレクション

  1. 全唾液は6歯肉炎や虫歯のない明白な徴候で、全く薬を服用していない3つの健康なボランティア（年齢20〜40の間に2つの男性と一人の女性）から採取した。
  2. 水で口をすすいだ後、唾液サンプルは氷冷した容器に、化学的刺激なしで、唾によって収集された。
  3. すべてのサンプルが収集手順の実行中にプールし、そして氷上で保持した。
  4. すぐに収集した後、唾液（200μl）をLLUFプローブとサンプリングを適用した。サンプリングは4℃の部屋で行った。
  5. LLUFプローブコレクションの有無に関わらず唾液タンパク質は、（は1.0μg/μl）を直接ナノLC-マスsに行ったトリプシン消化せずにpectrometry分析。タンパク質濃度は、Bio-Radタンパク質アッセイ12を用いて測定した。

3。ナノLC-LTQ MS分析

  1. 非消化唾液サンプル（5μl）を直接（2％アセトニトリル％ギ酸）100％のバッファを使用して、オートサンプラでEksigentナノLCシステムのトラップカラムにロードされていました。ナノLCをオンラインでフィニガンLTQ質量分析計を結合させた。
  2. サンプルがロードおよび洗浄した後、バルブを切り替えていた、500 NL / minの線形勾配はトラップと分離カラム（長さ10cm、100μmのID、社内でSynergi4μmのC18を充填）に配信されました。勾配は0〜50％の緩衝液B（80％アセトニトリル％ギ酸）から45分であった。
  3. ナノLC-LTQ MS機器はXcaliburすることにより、データ依存モードで動作しました。 1×10 5の強さ上記4最強のMSイオンのMS / MSスペクトルは、動的な除外で収集された有効になっており、衝突エネルギーは35％に設定。
  4. 各サンプルは、ナノLC-LTQ MSシステムで二回実行されました。 3つの別々の製剤からのサンプルを使用した。 3つの別々のサンプルで検出可能なもののペプチドは、 補足表1および表2に記載されていた。ナノLC-LTQ MSスペクトルの代表は、 図3に示された。

4。データ解析とタンパク質のデータベース検索

  1. 各RAWファイルはReadw.exeを使用してmzXMLファイルに変換されました。
  2. mzXMLファイルがSEQUESTソーサラー2システムに入力されたバイオテクノロジー情報（NCBI）の非酵素特異性を用いたタンパク質データベースに対応するナショナルセンターから生成された人間のデータベースに対して検索されます。プリカーサイオンの質量の許容差は、1.5ダで設定されていました。 16 Daの分子量は、酸化のためのアカウントへの差を検索するためのメチオニンに追加されました。
  3. SEQUESTの検索後、結果が自動的に検証され、ろ過したD PeptideProphetとProteinProphet [システムバイオロジー研究所（ISB）]で表示されます。 PeptideProphetは、ペプチドの割り当てはそれSEQUESTスコア（xcorrは、ΔCn、SP、RSP）と同定された各ペプチド配列の追加情報の拠点に "正しい"と "正しくない"であることを包括的な確率（P）スコアを推定します。 ProteinProphetは、MS / MSスペクトルに割り当てられたペプチドに基づいて、各タンパク質の1から0に確率スコアを計算した。
  4. 偽陽性の識別を最小限に抑えるために我々は、厳格なフィルタ基準を使用していました。まず、最低限のP得点のカットオフは非常に低いエラー（多くは3％未満）と合理的に良好な感度を確保するための任意の受け入れペプチドを0.8に設定されています。 1.9 1 2.2、3.0、+2、+3料金：秒、> 0.8 Pのスコアを持つすべてのペプチドは、高い相互相関（xcorrを）同時にスコアを持っている必要があります。

5。 LLUFプローブによる口腔細菌の除去

  1. 削除するには、LLUFプローブの能力を決定するために、口腔内細菌、LLUFプローブコレクション（セクション3）の前後に唾液は、細菌を検出するための寒天プレート上に広げた。
  2. 好気性細菌は、一日のために37℃で、抗生物質フリーラウリア - ベルターニ（LB）寒天プレート上で生育させた。
  3. 嫌気性細菌は、一日37℃でガスパックを（BD Biosciences社、カリフォルニア州サンノゼ）を使用して、嫌気的条件下で抗生物質フリーブルセラブロス寒天プレート（BD、火花、MD）上で生育させた。

6。代表的な結果

1。模倣口腔環境でLLUFプローブとサンプリング唾液の作製

サンプリング唾液はロリポップを吸うようにして行うことができる場合、プロシージャは、収集デバイス13-14にspitted唾液の劣化を避けることができます。重要なのは、それはまた、口腔内から動的に、ローカルで患者を監視することが可能になります。唾液を用いた試料調製を簡略化することができればさらに、臨床医は、簡単にfacilう次の臨床操作上の意思決定を促進するための手順を実行しitate。質量分析は、時間の非常に短い期間で検出し、さらに配列の蛋白質に最も敏感な技術の一つである。ただし、サンプル調製のための複雑な手順は、診療所でこの手法を使用して妨げている。さらに、マスク低濃度のタンパク質は、質量分析15-16に（唾液中のアミラーゼなど）臨床サンプル中の高分子量で高い豊富な蛋白質や蛋白質が知られている。上記のハードルを克服するために、我々はLLUFプローブ（ 図1）という名前のロリポップのような限外濾過装置を開発しました。 30kDaの（ 図1A、1）のMWCOと負に帯電したポリエーテルスルホン膜がポリプロピレンパドル（ 図1A、B）に釘付けになった。それは唾液中に大きなタンパク質をフィルタリングすることを意図してLLUFプローブの前面に配置されました。ヒト口腔環境（ 図1A、Gを模倣する）、スポンジ（ 図1A、e）は培養皿（ 図1A、f）に唾液中に浸漬した。完全に注射器（ 図1A、d）を撤回した後、濾過し、唾液は、接続管（ 図1A、C）に沿って移動開始し、収集した。

2。ナノLC-LTQ MSによる土着の唾液ペプチドーの同定

LCクロマトグラムを比較すると、我々はLLUFサンプリング後の唾液中の異なるタンパク質の組成があることを示す、LLUFサンプリング（ 図2）の前後に唾液の個別のクロマトグラムを発見した。タンパク質組成を決定するために、我々は、複数のタンパク質混合物から速やかに配列のペプチドできることが知られているナノLC-LTQ質量分析法を採用しています。さらに重要なことは、臨床目的のための試料調製を簡素化するために、化学的または酵素消化せずに全唾液は、ナノLC-LTQ MS分析に適用した。不意に、131ペプチド我々再消化唾液（ 補足表1）で識別される。これらのペプチドは、様々なプロリンリッチタンパク質、アクチン、α-アミラーゼ、α1グロビン、βグロビン、histain 1、ケラチン1、ムチン7、高分子免疫グロブリン受容体、satherin、およびS100A9から派生した断片である。二十六ユニークなペプチドはLLUFプローブ（ 補足表2）でフィルタリングした後に唾液中に同定された。これらのペプチドは、主に様々なプロリンリッチタンパク質から派生した断片である。このようなポリマー免疫グロブリン受容体（83.24 kDa）とα-アミラーゼなどのタンパク質由来のペプチドは、大規模と豊富なタンパク質の除去LLUFプローブの能力を実証し、検出されなかった。 α-アミラーゼの内部ペプチドに対応するPFIAIHAEAESKLペプチドのMS / MSスペクトルは、 図3Aに示されています。最も興味深いことに、大きなタンパク質を除去した後、26塩基配列のペプチドの18 LLUFプローブサンプリング唾液（ 表で検出可能になりました1）。これらの18のペプチドは、プロリン（P）で終わったプロリンリッチタンパク質または仮想タンパク質から派生した-グルタミン（Q）（-PQ）、-SR、-SPまたは-PP C末端図3Bは、MS / MSを示したLLUFプローブサンプリング唾液で検出されたPQGPPQQGGHPRPPペプチドのスペクトル。ペプチドは、プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー1と2（ 表1）に由来することができます。

figure-protocol-4898
図1。 LLUFプローブと人間の口腔内を模倣から全唾液のサンプリングの組成物 パネル：（1）30 kDaのMWCOを持つ半透性ポリエーテルと、（b）ポリプロピレンパドルと、（c）テフロンフッ素化エチレンプロピレンチューブ。 （d）に20 mlの注射器パネルB：スポンジ（E）（模倣舌）を作成するためにヒト唾液を含む培養皿（F）に浸漬した人工的な人間の口腔（g）を得た。完全にシリンジを取り出すことにより作成された結果の負圧は、シリンジ内で接続管（ 矢印 ）に沿って作成された領域（ 矢印 ）に向かって移動するには収集された流体を駆動します。バー：2.0センチメートル。

figure-protocol-5400
図2。 LLUFサンプリング前と後の唾液の差動LC / MS / MSクロマトグラムタンパク質（は1.0μg/μl）のヒト全唾液ではなく、またはLLUFプローブでろ過した。トリプシン消化せずにタンパク質は、直接材料と方法に記載されEksigentナノLCシステムと結合させたナノLC-LTQ MSに供した。唾液のベースピーククロマトグラム（44-MIMの保持時間を含む）の前に（）と後（B）LLUFサンプリングが示された。

figure-protocol-5731
図3。 DetecナノLC-MS LTQシーケンシングによって唾液ペプチドーのる。唾液タンパク質の前に（）と後（B）LLUFプローブとサンプリングは、実験方法に記載のナノLC-LTQ MSで分析した。トリプシン消化せずに自然な人間の唾液から派生した唾液ペプチドーは、 補足表1と表2に示されました。 α-アミラーゼに由来するペプチド（PFIAIHAEAESKL）が排他的に大規模なタンパク質を除去するのにLLUFプローブのその能力を示す、LLUFプローブ（）を使用してコレクションすることなく唾液サンプルで検出された。 -PQ多くのペプチドは、-SR、-SPまたは-PP C-末端は、限外ろ過LLUFプローブ後のサンプルではもっぱらでした。様々なプロリンリッチタンパク質由来のペプチドのいずれか（PQGPPQQGGHPRPP）は（B）が示された。特性は "y"と "b"シリーズイオンとMS / MSスペクトルは、両ペプチドのアイデンティティを確認した。

figure-protocol-6304
<強い>図4。LLUFプローブの間に使用し口腔内細菌の除去。材料および方法に記載されLLUFプローブを構築した。プローブは真似口腔環境（ 図1）内にヒト唾液中に配置された。 LLUFプローブの端にシリンジは唾液採取のための限外ろ過プロセスを運転した負圧を作成するために撤回された。サンプリング中、唾液には、ポリエーテルスルホン膜を介して選択的に交差させ、注射器の内部に蓄積された。 LLUFプローブによるサンプリングする前に全唾液には、コントロールを務めた。 LLUFプローブのサンプリング前と後の唾液（10μl）を細菌検出用寒天プレート上に広げたパネル 。と（+ LLUF）とせずに唾液（+ LLUF）LLUFプローブのサンプリングは、抗生物質フリーでサイド·バイ·サイドを広げた37℃でLB寒天プレート°C一日のためにパネルB：LLUFプローブのサンプリングの有無にかかわらず唾液は抗生物質フリーブルセラブロス寒天プレート上に広げました一日37℃でガスパックを（BD Biosciences社、カリフォルニア州サンノゼ）を使用して、嫌気的条件下で。細菌は好気性と同様に嫌気性口腔内細菌を排除することにLLCFプローブの能力を実証し、LLUFプローブサンプリング唾液で広がって寒天プレート上で成長していませんでした。バー：1.0センチメートル。

ペプチド配列/測定ペプチドの質量 受入番号 名
1 AGNPQGPSPQGGNKPQ
GPPPPPGKPQ
2485.3 		GI | 41349484 プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー1イソ型2前駆体
GI | 41349482 プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー1アイソフォーム1前駆体
GI | 60301553 プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー2
2 GGHQQGPPPPPPGKPQ
1576.9 		GI | 4826944 プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー2
GI | 9945310 プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー1
3 GPPPAGGNPQQPQAPPA
GKPQGPPPPPQGGRPP
3126.2 		GI | 37537692 プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー4前駆体
4 GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ
2028.3 		GI | 113423660 予測：仮想タンパク質
5 GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP
2077.8 		GI | 113423262 予測：仮想タンパク質アイソフォーム5
GI | 41349482 プロリンリッチタンパク質のBstNIサブファミリー1アイソフォーム1前駆体
GI | 60301553 プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー2
GI | 113423663 予測：仮想タンパク質
GI | 41349484 プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー1イソ型2前駆体
GI | 41349486 プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー1アイソフォーム3前駆体
6 GPPPPPPGKPQGPPPQ
GGRPQGPPQGQSPQ
2918.5 		GI | 9945310 プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー1
7 GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ
2131.3 		GI | 113423660 予測：仮想タンパク質
8 GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ
2030 		GI | 113423663 予測：仮想タンパク質
GI | 41349482 プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー1アイソフォーム1前駆体
GI | 113423262 予測：仮想タンパク質アイソフォーム5
GI | 60301553 プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー2
9 GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ
1866.6 		GI | 4826944 プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー2
10 GPPQQGGHPPPPQGRPQ
1713.8 		GI | 9945310 プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー1
GI | 4826944 プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー2
11 GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ
2083.1 		GI | 9945310 プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー1
GI | 4826944 プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー2
12 GRPQGPPQQGGHQQGP
PPPPPGKPQ
2512.6 		GI | 4826944 プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー2
GI | 9945310 プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー1
13 NKPQGPPPPGKPQGPP
PQGGSKSRSSR
2720​​.2 		GI | 113423262 予測：仮想タンパク質アイソフォーム5
GI | 113423663 予測：HYpotheticalタンパク質
14 PQGPPQQGGHPRPP
1450.1 		GI | 9945310 プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー1
GI | 4826944 プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー2
15 QGRPQGPPQQGGHPRPP
1791.1 		GI | 4826944 プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー2
GI | 9945310 プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー1
16 SPPGKPQGPPPQ
1186.9 		GI | 113423262 予測：仮想タンパク質アイソフォーム5
GI | 41349482 プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー1アイソフォーム1前駆体
GI | 60301553 プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー2
GI | 113423663 予測：仮想タンパク質
GI | 41349484 プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー1イソ型2前駆体
GI | 41349486 プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー1アイソフォーム3前駆体
17 SPPGKPQGPPPQGGNQ
PQGPPPPPGKPQ
2720​​.3 		GI | 113423663 予測：仮想タンパク質
GI | 41349482 プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー1アイソフォーム1前駆体
GI | 113423262 予測：仮想タンパク質アイソフォーム5
GI | 60301553 プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー2
18 SPPGKPQGPPQQEGNKPQ
1870.9 		GI | 37537692 プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー4前駆体

表1ペプチドは、LLUF、収集されたサンプルで排他的に検出可能であった。

補足表1。 補足表1を見るにはここをクリック 。

補足表2。 補足表2を見るにはここをクリック 。

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ディスカッション

我々は、多くのペプチドフラグメントは、人間の消化唾液中に存在することを発見した。これらのペプチド断片は、プロリンリッチタンパク質、アクチン、α-アミラーゼ、α1グロビン、βグロビン、histain 1、ケラチン1、ムチン7、高分子免疫グロブリン受容体、satherin、S100A9の様々なフォームからの誘導体である。未定の切断部位を有するペプチドの生産に貢献する多くの要因があるかもしれ?...

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開示事項

利害の衝突が宣言されません。

謝辞

この作品は、健康補助金の国立研究所（R01-AI067395-01、R21-R022754-01、およびR21-I58002-01）によってサポートされていました。私たちは、原稿の重要な読書のためにC.ニーマイヤーに感謝します。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
試薬の名前 会社 カタログ番号 コメント
ポリエーテルスルホン膜ポール·コーポレーション 30kDaのMWCO
テフロンフッ素化エチレンプロピレン管アップチャーチ科学
ブルーデキストランシグマ
ナノLCシステム Eksigent
C18トラップカラムアジレント 5065-9913
LTQリニアイオントラップ型質量分析計サーモフィッシャー
魔術師2 SAGE-N ReseaRchの
アセトニトリル0.1％ギ酸 JTベーカー 9832から03 LC / MSグレード
水0.1％ギ酸 JTベーカー 9834から03 LC / MSグレード

参考文献

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