LabVIEW fonctionnant Osmomètre nanolitre Novel des enquêtes de glace Binding Protein

Résumé

Protéines de liaison de glace (IBP), également appelées protéines antigel, inhiber la croissance de la glace et sont un additif prometteur pour une utilisation dans la cryoconservation des tissus. Le principal outil utilisé pour étudier IBP est le osmomètre nanolitre. Nous avons développé une maison conçue étape de refroidissement monté sur un microscope optique et contrôlé à l'aide d'une routine sur mesure LabVIEW. L'osmomètre nanolitre décrit ici manipulé la température de l'échantillon d'une manière ultra-sensible.

Résumé

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish¹, plants^{2, 3}, arthropods^{4, 5}, fungi⁶, and bacteria⁷. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested^8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears¹¹, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 °C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.

We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously^{9, 10}, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.

To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)¹². This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies' group (Queens University)¹⁰. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs^{5, 13}. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations^{14, 15}. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber¹³. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere¹⁶.

The Cold Stage System

The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 μm in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).

Protocole

0. Procédures préliminaires

1. Capillaire en verre pour injection de solution. Aide d'un extracteur capillaire (Narishige, Tokyo, Japon), préparer une pipette marquée avec une ouverture bien à partir d'un tube de verre capillaire micro (Marque GMBH, Wertheim, Allemagne). La taille de l'ouverture doit être vérifiée par le passage d'air à travers le capillaire d'obtenir bulles fines à l'eau claire. Si le capillaire est fermé, alors on peut l'ouvrir en brisant son bord. Cela peut être accompli en appuyant sur ou de la rayer doucement contre l'eau contenant parois du tube. Préparer le capillaire telle que l'ouverture est pratiquement bloquée, mais est suffisamment ouvert pour permettre la formation de bulles sous-millimétriques.
2. Nettoyage disque de cuivre. Soniquer les disques de cuivre pendant 10 min dans 0,1% Micro-90 savon (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, USA), puis laver avec de l'eau bidistillée. Introduire les disques dans un mélange isopropanol solution (technique) et soniquer à nouveau pendant 10 min. Nageoireallié, sécher les disques à l'aide de l'air filtré. Cette étape de nettoyage est essentiel pour éviter la contamination IBP entre les expériences.
3. Assemblage lamelle double couche. Un assemblage lamelle a été préparé pour permettre une observation de l'échantillon, sans condensation de l'humidité sur la surface du verre de couverture. Ceci a été réalisé en plaçant un Drierite (WA Hammond Drierite, Xenia, Ohio, Etats-Unis) de particules (2 mm de diamètre) entre deux lamelles qui ont ensuite été collés avec un pistolet à colle chaude. Cette configuration empêche la condensation qui pourrait bloquer la vue lorsque l'échantillon a été refroidi à des températures basses et supprimé la nécessité de souffler de l'air sec sur la fenêtre d'observation.

1. Phase de refroidissement Set-up

1. Connectez l'entrée du flux de l'eau et de sortie de l'étape de refroidissement à 4 mm de diamètre intérieur des tubes Tygon (Saint-Gobain, Paris, France), et connecter le tube d'entrée du débit d'eau à une pompe à eau.
2. Connecter un tube intérieur 4 mm de diamètre Tygon à l'entrée de l'étage de refroidissement to fournir de l'air sec. L'air est séché en utilisant une colonne en ligne Drierite.
3. Actionner les pompes à air et de l'eau. Notez que les éléments de refroidissement ne doit pas être exécuté sans un dissipateur de chaleur.
4. Allumez le régulateur de température, appareil photo, et la routine LabVIEW.

2. Préparation des échantillons

1. Placez une goutte de 4.3 pi d'huile d'immersion B (Cargille laboratoires, Cedar Grove, New Jersey, Etats-Unis) sur la face arrière d'un disque de cuivre de diamètre 7 mm avec 500 trous forés pm à travers le disque.
2. Placez le disque de cuivre sur la scène de refroidissement avec le côté huile d'immersion vers le bas.
3. Raccorder le tube capillaire (le bord émoussé) pour un diamètre de 0,7 mm Tygon tube intérieur relié à l'autre extrémité sur une seringue 2 ml en verre (Poulten-Graf, Wertheim, Allemagne).
4. Avant d'utiliser le tube capillaire, vérifier la petite ouverture du capillaire de sorte que l'ouverture est d'une taille appropriée (voir les procédures préliminaires).
5. Insérez lentement la glaart capillaire dans le tube d'échantillon préparé IBP protéines (2,4 uM Mp IBP-GFP dans 20 _mM de CaCl2 et 25 mM de Tris-HCl à pH 8, voir la référence ¹⁰ pour les détails de préparation) et retirer la seringue en verre jusqu'à ce que le capillaire en verre contient 0,1 pl de la solution de protéine.
6. Commencez l'enregistrement vidéo via le logiciel LabVIEW.
7. Insérer la pointe dans le capillaire en verre (contenant la solution de protéine) dans l'un des trous dans le disque de cuivre sur l'étage de refroidissement.
8. Tout en observant au microscope (Olympus, Tokyo, Japon, objectif 10x), soigneusement pénétrer dans la couche d'huile d'immersion avec la pointe capillaire en verre, puis appuyez sur la seringue en verre (très délicatement) afin de fournir une petite quantité (environ 10 nl) de la protéine solution pour créer une gouttelette à 200 um.
9. Couvrez le trou dans la phase de refroidissement avec l'ensemble lamelle double couche (voir les procédures préliminaires).

3. Mesure de l'activité TH

1. Préss sur le bouton de refroidissement et régler la température à -40 ° C.
2. Initialement, la gouttelette solution doit être limpide. A basse température, typiquement dans la gamme -30 ° C à -35 ° C, la couleur des gouttelettes changements, ce qui indique que la solution a été congelé. Immédiatement après le prélèvement a gelé, augmenter la température lentement jusqu'à ce que la glace commence à fondre en vrac. Une augmentation progressive de la température est nécessaire pour éviter le dépassement de la température qui pourrait se traduire par la fusion complète de l'échantillon.
3. Basculer vers un objectif 50x et commencer à faire fondre la glace en réglant la température. Ce réglage est interactif, et les étapes finales sont généralement effectuées à l'aide des mesures de température petits de 0,002 ° C. Continuer à faire fondre jusqu'à ce qu'un monocristal reste. La taille finale du cristal doit être d'environ 10 um. La plus haute température à laquelle la fusion a cessé est déterminé comme étant le point de fusion est déterminé avec précision et dans l'étape d'analyse vidéo plus tard.
4. Régler la température à quelques centièmes de degré Celsius en dessous du point de fusion du cristal et de commencer une rampe de température avec un retard de 10 min. Ajuster le taux de rampe comme vous le souhaitez. Pendant ce temps, le cristal sera exposée aux IBP.
5. À la fin du temps de 10 min d'exposition, la température diminuera automatiquement sous le contrôle de la routine LabVIEW.
6. Observer la forme cristalline que la température diminue. À un certain moment, l'explosion soudaine du cristal de glace peuvent être observés. La température à laquelle cela se produit est à noter que la température éclat de cristal.
7. Utiliser l'analyse vidéo afin de déterminer le point de fusion et la température exacte d'éclatement. Tout d'abord, en utilisant l'analyse vidéo, trouver le point de fusion précis. Rappelons que la plus haute température à laquelle la fusion a cessé est déterminé comme étant le point de fusion. Documentez ce point de fusion dans un tableur. Ensuite, déterminer la température du cristal précise rafale, et documenter cette valeurainsi. La différence entre le point de fusion et le point de congélation, ou la température éclatement de cristal, est l'activité d'hystérésis thermique de la solution IBP.

4. Mesure de l'activité TH en fonction du temps

1. Suivre le protocole décrit dans les sections 3.1 à 3.3 pour préparer un monocristal de glace.
2. Après la formation de la glace, le temps de retard de la rampe comme vous le souhaitez, et tourner sur la rampe.
3. La température sera réduite à un taux fixe (en fonction des besoins des opérateurs) automatiquement une fois le temps de retard rampe est passée.
4. Documenter la température à laquelle se produit la rupture de cristal. Calculer le temps d'exposition (le temps entre la formation des cristaux et la salve de cristal).
5. Répéter l'expérience pour divers temps de retard et tracer l'activité TH en fonction de la durée d'exposition pour évaluer la dépendance temporelle de l'activité TH.

Résultats

Mesure de la dépendance temporelle TH

L'osmomètre nanolitre LabVIEW fonctionnant facilite l'exécution des mesures précises de l'activité TH. Le taux de réduction à température constante permet la mesure de la dépendance temporelle TH. Le contrôle précis de la température activée par l'osmomètre nanolitre était crucial pour ces expériences. Le temps d'exposition d'un cristal de glace à l'IBP en solution est définie comme étant la période de temps à partir de la formation de la glace (la fin du processus de fusion) jusqu'à ce que la croissance brusque de la glace autour du cristal (cristaux rafale). Nous avons constaté que le temps d'exposition des cristaux de glace à l'IBP cruciale affecté l'activité TH. De courtes périodes d'exposition IBP (quelques secondes) produit une activité TH bas dans le Mp IBP-GFP solution (2,4 uM) (Figure 5). L'activité TH augmente avec le temps d'exposition IBP jusqu'à ce qu'il atteigne un plateau à 4 min IBP exposition. À des concentrations plus élevées IBP, la plaqueau a été atteint à des temps plus courts.

IBP Figure 1. Schéma illustrant adsorbé sur de la glace. Adoptée avec la permission de ^10.

Figure 2. L'étape de refroidissement. A) reliés à des tubes sur le microscope. B) Sans plomb supérieure. Schéma C).

Figure 3. Capture d'écran de l'interface de LabVIEW. Click ici pour agrandir la figure.

Figure 4. Graphique Stabilité de la température. Le régulateur de température a été fixé pour abaisser la température de 0,01 ° C toutes les 15 secondes.

Figure 5. Activité Mp TH IBP en fonction du temps d'exposition pour les cristaux de glace IBP. Chaque point est la moyenne de temps de 3-6 expériences.

Discussion

Ce travail démontre le fonctionnement d'un osmomètre nanolitre commandé par ordinateur qui permet des mesures précises de l'activité TH avec contrôle de la température extraordinaire. Dans tout système sensible à la température, les gradients de température indésirables doivent être évitées. Afin d'éviter des gradients de température dans l'appareil présenté ici, la gouttelette de solution d'essai doit être positionné au centre d'un trou dans la phase de refroidissement en cuivre disque (étape 2,7). En outre, le cristal unique devrait être au centre de la goutte plutôt que près des bords (dans la plupart des cas, cela se produira spontanément). La dépendance temporelle décrite indique que la vitesse de refroidissement peuvent influencer les lectures TH. Ainsi, on propose notamment un rapport de la durée pendant laquelle le cristal a été exposée à la solution avant le refroidissement, ainsi que la vitesse de refroidissement. En général, nous a attendu 10 minutes avant de la décélération de la température de 0,01 ° C chaque étapes 4 sec.

Les co-contrôlées LabVIEWOling étape a été adapté pour être utilisé avec un microscope inversé sur lequel des dispositifs microfluidiques peuvent être manipulés thermiquement. Ce système facilite la réalisation d'expériences d'échange de solutions impliquant des cristaux de glace et IBPS taggés avec eGFP ^{9, 10, 16.} Le système à commande LabVIEW peut être adapté à un stade Clifton en connectant le contrôleur de température 3040 par l'intermédiaire d'un circuit électrique désigné adaptation. Un tel système est utilisé dans le laboratoire Davies ^17. Le logiciel LabVIEW et l'adaptation désigné conception de circuit électrique pour la phase de Clifton sont disponibles sur demande.

En conclusion, nous décrivons un osmomètre nanolitre qui facilite le contrôle et la manipulation sensible de la température et le taux d'augmentation de la température et une diminution (avec 0,002 ° C de sensibilité), en coordination avec une interface vidéo à travers une routine LabVIEW pour analyse en temps réel. Ce système peut effectuer reproductibles taux contrôlées par des expériences qui sont important pour enquêter sur la cinétique des interactions IBP avec de la glace. De telles expériences peuvent répondre à plusieurs questions débattues à long entourant le mécanisme d'action de IBP.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue / modèle	Commentaires
Huile à immersion de type B	Laboratoires Cargille	16484
Drierite	WA Hammond Drierite	043063 2270g
Micro solution de nettoyage 90	Cole-Parmer	EW-18100-11
Capillaire extracteur	Narishige	PB-7
Tubes capillaires en verre	Marque GNBH	7493 21	75 mm de long, 1,15 de diamètre
Températurecontrôleur	Newport, Irvine, Californie, États-Unis	Modèle 3040	Modèle 3040
Microscope optique	Olympe	Modèle BH2
Objectif 10x	Olympe		S Plan de 10, 0,3, 160/0.17
Objectif 50x	Nikon		CF plan, 50X/0.55 PEV ELWD
Caméra CCD	Provideo	CVC-140
Tubes Tygon	Saint-Gobain, Paris, France		Formulation Tygon S-50-HL tubes
Seringue en verre (2 ml)	Poulten-Graf, Wertheim, Allemagne	7 10227
GPIB-PCI	National Instruments, Austin, Texas, USA	778032-01
Vidéo cadre grabBER IMAQ PCI-1407-	National Instruments, Austin, Texas, USA	322156B-01
Logiciel LabVIEW System Design	National Instruments, Austin, Texas, USA	Version 8
Logiciel DivX Author	DiVx LLC, San Diego, CA, USA