Method Article
Ce protocole illustre deux méthodes d'inoculation d'introduire le champignon entomopathogène Beauveria bassiana L'état endophyte dans le haricot commun ( Phaseolus vulgaris), En préparation pour les évaluations ultérieures de lutte biologique endophyte.
Beauveria bassiana est un champignon entomopathogène avec la capacité de coloniser les plantes endophyte. Comme un endophyte, B. bassiana peuvent jouer un rôle dans la protection des plantes contre les herbivores et les maladies. Ce protocole illustre deux méthodes d'inoculation pour établir B. bassiana endophyte dans le haricot commun (Phaseolus vulgaris), en préparation pour les évaluations ultérieures de lutte biologique endophyte. Les plantes sont cultivées à partir de graines stérilisées en surface pendant deux semaines avant de recevoir un B. traitement bassiana de 10 8 conidies / ml (ou l'eau) soit appliqué en pulvérisation foliaire ou par bassinage du sol. Deux semaines plus tard, les plantes sont récoltées et de leurs feuilles, les tiges et les racines sont échantillonnés pour évaluer endophyte colonisation fongique. Pour cela, les échantillons sont individuellement stérilisés en surface, coupé en plusieurs sections, et incubées dans un milieu Potato Dextrose Agar pour 20 jours. Les médias sont inspectés tous les 2-3 jours pour observer la croissance fongiquesociated avec des parties d'installation et d'enregistrer la présence de B. bassiana d'estimer l'ampleur de la colonisation endophyte. L'analyse des succès inoculation comparer la présence de B. bassiana dans une partie de la plante donnée (c.-à-feuilles, tiges ou racines) dans tous les traitements et les contrôles. En plus de la méthode d'inoculation, le résultat spécifique de l'expérience peut dépendre de l'espèce cultivée cibles ou de variétés, les espèces de champignons entomopathogènes souche ou isolat utilisé, et les conditions de croissance de la plante.
Entomopathogènes fongiques sont des régulateurs importants de populations d'insectes avec un potentiel considérable en tant mycopesticides 1. Ce n'est que récemment, cependant, ont entomopathogènes fongiques été observé que les endophytes, à la fois naturellement et en réponse à diverses méthodes d'inoculation 2. La fonction écologique des endophytes fongiques entomopathogènes reste en grande partie inconnue, mais certaines études ont mis en cause dans les 3,4 la croissance des plantes, 5-8 résistance herbivore, et 9,10 résistance aux maladies. L'objectif global des méthodes présentées ici est d'introduire un entomopathogène fongique comme endophyte, en préparation pour les évaluations ultérieures de lutte biologique endophyte.
Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) est le mieux étudié entomopathogène fongique 5-9,11-19 endophyte, et il est disponible en tant que mycopesticide commerciale. Méthodes d'inoculation testés pour établir B. bassiana comme endophyte comprennent bassinage du sol, 14,17 enrobages de semences 18 et 14, immersions pansements radicule 13,15 racines, des rhizomes et des immersions 11,16,18, tige injections 17, 14,17,20 pulvérisations foliaires et gerbes de fleurs 19. Grâce à ces méthodes, les chercheurs ont introduit B. bassiana dans la banane 11, haricot 7, cacao 13, café 17, le maïs 7, le coton 7, le palmier dattier 12, jute 21, 20 du pavot à opium, la citrouille 7, pin radiata 18, le sorgho 14, 7 et tomate blé 7. Des données récentes suggèrent que endophyte B. bassiana a le potentiel pour protéger les plantes non seulement des arthropodes nuisibles 5-7,22-27, mais aussi de quelque 9 agents pathogènes des plantes.
Le haricot commun (Phaseolus vulgaris) se classe parmi les cultures les plus vulnérables aux ravageurset les maladies. Il peut être affecté par plus de 400 organismes nuisibles et de 200 agents pathogènes, dont l'attaque est considérée comme le facteur le plus limitant la production de haricots dans les régions 28. En conséquence, le haricot commun peut être une culture excellent modèle pour étudier le spectre de la lutte biologique endophyte par B. bassiana. Dans une première étape dans cette direction, cet article décrit les pulvérisations foliaires et du sol potions que les méthodes d'inoculation d'introduire B.bassiana l'état endophyte dans le haricot commun.
1. Plantes
2. Fongus
3. Inoculation
4. Evaluations
B. bassiana a réussi à coloniser endophyte-p vulgaris en réponse aux traitements d'inoculation ont démontré (figure 1). Les deux pulvérisations foliaires et du sol par arrosage abouti à la colonisation endophyte par B. bassiana dans plus de 80% des plantes traitées (figure 2). Cependant, l'ampleur de la colonisation dépend de la partie de la plante évaluée et la méthode d'inoculation utilisée. Les feuilles ont le mieux répondu aux inoculations de pulvérisation. Racines, d'autre part, a répondu uniquement à des inoculations bassinage. Enfin, les tiges réagi de la même pour les deux méthodes d'inoculation. B. bassiana a été détecté dans aucun des parties de l'installation de contrôle.
Indépendamment des traitements, autres que les endophytes B. bassiana est passé de 15% des sections de l'usine évalués, mais ils ont été disséqués à partir de plaques médias avant qu'ils ne puissent envahir sections voisines et influencer les résultats.
Les usines de traitement et de contrôle étaient visiblement impossibles à distinguer deux semaines après inoculation. Aucune différence n'a été détectée dans leur poids sec et dans leur hauteur.
Figure 1. Les résultats représentatifs de traitements d'inoculation sur la colonisation endophyte des plants de haricot (Phaseolus vulgaris cv Calima.) Par Beauveria bassiana En haut à gauche:. Contrôle des plaques sans croissance. En haut à droite: endophyte fongique à partir d'une section de l'usine contaminer toute la plaque. En bas à gauche: B. bassiana de plus en plus de deux parties de l'installation. En bas à droite: B. endophytique bassiana conidies et les conidiophores comme on le voit sous un microscope.
Figure 2. Effet des traitements d'inoculation sur la colonisation endophyte de bean plantes (Phaseolus vulgaris cv. Calima) par Beauveria bassiana, deux semaines après inoculation avec la souche GHA. colonisation pourcentage correspond au nombre de sections de plantes colonisées divisé par le nombre de sections de culture.
De nombreux facteurs peuvent influencer le résultat d'une expérience spécifique d'établir un entomopathogène fongique comme endophyte. Nos résultats démontrent la méthode d'inoculation est l'un d'entre eux. Les facteurs biologiques à expérimenter avec notamment la récolte des espèces ou cultivars sélectionnés et la souche de champignon entomopathogène espèces ou d'isoler utilisé. Autres facteurs à considérer comprennent la manipulation de la concentration de l'inoculum, l'âge de la plante lors de vaccinations, et les conditions de croissance de la plante.
Il serait idéal pour une méthode d'inoculation d'aboutir à la colonisation des plantes systémique par un champignon entomopathogène 14,17,18,21. Au lieu de cela, il apparaît que les méthodes d'inoculation ont tendance à privilégier un modèle spécifique de la colonisation locale. Dans le café, par exemple, des pulvérisations foliaires favoriser la colonisation feuilles alors que bassinage du sol favorisent la colonisation des racines 17. Nous avons constaté la même tendance dans le haricot commun. En fin de compte, le choix de la méthode d'inoculation doit êtreguidé par l'emplacement prévu pour l'endophyte dans une usine, probablement correspondant à la niche de la cible ou herbivore phytopathogène.
Bien que couramment utilisé, la détection et la quantification endophyte basé sur les cultures des médias peut être coûteux, difficile et source d'erreurs. Par exemple, un total de 10.800 parties de l'installation (étalées sur des boîtes de Pétri 1800) ont été évalués dans une expérience pour optimiser B. inoculations bassiana sur la banane 16. Parmi ceux-ci, 4.496 articles ont été colonisés par une putative B. bassiana, identifiés principalement par la morphologie des colonies. De toute évidence, une vérification microscopique des espèces pour chaque colonie aurait été souhaitable, mais pas inabordable. D'autre part, 1.176 articles ont été colonisées par des champignons et d'autres ont été rejetées et considérées comme des données manquantes 16. La probabilité existe, cependant, que B. bassiana est un mauvais compétiteur ou plus lent à se développer, et aurait finalement émergé de ces articles, si unllowed suffisamment de temps. Par conséquent, les méthodes de détection endophytes basés sur les cultures des médias sont soumis à des faux positifs et des faux négatifs. En conséquence, le développement de la détection et de quantification plus fiable des méthodes, par exemple ceux basés sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR) 20,21,24, est bien justifiée.
Le but ultime des expériences d'inoculation doit être de développer un traitement efficace qui offre une résistance durable contre les herbivores systémique et / ou de la maladie. Une plausible, mais encore non testés, l'hypothèse est que l'ampleur de la colonisation endophyte doit être en corrélation positive avec le degré de résistance médiée par endophyte. Une prochaine étape naturelle après l'affinement des méthodes d'inoculation, par conséquent, pourrait être d'examiner cette corrélation. Plusieurs protocoles vidéo peut aider les chercheurs à concevoir un test de résistance appropriée pour un organisme cible pathogène ou 29-31. En fin de compte, c'est ce test qui va déterminer le succès de l'inoculumtion méthode, et le potentiel associé pour la lutte biologique endophyte.
Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.
La production et le travail expérimental présenté ici reflète l'aide dévouée et enthousiaste de Reynaldo Pareja. Financé par le Département administratif de la Colombie de la Science, de la Technologie et de l'Innovation (Colciencias) et par une subvention de la Fondation Bill & Melinda Gates à travers l'initiative du Grand Challenges Explorations.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
REAGENTS | |||
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
Mycotrol SE | Laverlam | 4167 | |
Noble agar | Sigma | A5431-250G | |
Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-25MU | |
Petri dish (100 x 15 mm) | Fisher | 08-757-12 | |
Petri dish (60 x 15 mm) | Fisher | 08-757-13A | |
Potato dextrose agar | Difco | 213400 | |
Regular bleach (NaOCl) | CLOROX | N/A | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
Tetracycline | Sigma | T3258-25G | |
Triple quince (NPK) | ABOCOL | N/A | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
EQUIPMENT | |||
Biological safety cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
Leica DM LB microscope | Leica | N/A |
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