Détermination des acides gras tolérables et concentrations de toxine du choléra en utilisant des cellules épithéliales intestinales humaines et BALB / c macrophages de souris

Résumé

Nous avons cherché à déterminer les concentrations tolérables de trois acides gras (acides oléique, linoléique et linolénique) et la toxine du choléra qui n'a pas incidence défavorable importante sur la survie des cellules de solubiliser les acides gras et les toxines et leur utilisation dans des essais de survie cellulaire.

Résumé

Le rôle positif des acides gras dans la prévention et la lutte contre les maladies non humains et humains ont été et continuent d'être largement documentés. Ces rôles incluent influences sur les maladies infectieuses et non infectieuses, y compris la prévention de l'inflammation, ainsi que l'immunité des muqueuses aux maladies infectieuses. Le choléra est une maladie intestinale aiguë causée par la bactérie Vibrio cholerae. Il se produit dans les pays en développement et si elle n'est pas traitée, peut entraîner la mort. Bien qu'il existe des vaccins contre le choléra, ils ne sont pas toujours efficaces et d'autres méthodes de prévention sont nécessaires. Nous avons cherché à déterminer les concentrations tolérables de trois acides gras (acides oléique, linoléique et linolénique) et la toxine du choléra en utilisant respectivement souris BALB / C macrophages et les cellules épithéliales intestinales humaines. Nous SOLUBILISE les acides gras ci-dessus et des essais de prolifération des cellules utilisées pour déterminer les gammes de concentration et les concentrations spécifiques des acides gras qui ne sontt préjudiciables à la viabilité des cellules épithéliales intestinales humaines. Nous SOLUBILISE toxine cholérique et utilisé dans un essai pour déterminer les gammes de concentration et les concentrations spécifiques de la toxine cholérique qui ne sont pas statistiquement diminue la viabilité des cellules dans des souris BALB / C macrophages.

Nous avons trouvé les concentrations d'acides gras optimale à entre 1-5 ng / ul, et que pour la toxine cholérique être <30 ng par traitement. Ces données peuvent aider les futures études visant à trouver un rôle muqueuse protectrice pour les acides gras dans la prévention ou l'atténuation des infections de choléra.

Introduction

Les avantages pour la santé des acides gras comme l'acide oléique, linoléique et linolénique ont été et continuent d'être documentés. Par exemple, l'acide oléique permet de faciliter la pénétration des médicaments lipophiles dans ^l'1,2 corporel, réduit de maladie coronarienne de 24% lorsqu'ils sont substitués pour les acides gras saturés ^3, et est utilisé pour traiter les maladies métaboliques telles que l'adrénoleucodystrophie ⁴ qui est un lié à l'X trouble génétique du métabolisme des acides gras. . Même si un précurseur nécessaire pour l'acide arachidonique chez les mammifères, l'acide linoléique (contrairement à l'acide oléique) n'est pas synthétisée par l'organisme et doit être obtenue par des sources extérieures telles que la consommation de graines de lin ⁵ études montrent plusieurs effets bénéfiques sur la santé de l'acide linoléique telles que: propriétés anti-âge pour la peau; ⁶ propriétés anti-inflammatoires; ⁷ prolifération réduite des cellules carcinome colorectal et de la prostate; ⁸ et la capacité de lutter contre l'obésité et la promotion o⁹ acide linolénique f de la santé cardiovasculaire. joue un rôle dans la réduction de l'inflammation du parodonte, thromboxane ¹⁰ et la modulation et la biosynthèse de la prostacycline. ¹¹

Arpita ¹² a étudié l'influence des acides gras biliaires et du cholestérol sur V. expression des facteurs de virulence et la motilité de l 'cholerae. Yamasaki ¹³ a indiqué que l'extrait de méthanol à partir de piments rouges et d'autres composés naturellement extraites, peut potentiellement diminuer la production de la toxine du choléra. Il est concevable d'envisager l'utilisation de produits alimentaires qui sont riches en acides gras ci-dessus (comme les graines de lin) dans la prévention et la lutte contre des maladies infectieuses telles que le choléra en offrant une immunité mucosale. Nous avons mené des enquêtes pour solubiliser les acides gras et de déterminer, en utilisant des tests de prolifération cellulaire, la concentration maximale d'acides gras que les cellules épithéliales intestinales humaines peuvent tolérer sans effets néfastes sur la CEll viabilité. Nous avons supposé que les acides oléique, linoléique et linolénique ont un effet bénéfique sur la viabilité cellulaire à des concentrations plus faibles, mais que des concentrations plus élevées ils vont être toxiques pour les cellules. Nous avons également SOLUBILISE la toxine cholérique et déterminé la concentration maximale de la toxine cholérique qui BALB / C macrophages de souris peuvent tolérer sans une diminution significative de la viabilité cellulaire. Nous émettons l'hypothèse d'un effet toxique de la toxine cholérique sur la viabilité des cellules, même à très faible niveau. La méthode de solubiliser une toxine cholérique et l'utiliser pour déterminer le montant maximum de la toxine que les cellules peuvent tolérer sans une diminution significative de la survie constitue un avantage pour les études futures. Par exemple, une combinaison des méthodes ci-dessus peut être utilisé pour déterminer si les acides gras fournissent des cellules de l'immunité des muqueuses contre les infections de choléra. Au meilleur de notre connaissance, cette méthodologie rationnelle et n'a pas été explorée.

Nous discuss comment nos données préliminaires peuvent être utilisés dans de futures investigations afin de déterminer si les acides oléique, linoléique et linolénique fournir des cellules de l'immunité muqueuse contre l'infection par le choléra.

Protocole

1. Tissue Culture

1. Utilisez Mus musculus macrophages (BALB / c) pour les déterminations de la toxine du choléra. Initialement culture tout de M. cellules musculus en suivant les instructions du fournisseur.
2. Propager BALB / c cellules de souris dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco avec L-glutamine complété avec 10% de sérum de veau fœtal et 1% 1640 de base antibiotique / antifongique ou RPMI complété avec 10% de sérum de veau foetal, 5% de L-glutamine et 1 % réactif antibiotique / antifongique.
3. Cultiver les cellules dans 75 cm ² Corning flacons avec des bouchons ventilés à 37 ° C, 95% d'air et 5% de CO _2.
4. Amener les cellules épithéliales intestinales humaines dans les 24 heures de la livraison que les instructions du fabricant pour la détermination des déterminations d'acides gras.
5. Propager les cellules épithéliales intestinales humaines en 75 cm ² Corning flacons avec des bouchons ventilés dans les médias HybriCare complété avec 10% de FBS et 30 ng / ml d'EGF humain à 37 ° C. Ne pas utiliser des antibiotiquesRéactifs / antimycosiques selon les instructions du fabricant.
6. Fractionner les cellules (1:3) à la confluence d'environ 70%.
7. Congeler et mettre en place toutes les cellules tout au long de l'étude en utilisant des protocoles de congélation standard.
8. Note: Pour la détermination de la concentration plus grande échelle des acides gras, utilisez la croissance plus rapide, plus facile à entretenir, les macrophages de souris initialement. Pour la détermination de la concentration d'acides gras à fine échelle, utiliser des cellules épithéliales humaines. Utilisez des macrophages de souris pour tous les traitements de la toxine cholérique (voir discussion).

2. Acides gras et des traitements de la toxine cholérique

1. Transfert acides oléique, linoléique et linolénique de la compagnie fournis par des ampoules de verre dans des flacons en verre stérilisés.
2. Transférer chaque acide gras dans un tube Eppendorf stérile séparée et dissoudre d'abord dans l'éthanol à 100% à une dilution de 1:6, puis en milieu RPMI 1640 incomplètes pour une concentration finale de 10 pg / pl.
3. Vortex chaque solution et transfer à des flacons en verre pour le stockage dans le congélateur (-20 ° C).
4. Cellules de la plaque au niveau des cellules 2500 / puits dans 96 des plaques de culture de tissus ainsi.
5. Ajouter le média complètes appropriées pour porter le volume total du puits de 200 pi pour le traitement des cellules avec des acides gras dans la préparation pour les tests MTT.
6. Après une période de prolifération 24 heures, retirez le support et remplacez-le par du milieu frais.
7. Ajouter les concentrations appropriées de chaque acide gras à tester dans les puits (voir les résultats). Ajouter des milieux complets pour amener les volumes nombre total de puits de 200 pi.
8. Incuber les plaques traitées pendant 24 heures avant de commencer le test MTT.
9. Dissoudre la toxine du choléra dans du PBS à une concentration de 1 mg / ml et aliquote de la solution dans cryovials et stocker les flacons cryogéniques à 2-8 ° C.
10. Pour les traitements de cellules, diluer la toxine 1:100 dans du PBS stérile (pH 7,4) ou incomplet du DMEM pour une concentration de travail finale de 1 ng / ul.
11. Pour traiter les cellules avec la toxine du choléra danspréparation pour les tests MTT, les cellules de la plaque comme décrit ci-dessus.
12. Après une période de prolifération 24 h, ajouter les concentrations appropriées de la toxine cholérique (pour nos concentrations, voir les résultats) à tester dans les puits en suivant les procédures utilisés dans les applications d'acides gras (ci-dessus).
13. Incuber les plaques traitées pendant 24 heures avant de commencer le test MTT.
14. En (c positif tout le papier) positive et négative de contrôle (négatif c), à la fois d'acides gras et les traitements de la toxine du choléra, les cellules incuber avec du milieu complet et l'éthanol à 70%, respectivement.
15. Pour tous les échantillons et les traitements utilisent un minimum de trois répétitions (n ​​= 3), avec plus de répétitions pour les contrôles positifs (n = 6 dans cette étude).

3. MTT

1. Faire une solution de MTT à une concentration de 2,5 mg / ml.
2. Retirez la solution dans chaque puits de la plaque de 96 puits à tester et remplacez-le par 200 pi de solution média complète fraîche.
3. Annonced 10 pl de la solution MTT à chaque puits.
4. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 3-4 heures.
5. Jeter la solution des médias et ajouter 100 ul de 0,04 M HCl dans l'isopropanol à chaque puits.
6. Incuber la plaque à la température ambiante pendant cinq minutes.
7. Transvaser la solution à partir de chaque puits pour un nouveau tube de centrifugation.
8. Centrifuger à 20000 x g, à température ambiante, pendant 1 min, ou jusqu'à ce qu'un culot a été formé.
9. Transfert entre 20-40 pi de chaque échantillon à un lecteur de microplaques.
10. Lire l'absorbance à 570 nm à l'aide d'un spectrophotomètre.

Résultats

Détermination de la concentration optimale en acides gras

La concentration optimale d'acides gras est définie comme étant la concentration maximale à laquelle la croissance des cellules est comparable ou supérieure à celle des cellules de contrôle, avec relativement faible variabilité des résultats. Pour déterminer la concentration optimale d'acide oléique, les cellules des acides linoléique et linolénique ont d'abord été traités avec des concentrations variables de ...

Discussion

Suggestion de concentration des acides gras et la toxine du choléra

Bien que le mécanisme exact de la façon dont les acides gras améliorent l'immunité muqueuse est inconnue, plusieurs études ont tenté d'étudier leurs effets bénéfiques. Notre étude vise à fournir une méthodologie pour déterminer la concentration maximale d'acides gras que les cellules peuvent tolérer ainsi que la concentration maximale de la toxine cholérique que les cellules peuvent tolérer sans une...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells/Reagent
Mus musculus macrophages	ATCC	ATCC RAW 264.7
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	ATCC	30-2002
L-glutamine	ATCC	30-2115
Fetal bovine serum	Bio-west	S0250
Antibiotic/antimycotic	Hyclone	SV3007901
Human intestinal epithelial cells	ATCC	ATTC CCL-241
HybriCare media	ATCC	46-X
Oleic Acid	Sigma-Aldrich	O1008
Linoleic Acid	Sigma-Aldrich	L-1376
Linolenic Acid	Sigma-Aldrich	L-2376
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052
Equipment
BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates	BD Biosciences	351172
Spectrophotometer with Dynex Revelations 4.22 software	Dynex	91000101