Determinação de ácidos graxos tolerável e Concentrações toxina da cólera Usando Humanos células epiteliais intestinais e BALB / c mouse macrófagos

Resumo

Partimos para determinar as concentrações toleráveis ​​de três ácidos graxos (ácidos oléico, linoléico e linolênico) e toxina da cólera que não significativamente e adversamente afetar a sobrevivência da célula por solubilização dos ácidos graxos e da toxina e usá-los em ensaios de sobrevivência celular.

Resumo

O papel positivo dos ácidos graxos na prevenção e combate de doenças não-humanos e humanos têm sido e continuam a ser amplamente documentado. Essas funções incluem influências sobre doenças infecciosas e não infecciosas, incluindo a prevenção da inflamação, bem como a imunidade da mucosa para doenças infecciosas. A cólera é uma doença intestinal aguda causada pela bactéria Vibrio cholerae. Ela ocorre em países em desenvolvimento e se não tratada, pode resultar em morte. Embora existam vacinas para a cólera, eles nem sempre são eficazes e são necessários outros métodos preventivos. Partimos para determinar as concentrações toleráveis ​​de três ácidos graxos (ácidos oléico, linoléico e linolênico) e toxina da cólera usando o mouse BALB / C macrófagos e células epiteliais intestinais humanas, respectivamente. Nós solubilizado os ácidos gordos superiores e os ensaios de proliferação de células utilizadas para determinar as gamas de concentração e concentrações específicas dos ácidos gordos que não estãot prejudiciais para a viabilidade da célula epitelial intestinal humana. Nós solubilizado a toxina da cólera e utilizado num ensaio para determinar as gamas de concentração e concentrações específicas de que a toxina da cólera não é estatisticamente diminuir a viabilidade celular em ratinhos BALB / C macrófagos.

Encontrámos as concentrações óptimas de ácidos gordos para estar entre 1-5 ng / mL, e que, para a toxina da cólera de ser <30 ng por tratamento. Estes dados podem ajudar estudos futuros que visem encontrar um papel mucosa protetora para os ácidos graxos na prevenção ou alívio de infecções de cólera.

Introdução

Os benefícios de saúde de ácidos graxos, como o oléico, linoléico e linolênico têm sido e continuam a ser documentado. Por exemplo, o ácido oleico ajuda a facilitar a penetração dos fármacos lipofílicos no ^1,2 corpo, a doença cardíaca coronária reduz em 24% quando substituídos por ácidos gordos saturados ^3, e é utilizada para o tratamento de doenças metabólicas como a adrenoleucodistrofia ⁴ que é um X-ligados distúrbio genético do metabolismo dos ácidos gordos. . Enquanto um precursor necessário para o ácido araquidónico em mamíferos, o ácido linoleico (ao contrário do ácido oleico) não é sintetizada pelo corpo e devem ser obtidos através de fontes externas, tais como o consumo de semente de linho ⁵ Estudos mostram vários efeitos benéficos à saúde de ácido linoleico, tais como: propriedades anti-envelhecimento para a pele; ^seis propriedades anti-inflamatórias; ⁷ reduziu a proliferação de células de carcinoma colorretal e próstata; ⁸ ea capacidade para combater a obesidade e promoção o^9. linolênico f saúde cardiovascular desempenha um papel na redução da inflamação periodontal, tromboxano ¹⁰ e modulando a biossíntese da prostaciclina e ^11.

Arpita ¹² estudaram a influência dos ácidos graxos biliares e colesterol em V. expressão de fatores de virulência e motilidade cholerae 's. Yamasaki ¹³ indicaram que o extrato de metanol a partir de pimentas vermelhas, e outros compostos extraídos naturalmente, pode, potencialmente, diminuir a produção de toxina da cólera. É concebível a considerar a utilização de produtos alimentares que são ricos em ácidos gordos superiores (tais como sementes de linho) na prevenção e alívio de doenças infecciosas tais como a cólera através do fornecimento de imunidade da mucosa. Foi realizado investigações para solubilizar os ácidos gordos e para determinar, usando testes de proliferação de células, a concentração máxima de ácidos gordos que as células epiteliais intestinais humanas pode tolerar sem efeitos prejudiciais sobre a ceviabilidade ll. Colocámos a hipótese de que os ácidos oleico, linoleico e linolénico, proporcionar um efeito benéfico sobre a viabilidade das células em concentrações mais baixas, mas que, em concentrações mais elevadas que são tóxicos para as células. Também solubilizado a toxina da cólera e determinada a concentração máxima de toxina da cólera que BALB / C de rato macrófagos pode tolerar sem uma diminuição significativa da viabilidade celular. Nossa hipótese é um efeito tóxico da toxina da cólera na viabilidade celular, mesmo em nível muito baixo. O método de solubilização de uma toxina da cólera e utilizá-la para determinar a quantidade máxima da toxina que as células podem tolerar sem uma diminuição significativa na capacidade de sobrevivência proporciona uma vantagem para estudos futuros. Por exemplo, uma combinação das metodologias acima podem ser utilizadas para determinar se os ácidos gordos de fornecer células com a imunidade da mucosa contra a infecção de cólera. Para o melhor de nosso conhecimento, esta metodologia racional e não foi explorado.

Nós discuss como os nossos dados preliminares podem ser utilizados em investigações posteriores para determinar se o oleico, linoleico e linolénico fornecer células com a imunidade da mucosa contra a infecção de cólera.

Protocolo

1. Cultura de Tecidos

1. Use Mus musculus macrófagos (BALB / c) para as determinações da toxina da cólera. Inicialmente cultura todos M. células musculus seguindo as instruções do fornecedor.
2. Propaga BALB / c células ratos em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco com L-glutamina completado com 10% de soro fetal bovino, e antibióticos / antimicóticos ou meio RPMI 1640 de base de 1% completado com 10% de soro fetal bovino, 5% de L-glutamina, e 1 % de reagente de antibiótico / antimicótico.
3. Cultivar células em 75 cm ² frascos corning com tampas com respiradouros, a 37 ° C, 95% de ar e 5% de CO _2.
4. Levar-se as células epiteliais intestinais humanas no prazo de 24 horas da entrega, conforme instrues do fabricante para a determinação das determinações de ácidos gordos.
5. Propagação de células epiteliais intestinais humanas em 75 cm ² frascos corning com tampas ventiladas em meios HybriCare completados com 10% de FBS e 30 ng / ml de EGF humano a 37 ° C. Não use antibióticosReagentes / antimicóticos conforme instruções do fabricante.
6. Dividir todas as células (1:3) a cerca de 70% de confluência.
7. Congelar e trazer todas as células ao longo do estudo por meio de protocolos de congelamento padrão.
8. Nota: Para a determinação da concentração de escala maior de ácidos gordos, a utilização de crescimento mais rápido e mais fácil de manter, inicialmente, os macrófagos do rato. Para a determinação da concentração de ácido graxo fina escala, usar células epiteliais humanas. Use macrófagos de camundongos para todos os tratamentos toxina da cólera (ver discussão).

2. Ácidos graxos e tratamentos toxina da cólera

1. Transferência de ácidos oléico, linoléico e linolênico de empresa, desde ampolas de vidro para frascos de vidro esterilizados.
2. Transferência de cada ácido gordo para um tubo Eppendorf esterilizado em separado e dissolvê-lo em primeiro lugar em etanol a 100% a uma diluição de 1:06, e, em seguida, em meio RPMI 1640 incompletos para uma concentração final de 10 ug / ul.
3. Vortex cada solução e transfer-o para frascos de vidro para armazenamento no congelador (-20 ° C).
4. As células em placas a 2500 células / poço em placas de 96 poços de cultura de tecido.
5. Adicionar os meios completos adequados para levar o volume total a 200 bem ul para o tratamento de células com ácidos gordos na preparação para os ensaios MTT.
6. Depois de um período de proliferação 24 horas, remova a mídia e substituí-lo com novas mídias.
7. Adicionar as concentrações apropriadas de cada ácido gordo a ser testado para os poços (ver resultados). Adicionar meio completo para assim trazer os volumes totais de 200 ul.
8. Incubar as placas tratadas por 24 horas antes de se iniciar o ensaio de MTT.
9. Dissolve-se a toxina de cólera em PBS a uma concentração de 1 mg / ml e alíquotas da solução em criotubos e armazenar os criotubos a 2-8 ° C.
10. Para os tratamentos de células, dilui-se a toxina de 1:100 em PBS esterilizado (pH 7,4) ou DMEM incompleto para uma concentração de trabalho final de 1 ng / ul.
11. Para o tratamento de células com a toxina da cólera nopreparação para ensaios de MTT, as células da placa, tal como descrito acima.
12. Depois de um período de proliferação de 24 h, adicionar as concentrações apropriadas de toxina da cólera (por nossos concentrações, ver resultados) a serem ensaiadas às cavidades seguindo os procedimentos utilizados em aplicações de ácidos gordos (de cima).
13. Incubar as placas tratadas por 24 horas antes de se iniciar o ensaio de MTT.
14. Como (c positivo ao longo do papel) positivo e de controlo negativo (negativo c), para ambos os tratamentos ácido gordo e a toxina da cólera, as células a incubar com meio completo e etanol a 70%, respectivamente.
15. Para todas as amostras e tratamentos utilizar um mínimo de três repetições (n = 3), com mais repetições de controlos positivos (n = 6 neste estudo).

3. MTT Assay

1. Adicione uma solução de MTT a uma concentração de 2,5 mg / ml.
2. Remover a solução em cada poço da placa de 96 poços a serem testados e substituí-la com 200 ml de solução de meio completo fresco.
3. Anúnciod 10 uL da solução de MTT a cada poço.
4. Incubar a placa a 37 ° C durante 3-4 horas.
5. Descartar a solução meios e adicionar 100 ul de 0,04 M de HCl em isopropanol a cada poço.
6. Incubar a placa a temperatura ambiente durante cinco minutos.
7. Transferir a solução de cada poço para um novo tubo de centrífuga.
8. Centrifugar a 20.000 x g, à temperatura ambiente, durante 1 min, ou até que um precipitado foi formado.
9. Transferência entre 20-40 mL de cada amostra de um leitor de microplacas.
10. Ler a absorvância a 570 nm utilizando um espectrofotómetro.

Resultados

Determinação da concentração ótima de Ácidos Graxos

A concentração óptima de ácidos gordos é definida como a concentração máxima em que o crescimento celular é comparável ou superior à das células de controlo, com relativamente baixa variabilidade nos resultados. Para determinar a concentração óptima de oleico, células de ácidos linoleico e linolénico, foram inicialmente tratadas com várias concentrações de cada ácido gordo em grandes incrementos e depois com pequeno...

Discussão

Sugestão de concentração de ácidos graxos e toxina da cólera

Embora o mecanismo exato de como ácidos graxos aumentar a imunidade da mucosa é desconhecida, vários estudos têm tentado investigar os seus efeitos benéficos. Este estudo tem como objectivo proporcionar o método para determinar a concentração máxima de ácidos gordos que as células podem tolerar bem como a concentração máxima de toxina da cólera que as células podem tolerar sem uma influência significativa sobre a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells/Reagent
Mus musculus macrophages	ATCC	ATCC RAW 264.7
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	ATCC	30-2002
L-glutamine	ATCC	30-2115
Fetal bovine serum	Bio-west	S0250
Antibiotic/antimycotic	Hyclone	SV3007901
Human intestinal epithelial cells	ATCC	ATTC CCL-241
HybriCare media	ATCC	46-X
Oleic Acid	Sigma-Aldrich	O1008
Linoleic Acid	Sigma-Aldrich	L-1376
Linolenic Acid	Sigma-Aldrich	L-2376
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052
Equipment
BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates	BD Biosciences	351172
Spectrophotometer with Dynex Revelations 4.22 software	Dynex	91000101