Determinazione degli acidi grassi tollerabile e Concentrazioni tossina colerica Uso Umano cellule epiteliali intestinali e BALB / c macrofagi del mouse

Riepilogo

Ci proponiamo di determinare le concentrazioni tollerabili di tre acidi grassi (acido oleico, linoleico e linolenico) e la tossina del colera che non significativamente e influenzare negativamente la sopravvivenza delle cellule solubilizzando gli acidi grassi e le tossine e il loro utilizzo in saggi di sopravvivenza delle cellule.

Abstract

Il ruolo positivo degli acidi grassi per la prevenzione e la riduzione delle malattie non-umani e umani sono stati e continuano ad essere ampiamente documentato. Questi ruoli includono influenze sulle malattie infettive e non infettive tra cui la prevenzione di infiammazione e immunità mucosale a malattie infettive. Il colera è una malattia intestinale acuta causata dal batterio Vibrio cholerae. Essa si verifica nei paesi in via di sviluppo e, se non trattata, può portare alla morte. Mentre esistono vaccini per il colera, non sono sempre efficaci e sono necessari altri metodi preventivi. Ci proponiamo di determinare le concentrazioni tollerabili di tre acidi grassi (acido oleico, linoleico e linolenico) e la tossina del colera che utilizzano rispettivamente topo BALB / C macrofagi e cellule epiteliali intestinali umane. Noi solubilizzato degli acidi grassi sopra e saggi di proliferazione cellulare utilizzati per determinare gli intervalli di concentrazione e concentrazioni specifiche degli acidi grassi che non sonot pregiudizievoli per la vitalità delle cellule epiteliali intestinali umane. Noi solubilizzato tossina del colera e l'ho usato in un test per determinare gli intervalli di concentrazione e concentrazioni specifiche di tossina del colera che non statisticamente diminuire la vitalità cellulare in BALB / C macrofagi.

Abbiamo trovato le concentrazioni ottimali di acidi grassi per essere fra 1-5 ng / ml, e che per tossina colerica essere <30 ng per il trattamento. Questi dati possono aiutare i futuri studi che mirano a trovare un ruolo protettivo della mucosa di acidi grassi nella prevenzione o riduzione delle infezioni da colera.

Introduzione

I benefici per la salute degli acidi grassi, come ad esempio acido oleico, linoleico e linolenico sono stati e continuano ad essere documentata. Per esempio acido oleico aiuta facilitare la penetrazione dei farmaci lipofili nel ^1,2 corpo, riduce la malattia coronarica del 24% quando sostituite acidi grassi saturi ^3, ed è usato per trattare malattie metaboliche come Adrenoleukodystrophy ⁴ che è un X-Linked malattia genetica del metabolismo degli acidi grassi. . Mentre un precursore necessario per l'acido arachidonico nei mammiferi, acido linoleico (a differenza acido oleico) non viene sintetizzata dal corpo e deve essere ottenuto attraverso fonti esterne come dal consumo di semi di lino ⁵ studi mostrano diversi effetti benefici sulla salute di acido linoleico, quali: proprietà anti-invecchiamento per la pelle; ⁶ proprietà antinfiammatorie; ⁷ ridotta proliferazione del colon-retto e della prostata cellule di carcinoma, ⁸ e la capacità di combattere l'obesità e la promozione of salute cardiovascolare. ⁹ acido linolenico ha un ruolo nel ridurre l'infiammazione parodontale, trombossano ¹⁰ e modulando e prostaciclina biosintesi ^11.

Arpita ¹² ha studiato l'influenza di acidi grassi biliari e del colesterolo su V. espressione di fattori di virulenza e la motilità cholerae s '. Yamasaki ¹³ indica che l'estratto di metanolo dal peperoncino rosso, e altri composti estratti naturali, può potenzialmente diminuire la produzione della tossina del colera. È concepibile considerare l'uso di prodotti alimentari che sono ricchi di acidi grassi superiori (come semi di lino) nella prevenzione e attenuazione di malattie infettive come il colera, formulando immunità mucosale. Abbiamo condotto indagini per solubilizzare gli acidi grassi e per determinare, mediante saggi di proliferazione cellulare, la massima concentrazione di acidi grassi che le cellule epiteliali intestinali umani possono tollerare senza effetti negativi sulla cevitalità ll. Abbiamo ipotizzato che gli acidi oleico, linoleico e linolenico forniscono un effetto benefico sulla vitalità cellulare a concentrazioni inferiori, ma che a concentrazioni più alte sono tossici per le cellule. Abbiamo anche solubilizzato la tossina del colera e determinata la concentrazione massima di tossina colerica che BALB / C macrofagi mouse possono tollerare senza un significativo decremento della vitalità cellulare. Ipotizziamo un effetto tossico di tossina colerica sulla vitalità cellulare anche a livello molto basso. Il metodo di solubilizzare una tossina del colera e utilizzarlo per determinare l'importo massimo della tossina che le cellule possono tollerare senza una diminuzione significativa nella sopravvivenza fornisce un vantaggio per studi futuri. Per esempio, una combinazione delle metodologie sopra può essere utilizzata per determinare se gli acidi grassi forniscono cellule con l'immunità mucosale contro le infezioni colera. Per quanto a nostra conoscenza, questa metodologia razionale e non è stato esplorato.

Noi discuss come i nostri dati preliminari possono essere utilizzati in successive investigazioni per determinare se oleico, linoleico e linolenico fornire cellule con l'immunità mucosale contro l'infezione colera.

Protocollo

1. Tissue Culture

1. Utilizzare Mus musculus macrofagi (topi BALB / c) per le determinazioni della tossina del colera. Inizialmente cultura tutti M. cellule musculus seguendo le istruzioni del fornitore.
2. Propagare BALB / c cellule topi in mezzo di coltura di Dulbecco modificato con L-glutammina completato con 10% di siero fetale bovino e 1% di antibiotici / antimicotici o RPMI 1640 supporti di base completato con 10% di siero fetale bovino, 5% di L-glutammina e 1 % antibiotico / antimicotico reagente.
3. Crescere le cellule in 75 cm ² corning boccette con tappi di sicurezza a 37 ° C, 95% di aria e 5% di CO _2.
4. Portare le cellule epiteliali intestinali umane entro 24 ore di consegna secondo le indicazioni del produttore per la determinazione delle determinazioni di acidi grassi.
5. Propagare le cellule epiteliali intestinali umane in 75 cm ² corning boccette con tappi di sicurezza in HybriCare supporti completati con 10% FBS e 30 ng / ml di EGF umano a 37 ° C. Non usare antibioticiReagenti / antimicotici come da istruzioni del produttore.
6. Dividere tutte le cellule (1,3) a circa il 70% di confluenza.
7. Congelare e portare tutte le cellule in tutto lo studio utilizzando protocolli di congelamento standard.
8. Nota: Per la determinazione scala maggiore concentrazione di acidi grassi, utilizzare la crescita più rapida, più facile da mantenere, macrofagi topo inizialmente. Per la determinazione multa scala grasso concentrazione di acido, usare le cellule epiteliali umane. Utilizzare i macrofagi del mouse per tutti i trattamenti di tossina del colera (vedi discussione).

2. Acidi grassi e Trattamenti tossina colerica

1. Trasferire acido oleico, linoleico e linolenico da azienda-fornito ampolle di vetro per flaconi di vetro sterilizzati.
2. Trasferire ciascun acido grasso di un tubo separato sterilizzato Eppendorf e scioglierlo prima in 100% di etanolo ad una diluizione di 1:6, e poi in RPMI 1640 supporti incompleti per una concentrazione finale di 10 mg / mL.
3. Vortex ogni soluzione e trasfer per flaconi in vetro per la conservazione nel congelatore (-20 ° C).
4. Cellule piastra a 2.500 cellule / pozzetto in 96 piastre di coltura tissutale bene.
5. Aggiungere dei mezzi completi appropriati per portare il volume totale di 200 microlitri bene per il trattamento delle cellule con acidi grassi in preparazione per saggi MTT.
6. Dopo un periodo di proliferazione ore 24, rimuovere il supporto e sostituirlo con mezzi freschi.
7. Aggiungere le concentrazioni corrispondenti di ciascun acido grasso da testare ai pozzetti (vedi risultati). Aggiungi mezzi completi per portare il totale dei volumi e di 200 microlitri.
8. Incubare le piastre trattate per 24 ore prima di iniziare il saggio MTT.
9. Sciogliere la tossina del colera in PBS ad una concentrazione di 1 mg / ml e aliquota della soluzione in cryovials e memorizzare le cryovials a 2-8 ° C.
10. Per trattamenti con le cellule, diluire la tossina 1:100 in PBS o sterilizzato (pH 7,4) o incompleto DMEM per una concentrazione finale di lavoro di 1 ng / ml.
11. Per il trattamento di cellule con la tossina del colera inpreparazione per saggi MTT, cellule piastra come descritto sopra.
12. Dopo un periodo di proliferazione ore 24, aggiungere le concentrazioni adeguate di tossina del colera (per le nostre concentrazioni, vedere i risultati) da testare ai pozzetti seguendo le procedure utilizzate in applicazioni di acidi grassi (di cui sopra).
13. Incubare le piastre trattate per 24 ore prima di iniziare il saggio MTT.
14. Come (c positivo durante la carta) positivo e controllo negativo (negativo C), sia per acidi grassi e trattamenti di tossina del colera, cellule incubate con mezzo completo e il 70% di etanolo, rispettivamente.
15. Per tutti i campioni ed i trattamenti utilizzano un minimo di tre repliche (n = 3), con più repliche per i controlli positivi (n = 6 in questo studio).

3. MTT Assay

1. Ottenere una soluzione stock MTT alla concentrazione di 2,5 mg / ml.
2. Rimuovere la soluzione in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti da testare e sostituirlo con 200 ml di soluzione fresca multimediale completa.
3. Annunciod 10 microlitri della soluzione MTT ad ogni pozzetto.
4. Incubare la piastra a 37 ° C per 3-4 ore.
5. Scartare la soluzione multimediale e aggiungere 100 ml di 0,04 M HCl in isopropanolo a ciascun pozzetto.
6. Incubare la piastra a temperatura ambiente per cinque minuti.
7. Trasferire la soluzione da ciascun pozzetto in una nuova provetta da centrifuga.
8. Centrifugare a 20.000 xg, a temperatura ambiente, per 1 min, o fino a quando un pellet è stato formato.
9. Trasferimento tra 20-40 ml di ogni campione per un lettore di micropiastre.
10. Leggere l'assorbanza a 570 nm utilizzando uno spettrofotometro.

Risultati

Determinazione della concentrazione ottimale di acidi grassi

La concentrazione ottimale di acidi grassi è definito come la concentrazione massima alla quale la crescita cellulare è comparabile o superiore a quello delle cellule di controllo, con relativamente bassa variabilità nei risultati. Per determinare la concentrazione ottimale di oleico, cellule acidi linoleico e linolenico sono state inizialmente trattate con concentrazioni variabili di ciascun acido grasso in grandi incrementi e suc...

Discussione

Suggerimento di concentrazione di acidi grassi e di tossina colerica

Mentre il meccanismo esatto di come acidi grassi migliorare l'immunità mucosale è sconosciuta, diversi studi hanno tentato di investigare loro effetti benefici. Nostro studio mira a fornire metodologia per determinare la concentrazione massima di acidi grassi che le cellule possono tollerare nonché la concentrazione massima di tossina colerica che le cellule possono tollerare senza una significativa influenza sulla sopr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells/Reagent
Mus musculus macrophages	ATCC	ATCC RAW 264.7
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	ATCC	30-2002
L-glutamine	ATCC	30-2115
Fetal bovine serum	Bio-west	S0250
Antibiotic/antimycotic	Hyclone	SV3007901
Human intestinal epithelial cells	ATCC	ATTC CCL-241
HybriCare media	ATCC	46-X
Oleic Acid	Sigma-Aldrich	O1008
Linoleic Acid	Sigma-Aldrich	L-1376
Linolenic Acid	Sigma-Aldrich	L-2376
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052
Equipment
BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates	BD Biosciences	351172
Spectrophotometer with Dynex Revelations 4.22 software	Dynex	91000101