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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Trois essais, y compris l'effet cytopathique (CPE) à base de test, essai dose-réponse et (TOA) test à temps de Addition ont été développés, optimisés, validés et utilisés pour identifier de nouveaux antiviraux contre le virus de la fièvre catarrhale (BTV), ainsi à déterminer le Mécanisme d'action-de-possible (MOA) pour antiviraux nouvellement identifiés.

Résumé

Pour identifier les antiviraux potentiels contre BTV, nous avons développé, optimisé et validé trois essais présentés ici. L'essai à base de CPE-a été le premier essai mis au point pour évaluer si un composé a montré une quelconque efficacité antivirale et ont été utilisés pour cribler grande bibliothèque de composés. Pendant ce temps, la cytotoxicité des antiviraux pourrait également être évaluée en utilisant le test basé CPE. L'analyse dose-réponse a été conçu pour déterminer la plage de l'efficacité de l'antiviral choisi, c'est à dire 50% de la concentration inhibitrice (CI 50) ou la concentration efficace (CE 50), ainsi que sa gamme de cytotoxicité (CC 50). Le dosage ToA a été utilisée pour l'étude initiale MoA pour déterminer le mécanisme sous-jacent des nouveaux antiviraux pendant BTV cycle de vie viral ou l'effet possible sur la machinerie cellulaire de l'hôte. Ces dosages sont vitales pour l'évaluation de l'efficacité antivirale dans un système de culture cellulaire, et ont été utilisés pour conduire nos recherches récentesment à l'identification d'un certain nombre de nouveaux antiviraux contre BTV.

Introduction

BTV est un virus à ARN double brin prototype dans le genre Orbivirus, famille Reoviridae. BTV est une des maladies les plus importantes de bétail domestique, y compris les ovins, les caprins, les bovins et d'autres animaux domestiques, avec une perte $ 3000000000 / année dans le monde 1,2. Le sérotype BTV exotique est un agent pathogène important animale énumérés dans les "USDA Haute Conséquence agents pathogènes du bétail." Récemment, la ré-émergentes de BTV a causé une épidémie majeure de la maladie chez les bovins et les moutons dans plusieurs pays d'Europe du Nord 3,4. En raison de son importance économique et en tant que système modèle, BTV a fait l'objet d'études moléculaires, génétiques et structurales étendues, et plusieurs vaccins ont été mis au point. Toutefois, en raison de l'absence de tests adéquats pour la découverte de médicaments antiviraux, il n'y a pas d'antiviraux disponibles contre la maladie.

Dans un récent criblage à haut débit (HTS) de la campagne en utilisant BTV comme système modèle, nous Developed, optimisé et validé un test basé sur CPE à identifier des antiviraux à large spectre contre les arbovirus potentiels 5. Dosage à base de CPE est un test bien connu qui a été utilisé dans la découverte de médicaments antiviraux contre un certain nombre de virus qui induit rapide et observable CPE / apoptose 5-7. Dans notre système, après l'infection virale, CPE est évident dans les cellules de vertébrés, y compris les cellules HeLa, BSR, et HEK 293T 8. CPE BTV-induite peut être surveillée et quantifiée à l'aide de divers procédés de détection de la viabilité cellulaire, y compris le kit de réactifs de viabilité cellulaire CellTiter Glo (kit CTG) 9. Cet ensemble détermine le nombre de cellules viables dans la culture sur la base de la quantification de l'ATP cellulaire présenté, ce qui signale la présence de cellules vivantes métaboliquement actives. Dans des conditions optimisées, le dosage à base de CPE-présentée ici a montré sa faisabilité avec le "mélanger et mesurer" protocole en une étape, et la flexibilité avec des signaux luminescents stables. Pendant ce temps, les composés toxiques Reducement viabilité cellulaire sera exclu de cette analyse à base de CPE. Le dosage à base de CPE-a montré sa robustesse et sa fiabilité pour antivirale découverte de médicaments contre la maladie, et a été utilisé pour cribler des bibliothèques moléculaires référentiel NIH petites molécules (MLSMR), ce qui conduit à l'identification de six nouveaux groupe de potentiel antiviral composé de plomb (s ) 5.

Quand un composé antiviral potentiel a été identifié en utilisant l'essai à base de CPE, il devra être soumis à l'essai dose-réponse dix-concentration pour déterminer la plage d'efficacité antivirale et la cytotoxicité 2. L'efficacité antivirale, représentée comme la concentration inhibitrice 50% (CI 50), soit la concentration efficace 50% (EC50) est la concentration d'un médicament qui inhibe la CPE à mi-chemin viro-induite entre la ligne de base et au maximum. La cytotoxicité des antiviraux, c'est à dire la concentration de la cytotoxicité de 50% (CC 50), est la concentrationd'un médicament induisant une cytotoxicité de 50% entre la ligne de base et au maximum. L'indice sélectif (SI), noté 50% SI (SI 50) est calculée à partir de CC 50 / IC 50 qui détermine la spécificité de la antivirale contre le CPE induit par un virus. La CI 50 (ou 50 CE), CC 50 et SI 50 valeurs sont des mesures essentielles pour déterminer si un composé antiviral est puissant et sélectif pour la poursuite du développement de médicaments.

Quand un antiviral n'a montré aucune toxicité manifeste in vitro, encore empêché virus induit CPE et le cycle de vie virale productive, il est important de caractériser son mode d'action 2. Nous avons lancé cette qualification en réalisant essai ToA pour déterminer l'étape possible (s) de cycle de vie viral qui est affecté par l'antiviral. En général, composé antiviral ont été ajoutés à des cellules à différents moments pré-ou post-infection virus. Si les antiviraux ont été ajoutés à des cellules infectées poster à son objectif detep au cours de l'infection, il en résulterait une activité plus faible par rapport à celle qui a été ajoutée avant l'étape. Ainsi, l'étude ToA est critique pour la détermination de l'efficacité antivirale d'un composé, et sa cible potentielle, soit sur le cycle de vie viral ou la machinerie de l'hôte impliquées dans le cycle de vie viral.

Pour les trois essais, la viabilité cellulaire a été déterminée en utilisant le kit CTG suivant les instructions du fabricant 5. Ce système de détection émet des signaux de luminescence adéquates qui pourraient être analysés à l'aide de divers logiciels en interne. Chaque essai a été validé et effectué au moins en triple exemplaire avec huit répliques. Pour l'ensemble des données obtenues, trois paramètres, y compris la valeur moyenne (AVE), l'écart type (STDEV), et coefficient de variation (CV) ont été analysés afin de déterminer la robustesse de l'analyse. Une fois la robustesse de l'analyse a été déterminé, les données seront analysés et obtenues en utilisant différents biostatistique et graphiquementdes outils de c 2.

Protocole

Une. Cellules, virus et les composés antiviraux

  1. Maintenir les cellules BSR, un dérivé de rein de bébé hamster (BHK), les cellules 10 dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 5% de sérum de veau foetal (FCS), 100U/ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine.
  2. Pour les trois essais, les cellules de la plaque dans du DMEM avec 1% de FCS, 100U/ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine, comme précédemment optimisés 5. Ce milieu est désigné en tant que milieu de test pour chacun des trois essais.
  3. Incuber les cellules dans l'incubateur à 37 ° C, avec 5% de CO 2 et de 80 à 95% d'humidité.
  4. Plaque-purifier et de propager le type 10 BTV (BTV-10) comme décrit précédemment 8. Diluer BTV-10 en milieu de dosage pour chacun des essais désignés.
  5. Dissoudre tous les composés d'essai dans du DMSO pour former un stock de concentration à 10 mM. Conserver les stocks à -20 ° C.
  6. Diluer les composés à des concentrations désirées en utilisant un milieu de dosage pour la personne désignéed 2 dosages.

2. Essai sur la base-CPE en utilisant le kit CTG

  1. Semences cellules BSR dans une microplaque 384 puits (noir, le format de 16 x 24) par l'intermédiaire MicroFlo sélectionnez distributeur. La densité d'ensemencement est de 5000 cellules / puits et le volume d'ensemencement est de 20 pi pour l'analyse de l'efficacité antivirale.
  2. Incuber les cellules pendant 2-3 heures jusqu'à obtenir des cellules adhérentes à la plaque à fond.
  3. Ajouter composé antiviral avec une concentration finale de 10 pM à chaque puits. Mélanger complètement.
  4. Diluer BTV à titre désiré et ajouter 5 pi BTV avec MOI notée à chaque puits. Pour le contrôle du puits, ajouter 5 ul de milieu de dosage. Incuber les cellules infectées pour 72 heures à 37 ° C, avec 5% de CO 2 et de 80 à 95% d'humidité.
  5. À 72 hpi, dégel et équilibrer tampon CTG et le substrat CTG lyophilisé à la température ambiante avant de l'utiliser. Reconstituer la solution de réactif CTG homogène en mélangeant l'enzyme / substrat et le réactif lyophilisé tampon selon la thles instructions du fabricant de e.
  6. Equilibrer les plaques de dosage à température ambiante pendant 15 min.
  7. Ajouter un volume égal (25 ul) de réactifs CTG dans chaque puits par un distributeur. Après une incubation de 15 min à température ambiante dans l'obscurité, mesurer des signaux de luminescence en utilisant un lecteur multi-mode avec un temps d'intégration de 0,1 s.

3. Dose-réponse Assay

  1. Semence des cellules BSR dans une microplaque à 384 puits (noir; format en 16 x 24) par l'intermédiaire d'un distributeur, avec une densité d'ensemencement de 5000 cellules / puits dans un volume d'ensemencement de 20 ul pour le dosage de l'efficacité antivirale et 25 ul pour le dosage de cytotoxicité, respectivement .
  2. Incuber les cellules pendant 2-3 heures à 37 ° C, avec 5% de CO 2 et de 80 à 95% d'humidité jusqu'à ce que les cellules sont bien fixés à la plaque.
  3. Procédé de dosage dans une zone de quart de la plaque de 384 puits pour chaque composé (équivalent à une plaque de 96 puits), comme indiqué dans le tableau 1. Allouer huit répétitions pour chaque concentrationdans un seul dosage. Attribuez la première colonne que le contrôle positif sans ajout de composé et virus, et la dernière colonne (12 e) comme contrôle négatif en ajoutant virus seulement sans composés.
  4. Diluer les composés à 50 uM dans le milieu d'essai et ajouter à la colonne 2 ème à 20 ul / puits pour le dosage de l'efficacité antivirale. Mélanger le composé à cinq reprises en utilisant une pipette à 8 canaux semi-automatique à une concentration de 25 uM.
  5. Utilisation de la pipette semi-automatique à 8 canaux, transférer 20 mélange de pi en 2 ème colonne à la colonne suivante (3 e), bien mélanger pour former une concentration de 12,5 uM. Répéter ce processus en transférant 20 ul de mélange de 3 ème colonne de la colonne suivante (4 e) pour former une autre double dilution à une concentration de 6,25 pM. Répétez cette dilution en série deux fois jusqu'à la 11 ème colonne. Aspirer et jeter 20 pi du mélange dans 11 ième colonne après l'ajout et le mélange de l'échantillonplaies.
  6. Ajouter basé sur MOI de 0,01 BTV-10,, dans chaque puits de la colonne 2 à la colonne 11 avec un volume de 5 ul / puits. Après avoir ajouté le virus, la concentration en composé final dans chaque colonne doit être de: 20 uM dans la colonne 2, 10 uM dans la colonne 3, et continue avec une dilution au double de la colonne 11 vers le bas avec une concentration finale de 0,04 uM.
  7. Ajouter 5 ul de milieu à la colonne 1 que la cellule ne contrôle (positif) et 5 pl / puits de BTV à la colonne 12 de l'infection virale ne contrôle (négatif).
  8. Diluer les composés à une concentration initiale de 200 uM pour le dosage de cytotoxicité. De même, ajouter 25 pl / puits de composé à la colonne 2 et 5 fois mélangé avec pipette semi-automatique à 8 canaux à une concentration de 100 uM. Ne pas ajouter de BTV.
  9. Effectuer la série dilution deux fois par aspiration 25 pi de la colonne 2 de la colonne voisine 3, et a continué jusqu'à la dernière colonne (12 e). A la colonne 12, après mélange, aspirer et rejeter 25 ul de mélange. La concentration finale de la colonne 2 doit être de 100 uM et le 12 e colonne doit être à 0,2 uM. La colonne 1 est le seul contrôle de la cellule.
  10. Pour les deux dosages de cytotoxicité et de l'efficacité antivirale, incuber les plaques à 37 ° C, avec 5% de CO 2 et de 80 à 95% d'humidité pendant 72 post-traitement d'une heure. Mesurer la viabilité des cellules en utilisant le kit CTG comme décrit ci-dessus (protocole étapes 2.5 à 2.7).

4. Temps de Addition (TOA) Dosage

  1. Cellules semences de BSR de la colonne 1-24 dans une microplaque 384 puits (noir, le format de 16 x 24) par l'intermédiaire d'un distributeur à 5.000 cellules / puits et le volume de semis est de 15 pl / puits.
  2. Pour chaque composé, utiliser toutes les vingt-quatre colonnes avec huit répliques pour chaque point de temps dans une moitié de la plaque de 384 puits (tableau 2). Attribuer la colonne 1 que les cellules ne contrôle en ajoutant 10 pl / puits moyen essai. Mark colonne 24 que l'infection virale que de contrôle (contrôle négatif) en ajoutant 5 ul / puits dosage moyen d'unvirus d 5 ul / puits à une MOI de 0,01 et un volume final de 25 pl / puits.
  3. Sélectionnez les colonnes impaires de la colonne 2-22 de la colonne d'évaluation de l'efficacité comme antiviral à différents infection heures de poste (HPI). Dans ces colonnes, infecter les cellules avec 5 pl / puits BTV à une MOI de 0,01. Au hpi différent, aussi ajouter 5 ul / puits composé dilué dans chaque puits pour former un volume final de 25 pl / puits. Pour le notées -2 et -1 hpi ajouter composé de cellules BSR avant l'infection virale. Pour 0 hpi, ajouter le composé et BTV à la culture en même temps.
  4. En parallèle, désigner les colonnes impaires à partir de la colonne 3 à 23 en tant que composé ne contrôle que, de ce composé ont été ajoutés à différents points de temps désigné (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 hpi). Dans ces colonnes, ajouter 5 pl de milieu / puits de dosage et de 5 pl / puits dilué composé pour former un volume final de 25 pl / puits.
  5. Après le traitement, les cellules incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 avec 80 à 95% d'humidité.
  6. Déterminer la viabilité des cellules à 72 hpi en utilisant le kit CellTiter-Glo comme décrit précédemment (protocole étapes 2.5 à 2.7).

5. Analyse des données

  1. Traiter toutes les données de la première utilisation du logiciel approprié en interne sur la base des signaux luminescents obtenus via le lecteur multi-mode. Déterminer la valeur moyenne (moyenne), l'écart-type (STDEV) pour chaque traitement ainsi que les variations de coefficient (CV), qui nécessite une valeur supérieure à 10%.
  2. Transférer les données traitées par le logiciel ci-dessus pour un outil logiciel biostatique et graphique. Effectuer l'analyse de régression non linéaire pour déterminer les valeurs de la CE 50 et CC 50.

Résultats

Une. Efficacité antivirale du composé

Le dosage de la CPE à base de cellules a été développé, optimisé et validé in vitro en utilisant le kit CTG base luminescente à identifier de nouveaux antiviraux contre la maladie, comme décrit précédemment 2,5. Le dosage de la réponse dix-dose a été utilisée pour tenir compte de l'efficacité antivirale et la cytotoxicité d'un composé de plomb identifiés en mesurant le nombre de cellules métaboliquement viab...

Discussion

Pour l'identification initiale des résultats antiviraux, l'une des étapes clés pour la découverte de médicaments antiviraux et de développement est de développer des tests robustes, qui comprend la sélection d'un marqueur quantifiable, l'élaboration d'un protocole simple, obtenir suffisamment de signaux et moins de 10% CV. La plupart des écrans biochimiques ou cellulaires sont conçus pour fournir un point de départ chimique sur la base du plus robuste, un test simple et peu coûteux, en r...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Ce projet a été financée par la subvention 1R03MH08127-01 et 7R03MH08127-02 du NIH à Q. Li, et par les fonds d'IMPACT du Département de médecine de l'UAB à Q. Li. Le soutien du Fonds Molette et l'Université d'Auburn est appréciée. Nous remercions également les aides techniques de Mme Pulin Che et M. Volodymyr Musiienko au cours des travaux.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM mediumGibco1134218For cell culture
FBSGibco16000044For cell culture
0.05% Trypsin-EDTAGibco1000185For cell culture
DPBSGbico1049769For cell culture
CellTiter-Glo (CTG) kitPromegaTB288For cell viability measurement
70% ethanolFisherS25309BDiluted from 95%
Antiviral huashilcompoundsNIH MLSMR and de novo synthesis
BTV-10ATCCVR-187
BSR cellDeveloped in house
Synergy-II multi-mode microplate readerBioTekFor luminescent signal reading
MicroFlo select dispenserBioTekAdding cells, virus, and reagents
384-well flat-bottom microplateCORNING28908031For cell culture
Gen. 5 softwareBioTekFor analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader
GraphPad Prism 5GraphPadVersion 5For biostatic analysis and plot

Références

  1. Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
  2. Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341 (2012).
  3. Meiswinkel, R., et al. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective. Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).
  4. Szmaragd, C., et al. Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007. Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).
  5. Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus. Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).
  6. Noah, J. W., et al. A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals. Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).
  7. Che, P., Wang, L., Li, Q. The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus. Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).
  8. Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis. Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).
  9. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  10. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
  11. Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).
  12. Harvey, T. J., et al. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles. J. Virol. 78, 531-538 (2004).
  13. Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).
  14. Puig-Basagoiti, F., et al. Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).
  15. Duan, M., et al. In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide. Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).
  16. Ray, D., Shi, P. Y. Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).
  17. Severson, W. E., et al. High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2). J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).
  18. Severson, W. E., et al. Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library. J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).
  19. Bolken, T. C., et al. Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses. Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).
  20. Van Loock, M., et al. A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors. J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).
  21. Kampmann, T., et al. In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses. Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).
  22. Kirchmair, J., et al. Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques. Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).

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