Saggi per l'individuazione di nuovi antivirali contro virus della Bluetongue

Riepilogo

Tre saggi, tra cui l'effetto citopatico (CPE) a base di test, analisi dose-risposta e Time-of-Addition (ToA) test sono stati sviluppati, ottimizzati, validati ed utilizzati per identificare nuovi farmaci antivirali contro il virus della Bluetongue (BTV), nonché per determinare il meccanismo d'azione possibile (MOA) per i farmaci antivirali di nuova identificazione.

Abstract

Per identificare potenziali farmaci antivirali contro il BTV, abbiamo sviluppato, ottimizzato e validato tre saggi qui presentati. Il saggio basato CPE-è stato il primo test sviluppato per valutare se un composto ha mostrato alcuna efficacia antivirale e sono stati utilizzati per lo screening grande libreria di composti. Nel frattempo, la citotossicità di farmaci antivirali potrebbe anche essere valutata utilizzando il saggio basato CPE-. Il dosaggio dose-risposta è stato progettato per determinare il campo di efficacia per l'antivirale prescelto, cioè il 50% della concentrazione inibente (IC ₅₀₎ o la concentrazione effettiva (EC _50), così come la sua gamma di citotossicità (CC _50). Il saggio ToA è stato impiegato per lo studio iniziale MoA per determinare il meccanismo alla base dei nuovi farmaci antivirali durante il ciclo di vita virale del virus o il possibile effetto su un host macchinario cellulare. Questi test sono essenziali per la valutazione dell'efficacia antivirale nel sistema di coltura cellulare, e sono stati utilizzati per le nostre ricerche recenti portarezione per l'identificazione di una serie di nuovi farmaci antivirali contro il BTV.

Introduzione

BTV è un prototipo di virus a RNA a doppio filamento in genere Orbivirus, famiglia Reoviridae. BTV è una delle malattie più importanti del bestiame domestico, tra cui ovini, caprini, bovini e altri animali domestici, con la perdita di 3.000 milioni dollari / anno nel mondo ^1,2. La BTV sierotipo esotico è un importante patogeno animale elencati nella sezione "USDA alta Consequence Bestiame patogeni." Recentemente, il riemergere di BTV ha causato una grave focolaio di malattia in bovini e ovini in diversi paesi in tutto il Nord Europa ^3,4. Come risultato della sua rilevanza economica e come sistema modello, BTV è stato oggetto di approfonditi studi molecolari, genetici e strutturali, e sono stati sviluppati diversi vaccini. Tuttavia, a causa della mancanza di test adeguati per la scoperta di farmaci antivirali, non ci sono disponibili antivirali contro BTV.

In un recente screening ad alto rendimento (HTS) campagna usando BTV come sistema modello, Developed, ottimizzato e convalidato un saggio basato CPE-per identificare i potenziali antivirali ad ampio spettro contro arbovirus ^5. Saggio basato CPE-è un saggio ben riconosciuto che è stato usato nella scoperta di farmaci antivirali contro una serie di virus che ha indotto un rapido e osservabile CPE / apoptosi ^5-7. Nel nostro sistema, infezioni post BTV, CPE è evidente nelle cellule dei vertebrati, tra cui HeLa, BSR, e HEK 293T ^8. CPE BTV-indotta potrebbe essere monitorato e quantificato utilizzando vari metodi di rilevamento vitalità cellulare, compreso il kit di reagenti vitalità cellulare CellTiter Glo (kit CTG) ^9. Questo kit determina il numero di cellule vitali in coltura a base di quantificazione di ATP cellulare presentato, che segnala la presenza di cellule viventi metabolicamente attive. In condizioni ottimali, il saggio basato CPE-qui presentato ha dimostrato la sua fattibilità con il protocollo di un passo "mix e misura", e la flessibilità con i segnali luminescenti stabili. Nel frattempo, composti tossici riduziamento vitalità cellulare sarà escluso in questo saggio basato CPE. Il saggio basato CPE-ha mostrato la sua robustezza e affidabilità per la scoperta di farmaci antivirali contro BTV, ed è stato utilizzato per schermare il NIH molecolare Biblioteche Piccolo Molecola Repository (MLSMR), che porta alla identificazione di sei romanzo gruppo di potenziali lead compound antivirale (s ) ^5.

Quando un composto antivirale potenziale è stato identificato utilizzando il saggio basato CPE-, esso dovrà essere sottoposto al dieci concentrazione dosaggio dose-risposta per determinare l'intervallo di efficacia antivirale e citotossicità ^2. L'efficacia antivirale, rappresentata come la concentrazione inibitoria del 50% (IC ₅₀₎ o la concentrazione efficace 50% (EC _50), è la concentrazione di un farmaco che inibisce virus-indotto CPE metà strada tra la linea di base e massimo. La citotossicità dei farmaci antivirali, cioè la concentrazione citotossicità 50% (CC _50), è la concentrazionedi un farmaco che induce il 50% di citotossicità tra la linea base e massimo. L'indice selettivo (SI), indicato come 50% SI (SI ₅₀₎ è calcolata da CC ₅₀ / IC ₅₀ che determina la specificità del CPE antivirale contro virus-indotta. L'IC ₅₀ (o ₅₀ CE), CC ₅₀ e SI ₅₀ valori sono misure fondamentali per determinare se un composto antivirale è potente e selettivo per l'ulteriore sviluppo della droga.

Quando un antivirale ha mostrato alcuna tossicità manifesta in vitro, ma virus impedito indotto CPE e il ciclo di vita virale produttiva, è importante per determinarne la MoA ^2. Abbiamo avviato tale caratterizzazione effettuando test ToA per determinare l'eventuale fase (s) di virale ciclo di vita che è influenzata dal antivirale. In generale, composto antivirale sono stati aggiunti alle cellule in diversi momenti pre-o post-infezione da virus. Se gli antivirali sono stati aggiunti alle cellule infettate rispondere alla sua destinazione step durante il corso dell'infezione, ne risulterebbe minore attività rispetto a quella che è stata aggiunta prima della fase. Così, studio ToA è critica per determinare l'efficacia di un composto antivirale, e il suo potenziale bersaglio, sia sul ciclo di vita virale o della macchina ospitante coinvolti nel ciclo di vita virale.

Per tutti e tre saggi, la vitalità cellulare è stata determinata utilizzando il kit CTG seguenti istruzioni del produttore ^5. Questo sistema di rilevamento emette adeguati segnali di luminescenza che potrebbero essere analizzate utilizzando i vari software in-house. Ogni test è stato convalidato ed eseguito in almeno tre esemplari con otto repliche. Per tutti i dati ottenuti, tre parametri, con un valore medio (AVE), deviazione standard (DEVST), e coefficiente di variazione (CV) sono stati analizzati per determinare la robustezza del dosaggio. Una volta che la robustezza del saggio è stata determinata, i dati saranno ulteriormente analizzati e tracciati utilizzando vari biostatics e graficamentestrumenti di C ^2.

Protocollo

1. Le cellule, virus e antivirale Compounds

1. Mantenere cellule BSR, un derivato di criceto neonato (BHK) rene alveoli ^10, in mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) contenente siero fetale di vitello al 5% (FCS), 100U/ml penicillina e 100 pg / ml streptomicina.
2. Per tutti e tre saggi, cellule piastra in DMEM con 1% FCS, 100U/ml penicillina e 100 pg / ml streptomicina, ottimizzata in precedenza ^5. Questo mezzo è indicato come terreno di coltura per tutti e tre saggi.
3. Incubare tutte le celle in incubatrice a 37 ° C, con 5% di CO ₂ e 80-95% di umidità.
4. Targa-purificare e propagare il tipo 10 BTV (BTV-10) come descritto in precedenza ^8. Diluire BTV-10 nel mezzo di saggio per ogni saggi designati.
5. Sciogliere tutti i composti di prova in DMSO per formare uno stock con concentrazione a 10 mm. Conservare le scorte a -20 ° C.
6. Diluire composti a concentrazioni desiderate utilizzando terreno di coltura per il designatod saggi ^2.

2. Saggio-based CPE Uso CTG Kit

1. Seed cellule BSR in una micropiastra 384 pozzetti (nero, formato da 16 x 24) con MicroFlo selezionare dispenser. La densità di semina è di 5.000 cellule / pozzetto, e il volume di semina è di 20 microlitri per l'analisi di efficacia antivirale.
2. Incubare le cellule per 2-3 ore sino cellule ottenere aderente alla piastra di fondo.
3. Aggiungere composto antivirale con una concentrazione finale di 10 mM di ciascun pozzetto. Mescolare completamente.
4. Diluire BTV a titolo desiderato e aggiungere 5 ml BTV con denotato MOI a ciascun bene. Per il controllo bene, aggiungere 5 ml di mezzi di dosaggio. Incubare le cellule infettate per 72 ore a 37 ° C, con 5% di CO ₂ e 80-95% di umidità.
5. A 72 hpi, disgelo ed equilibrare tampone CTG e il substrato CTG liofilizzato a temperatura ambiente prima dell'uso. Ricostituire la soluzione omogenea reagente CTG miscelando il liofilizzato enzima / substrato e il reagente tampone secondo thle istruzioni e del produttore.
6. Equilibrare le piastre di saggio a temperatura ambiente per 15 min.
7. Aggiungere un volume uguale (25 microlitri) di reagenti CTG a ciascun pozzetto da un dispenser. Dopo incubazione per 15 minuti a temperatura ambiente al buio, misurare segnali di luminescenza utilizzando un lettore multi-mode con un tempo di integrazione di 0,1 sec.

3. Dose-risposta Assay

1. Seme cellule BSR in una micropiastra a 384 pozzetti (nero, formato da 16 x 24) tramite un distributore, con una densità di semina di 5000 cellule / pozzetto in un volume semina di 20 microlitri per saggio antivirale efficacia e 25 pl per test di citotossicità, rispettivamente .
2. Incubare le cellule per 2-3 ore a 37 ° C, con 5% di CO ₂ e 80-95% di umidità fino cellule sono ben attaccato alla piastra.
3. Saggio processo in una zona quarto della piastra a 384 pozzetti per ogni composto (equivalente ad una piastra a 96 pozzetti), come mostrato nella Tabella 1. Allocare otto repliche per ogni concentrazionein un singolo dosaggio. Assegnare la prima colonna come controllo positivo senza aggiungere composti e virus, e l'ultima colonna (12 ^°) come controllo negativo aggiungendo virus solo senza composti.
4. Diluire composti a 50 mM in mezzo di saggio e aggiungere alla colonna 2 ^° a 20 pl / pozzetto di saggio antivirale efficacia. Mescolare il composto cinque volte usando 8 canali pipetta semiautomatico ad una concentrazione di 25 mM.
5. Utilizzando 8-channel pipetta semi-automatico, trasferire 20 microlitri miscela in 2 ^° colonna per colonna successiva (3 ^°), mescolare bene per formare una concentrazione di 12,5 micron. Ripetere questo processo trasferendo 20 microlitri miscela di colonna ³ al colonna successiva (4 ^°) per formare un altro diluizioni doppie con una concentrazione di 6,25 pM. Ripetere questa diluizione seriale duplice fino al 11 ^esima colonna. Aspirare ed eliminare 20 microlitri della miscela nella 11 ^esima colonna dopo l'aggiunta e la miscelazione del compound.
6. Aggiungere BTV-10, sulla base MOI di 0,01, ad ogni pozzetto da colonna a colonna 2 11 con un volume di 5 ml / pozzetto. Dopo aver aggiunto il virus, la concentrazione del composto finale in ciascuna colonna deve essere: 20 mM in colonna 2, 10 mM in colonna 3, e prosegue con una diluizione duplice giù a colonna 11 con una concentrazione finale di 0,04 pM.
7. Aggiungere 5 ml di gamma medio colonna 1 come cellule di controllo solo (positivo) e 5 ml / pozzetto di BTV alla colonna 12 come infezione BTV unico controllo (negativo).
8. Diluire composti ad una concentrazione iniziale di 200 pM per test di citotossicità. Analogamente, aggiungere 25 microlitri / pozzetto di composto alla colonna 2 e 5x mescolato con 8 canali pipetta semiautomatico ad una concentrazione di 100 mM. Non aggiungere BTV.
9. Eseguire la diluizione serie duplice aspirando a 25 microlitri dalla colonna 2 alla colonna vicina 3, e continuò fino all'ultima colonna (12 ^°). Alla colonna 12, dopo la miscelazione, aspirare e scartare 25 ml di mixture. La concentrazione finale in colonna 2 dovrebbe essere di 100 micron e la 12 ^esima colonna deve essere di 0,2 micron. La colonna 1 è l'unico controllo cella.
10. Per entrambi l'efficacia e la citotossicità saggi antivirali, incubare le piastre a 37 ° C, con il 5% di CO ₂ e 80-95% di umidità per 72 ore dopo il trattamento. Misurare la vitalità cellulare utilizzando il kit di CTG come descritto sopra (protocollo passaggi 2,5-2,7).

4. Time-of-Addition (ToA) Assay

1. Seme cellule BSR da 1-24 colonna in una micropiastra a 384 pozzetti (nero, formato da 16 x 24) tramite un dispenser a 5.000 cellule / pozzetto e il volume semina è 15 microlitri / pozzetto.
2. Per ogni composto, utilizzare tutti ventiquattro colonne con otto repliche per ogni punto temporale in una metà della piastra a 384 pozzetti (Tabella 2). Assegnare colonna 1 come cellule controllo solo con l'aggiunta di 10 microlitri / pozzetto terreno di coltura. Mark colonna 24 come infezione BTV solo controllo (controllo negativo) aggiungendo 5 microlitri / pozzetto dosaggio medio divirus d 5 microlitri / pozzetto a MOI di 0,01 ad un volume finale di 25 microlitri / pozzetto.
3. Selezionare le colonne con numeri da colonna 2-22 come antivirale colonna di valutazione di efficacia in diverse ore dopo l'infezione (HPI). In queste colonne, infettare le cellule con 5 ml / pozzetto BTV al MOI di 0.01. Al diversa hpi, aggiungi 5 microlitri / composto ben diluito ad ogni pozzetto per formare un volume finale di 25 microlitri / pozzetto. Per il indicati -2 e -1 HPI aggiungono composto da cellule BSR prima infezione BTV. Per 0 hpi, aggiungere il composto e BTV alla cultura contemporanea.
4. Parallelamente, designare le colonne dispari da colonna 3-23 come composto controlla solo, dei quali composto sono stati aggiunti a diversi punti temporali come designato (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 HPI). In queste colonne, aggiungere 5 microlitri medio / pozzetto dosaggio e 5 microlitri / pozzetto diluito composto per formare un volume finale di 25 microlitri / pozzetto.
5. Dopo il trattamento, incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO ₂ con 80-95% di umidità.
6. Determinare la vitalità cellulare a 72 HPI utilizzando il kit CellTiter-Glo come descritto in precedenza (protocollo passaggi 2,5-2,7).

5. Analisi dei dati

1. Elaborare tutti i dati del primo utilizzo corretto del software in-house in base ai segnali luminescenti ottenuti tramite il lettore multi-mode. Determinare il valore medio (media), la deviazione standard (DEVST) per ogni trattamento, nonché le variazioni coefficiente (CV), che richiede un valore non superiore al 10%.
2. Trasferire i dati elaborati dal software di cui sopra per un software biostatico e grafica. Effettuare l'analisi di regressione non lineare per determinare i valori di EC ₅₀ e CC _50.

Risultati

1. Efficacia antivirale del composto

Il saggio CPE a base di cellule è stato sviluppato, ottimizzato e validato in vitro utilizzando il kit CTG basata luminescenti a identificare nuovi farmaci antivirali contro BTV come descritto in precedenza ^2,5. Il test di risposta ten-dose è stata impiegata per riflettere l'efficacia antivirale e citotossicità di un composto guida identificato misurando il numero di cellule metabolicamente vitali in coltura a base di quantificazio...

Discussione

Per l'identificazione iniziale di colpi antivirali, uno dei passaggi chiave per la scoperta di farmaci antivirali e di sviluppo è quello di sviluppare analisi robuste, che prevede la selezione di un indicatore quantificabile, lo sviluppo di un protocollo semplice, ottenendo segnali sufficienti e meno del 10% CV. Quasi tutte le schermate biochimiche o basati su cellule sono progettati per fornire un punto di partenza chimica basato sulla più robusta, semplice e poco costoso saggio, causa la riproducibilità richies...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM medium	Gibco	1134218	For cell culture
FBS	Gibco	16000044	For cell culture
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	1000185	For cell culture
DPBS	Gbico	1049769	For cell culture
CellTiter-Glo (CTG) kit	Promega	TB288	For cell viability measurement
70% ethanol	Fisher	S25309B	Diluted from 95%
Antiviral huashilcompounds	NIH MLSMR and de novo synthesis
BTV-10	ATCC	VR-187
BSR cell	Developed in house
Synergy-II multi-mode microplate reader	BioTek		For luminescent signal reading
MicroFlo select dispenser	BioTek		Adding cells, virus, and reagents
384-well flat-bottom microplate	CORNING	28908031	For cell culture
Gen. 5 software	BioTek		For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader
GraphPad Prism 5	GraphPad	Version 5	For biostatic analysis and plot