Bluetongue 바이러스에 대한 항 바이러스제 소설의 식별에 대한 분석

요약

세포 변성 효과 (CPE) 기반의 분석, 용량 - 반응 분석 및 시간 - 중 - 추가 TOA () 분석 등의 세 가지 분석은 물론, 개발, 최적화, 검증 및 Bluetongue 바이러스에 대한 새로운 항 바이러스제 (BTV)를 식별하기 위해 사용 된 새로 확인 된 항 바이러스제에 사용할 수있는 기계 장치의 액션 (대학교 미술관)을 결정하기로.

초록

BTV에 대한 잠재적 인 항 바이러스제를 확인하기 위해, 우리는 개발, 최적화 및 여기에 제시된 세 가지 분석을 확인했다. CPE 기반의 분석은 화합물은 항 바이러스 효능을 보여 큰 화합물 라이브러리를 화면으로 사용되었는지 여부를 평가하기 위해 개발 된 최초의 분석이었다. 한편, 항 바이러스의 세포 독성은 CPE 기반 분석을 사용하여 평가 될 수있다. 용량 - 반응 분석을 선택된 바이러스에 대한 효능의 범위를 결정하기 위해 디자인 된, 50 % 억제 농도 (IC _50)이나 유효 농도 (EC _50)뿐만 아니라 세포 독성의 범위 (CC ₅₀₎ 즉. 토아 분석은 BTV 바이러스 라이프 사이클 또는 호스트 세포 기계에 대한 가능한 영향 동안 새로운 항 바이러스제의 기본 메커니즘을 결정하는 최초의 대학교 미술관의 연구에 사용 하였다. 이러한 분석은 세포 배양 시스템의 항 바이러스 효능을 평가하는데 매우 중요합니다, 우리의 최근의 연구지도를 위해 사용되어왔다BTV에 대한 새로운 항 바이러스제의 숫자의 식별을 보내고.

서문

BTV는 속 Orbivirus, 가족 Reoviridae에 프로토 타입 이중 가닥 RNA 바이러스이다. BTV는 세계 ^1,2 30억달러 / 년 손실, 양, 염소, 소와 다른 가축 등 국내 가축의 가장 중요한 질병 중 하나입니다. 이국적인 BTV의 혈청 형에 나열된 중요한 동물 병원체는 "USDA 높은 위험성 평가 가축 병원체." 최근 다시 부상 BTV의 북부 유럽 ^3,4에 걸쳐 여러 국가의 주요 가축 질병의 발생과 양을 발생했습니다. 경제적으로 중요한 결과 및 모델 시스템으로서, BTV는 유용한, 분자 유전 학적 및 구조적 연구의 대상이되어 왔으며, 몇몇 백신이 개발되었다. 그러나, 항 바이러스 약물 발견을위한 적합한 분석법의 부족 때문에, BTV 대에는 항 바이러스제는 없다.

모델 시스템으로 BTV를 사용하여 최근의 높은 처리량 검사 (HTS) 캠페인, 우리는 거라고, eveloped 최적화 아르보 바이러스 ^5에 대한 잠재적 인 광범위한 스펙트럼 항 바이러스를 식별 할 수있는 CPE 기반의 분석을 확인. CPE 기반의 분석은 신속하고 관찰 할 수있는 CPE / 세포 사멸 ^5-7을 유발 바이러스의 숫자에 대한 항 바이러스 약물 발견에 사용 된 잘 인식 분석이다. 우리의 시스템에서, 포스트 BTV 감염, CPE는 헬라, BSR 및 HEK 293T ^8을 포함한 척추 동물의 세포에 분명하다. BTV 유도 CPE는 CellTiter 글로 세포 생존 시약 키트 (CTG 키트) ^9를 포함한 다양한 세포 생존 검출 방법을 사용하여 모니터링하고 정량화 할 수있다. 이 키트는 대사 적으로 활성 살아있는 세포의 존재를 신호 셀룰러 ATP의 정량에 기초 문화 가능한 세포의 개수 표시를 결정한다. 최적의 조건에서, 여기에 제시된 CPE 기반의 분석은 "혼합 및 측정"한 단계 프로토콜 및 안정 발광 신호와 유연성의 가능성을 보여 주었다. 한편, 독성 화합물의 redu세포 생존 능력을의 cing은이 CPE 기반 분석에서 제외됩니다. CPE 기반의 분석은 그 견고성과 BTV에 대한 항 바이러스 약물 발견을위한 신뢰성을 보여 잠재적 인 항 바이러스 리드 화합물 (들 여섯 새로운 클러스터의 식별에지도하는 NIH 분자 도서관 작은 분자 저장소 (MLSMR)를 화면에 사용 된 ) ^5.

잠재적 인 항 바이러스 화합물을 CPE 기반 분석을 사용하여 확인 된 경우는 항 바이러스 효능 및 독성 ^2의 범위를 결정하기 위하여 열 - 농도 용량 - 반응 분석을 실시 할 필요가있을 것이다. 항 바이러스 효능은 50 % 억제 농도 (IC ₅₀₎ 또는 50 % 유효 농도 (EC _50)로 표현,베이스 라인과 최대 사이에 바이러스에 의한 CPE 반 억제하는 약물의 농도이다. 항 바이러스제의 세포 독성은, 50 %의 세포 독성 농도 (CC ₅₀₎ 즉, 농도는기준선과 최대 사이의 50 % 세포 독성을 유발하는 약물. 50 % SI (SI _50)로 표시 선택적 지수 (SI)는 바이러스에 의한 CPE에 대한 항 바이러스의 특이성을 결정 CC ₅₀ / IC _{(50)로부터} 계산된다. IC ₅₀ (또는 EC _50), CC _(50)와 SI ₍₅₀₎ 값은 항 바이러스 화합물은 강력하고 더 약물 개발을위한 선택 여부를 확인하는 중요한 조치이다.

항 바이러스가 시험 관내에서 어떠한 명백한 독성을 나타내지 않았다 아직 방지 바이러스 CPE 및 생산성 바이러스 라이프 사이클을 유도 할 때, 그 ² 대학교 ^미술관을 특성화하는 것이 중요하다. 우리는 바이러스에 의해 영향 바이러스 라이프 사이클의 수 단계 (들)를 결정하기 위하여 토아 분석을 수행하여 그러한 특성을 개시. 일반적으로, 항 바이러스 화합물을 상이한 시간 전 또는 후 바이러스 감염시 세포에 첨가 하였다. 항 바이러스가 감염된 세포에 추가 된 경우 그 대상들에 게시이전 단계에 첨가 한 비교하여 TEP 감염 과정 동안, 그것은 낮은 활성을 초래할 것이다. 따라서, 토아 연구는 하나의 바이러스 라이프 사이클 또는 바이러스 성 수명주기에 관여 호스트 기계에, 화합물의 항 바이러스 효능, 그것의 잠재적 인 대상을 결정하는 것이 중요합니다.

세 가지 분석법을 위해, 세포 생존율은 제조업체의 지시에 ⁵ 다음 CTG 키트를 사용하여 측정 하였다. 이 검출 시스템은 다양한 내부 소프트웨어를 사용하여 분석 할 수있는 적절한 발광 신호를 출력한다. 각각의 분석은 적어도 8 개의 복제본이 중으로 확인 및 수행 하였다. 모든 콘텐츠 데이터의 경우, 평균값 (AVE), 표준 편차 (STDEV) 및 공동 효율적인 변동 (CV) 등 세 가지 파라미터는, 분석의 견고성을 결정하기 위해 분석 하였다. 분석의 견고성이 결정되면, 데이터가 더 분석하고 다양한 biostatics 및 graphi를 이용하여 나타내 어질 것이다C 공구 ^2.

프로토콜

1. 셀, 바이러스 및 항 바이러스 화합물

1. BSR 세포, 5 % 소 태아 혈청 (FCS)를 포함하는 아기 햄스터 신장의 파생 둘 베코의 변형 이글 배지 (BHK) 세포를 ^{10 일} (DMEM)을 유지, 100U/ml 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신.
2. 세 가지 분석을 위해, 1 % FCS, 100U/ml 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신과 DMEM에 플레이트 세포, ^5는 이전 최적화로. 이 매체는 세 가지 분석을위한 분석 매체로 언급된다.
3. 5 % CO _2와 80~95%의 습도, 37 ° C에서 인큐베이터에있는 모든 세포를 품어.
4. 패 정화 이전에 ⁸ 바와 같이 유형 10 BTV (BTV-10)를 전파. 지정된 각 분석에 대한 분석 매체에 BTV-10을 희석.
5. 10 mM의 농도에서 주식을 형성하기 위해 DMSO의 모든 테스트 화합물을 용해. -20 ° C에서 주식을 저장
6. 를 지정 대한 분석 배지를 사용하여 원하는 농도로 화합물을 희석D의 분석 ^2.

2. CTG 키트를 사용하여 CPE 기반 분석

1. MicroFlo 선택 분배기를 통해, 384 - 웰 마이크로 플레이트 (16 × 24에 의한 형식 검정)에 종자 BSR 세포. 파종 밀도 확실히 5000 세포 /이며, 시딩 양은 항 바이러스 효과 분석 20 μL이다.
2. 세포가 완전히 판에 부착 얻을 때까지 2 ~ 3 시간 동안 세포를 품어.
3. 물론 각각 10 μM의 최종 농도와 항 바이러스 화합물을 추가합니다. 완전히 섞는다.
4. 원하는 역가에 BTV를 희석하고 각 웰에 표시 MOI와 5 μL의 BTV를 추가합니다. 컨트롤에 대해 잘 분석 매체의 5 μl를 추가합니다. 5 % CO _2와 80~95%의 습도, 37 ° C에서 72 시간 동안 감염된 세포를 품어.
5. 72 HPI, 해동하고 사용하기 전에 실온까지 CTG 버퍼 및 동결 건조 CTG 기판을 평형으로. 회에 따른 동결 건조 된 효소 / 기질 및 완충액 시약을 혼합하여 균질 CTG 시약 용액 재구성전자 제조업체의 지침.
6. 15 분 동안 실온으로 분석 플레이트를 평형화.
7. 디스펜서 각 웰에 CTG 시약의 동일한 볼륨 (25 μL)를 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 배양 한 후, 0.1 초 적분 시간에 따라 멀티 모드 리더를 사용하여, 발광 신호를 측정한다.

3. 용량 - 반응 분석

1. 각각 / 잘 항 바이러스 효과 분석 20 μL 및 세포 독성 분석 25 μL의 시드 볼륨 5000 세포의 파종 밀도 디스펜서를 통해, (16 × 24에 의한 형식 검정), 384 - 웰 마이크로 플레이트에 씨 BSR 세포 .
2. 5 % CO ₂ 세포까지 80~95%의 습도, 37 ° C에서 2 ~ 3 시간 동안 세포를 품어 잘 플레이트에 부착된다.
3. 표 1에 나타낸 바와 같이, (96 - 웰 플레이트에 상당) 각 화합물에 대한 384 - 웰 플레이트의 분기 영역에 공정 분석. 각 농도 8 개의 반복 실험을 할당하나의 분석에서. 단지 화합물없이 바이러스를 첨가함으로써 네거티브 대조군으로서 화합물과 바이러스를 추가하지 않고, 양성 대조군으로서 첫번째 열 및 마지막 열 (12 ^회)를 할당.
4. 분석 매체에 50 μm의 화합물을 희석하고 20 μL / 잘 항 바이러스 효능 분석을위한에서 ² 번째 ^열을 추가 할 수 있습니다. 25 μM의 농도로 8 채널 반자동 피펫을 사용하여 화합물을 다섯 번 섞는다.
5. 8 채널 반자동 피펫을 사용하여, 12.5 μM의 농도를 형성하기 위해 잘 섞어, 다음 열 ⁽³ 차)에 2 ^{차 열에서} 20 ㎕의 혼합물을 전송합니다. 6.25 μM의 농도가 다른 두 가지의 희석을 형성하는 다음 칼럼 (4 ^{일)에 3} 번째 ^열에서 20 ㎕의 혼합물을 전송하여이 과정을 반복합니다. 11 ^번째 열까지이 두 가지 직렬 희석을 반복합니다. 기음과 샘플을 추가하고 혼합 한 후 11 ^{일 열에서} 혼합물의 20 μl를 폐기ound.
6. 5 μL / 웰의 볼륨 열 (11)에 2 열에서 각 웰, BTV-10, 0.01의 MOI에 근거를 추가합니다. 바이러스를 추가 한 후, 각 항목의 최종 화합물의 농도가 있어야한다 : 2 열 20 μM, 3 열의 10 μM, 0.04 μM의 최종 농도와 열 (11) 아래로 두 배 희석을 계속.
7. 1 열 중간의 5 μl를 추가 셀 만 (양) 제어 및 BTV 감염으로 열 12 BTV의 5 μL / 잘 만 제어 (마이너스)로.
8. 세포 독성 분석 200 μM의 초기 농도의 화합물을 희석. 마찬가지로, 100 μM의 농도로 8 채널 반자동 피펫으로 2 열 및 혼합 배에 25 μL / 잘 화합물을 추가합니다. BTV를 추가하지 마십시오.
9. 이웃 열 3 열 2에서 25 μl를 흡입하여 두 가지 시리즈의 희석을 수행하고, 마지막 열 (12 ^일)까지 계속했다. 열 (12)에서, 혼합 후, 대기음 및 m의 25 μl를 폐기ixture. 2 열에서 최종 농도는 100 μM해야하며 12 ^번째 열은 0.2 μM에 있어야합니다. 1 열은 셀에만 컨트롤입니다.
10. 모두 항 바이러스 효능과 독성 시험 법의 경우, 5 % CO _2와 72 시간의 후 처리에 대한 80-95%의 습도, 37 ° C에서 접시를 품어. (프로토콜 2.5-2.7 단계) 상술 한 바와 같이 CTG 키트를 사용하여 세포 생존율을 측정한다.

4. 시간의 - 추가 TOA () 분석

1. 5000 세포 / 웰의 디스펜서 및 시드 볼륨을 통해 15 μL / 잘, 384 - 웰 마이크로 플레이트에 열 1-24 (X 24 (16)에 의해 형식 검정)에서 종자 BSR 세포.
2. 각 화합물의 경우, 384 - 웰 플레이트 (표 2)의 절반마다 포인트 8 개의 복제본을 모두 스물 네 열을 사용합니다. 10 μL / 잘 분석 매체를 추가하여 세포만을 제어와 같은 열 1을 할당합니다. 마크 열 (24) 5 μL / 잘 분석 매체를 추가하여 BTV 감염 만 제어 (대조군)으로25 μL / 웰의 최종 부피 0.01 MOI에서 D 5 μL / 잘 바이러스.
3. 열 2-22 다른 시간 후 감염 (HPI)에서와 같은 항 바이러스 효능 평가 열에서 짝수 열을 선택합니다. 이 컬럼에서, 0.01의 MOI에 5 μL / 잘 BTV와 세포를 감염. 다른 HPI에서, 또한 잘 25 μL /의 최종 볼륨을 형성하는 각 웰에 5 μL / 잘 희석 된 화합물을 추가합니다. 에 대한 표시 -2와 -1 HPI 전에 BTV 감염 BSR 세포에 화합물을 추가합니다. 0 HPI를 들어, 동시에 문화 화합물 및 BTV를 추가합니다.
4. 화합물은 대조군으로 병렬, (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16으로 지정되는 화합물은 상이한 시간 지점에서 첨가하고, 컬럼 3-23에서 홀수 열을 지정 24, 48 HPI). 이 컬럼에서, 5 μL / 잘 분석 매체를 추가하고 5 μL / 잘 잘 25 μL /의 최종 볼륨을 형성하는 화합물을 희석.
5. 치료 후, 37 ° C에서 5 % CO _2와 80 ~ 95 %의 습도보기에서 세포를 배양.
6. 이전에 (프로토콜 2.5-2.7 단계) 한 바와 같이 CellTiter 저런 형광 키트를 사용하여 72 HPI에서 세포 생존 능력을 결정합니다.

5. 데이터 분석

1. 멀티 모드 리더를 통해 얻어진 발광 신호에 기초하여 적절한 내부 소프트웨어를 사용하여 제 모든 데이터를 처리한다. 10 %보다 더 큰 값을 필요로하는 평균 값 (평균), 각 치료에 대한 표준 편차 (STDEV)뿐만 아니라 계수의 변화 (CV)를 결정합니다.
2. biostatic 및 그래픽 소프트웨어 도구에 위의 소프트웨어에서 처리 된 데이터를 전송합니다. EC ₍₅₀₎ 및 CC _(50)의 값을 결정하기 위해 비선형 회귀 분석을 수행.

결과

1. 화합물의 항 바이러스 효능

세포 기반 분석 CPE는, 개발 및 최적화 이전 ^2,5 바와 같이 BTV 대해 신규 바이러스제를 식별하는 발광 기반 CTG 키트를 사용하여 시험 관내에서 입증되었다. 열 - 투여 량 반응 분석은 살아있는 세포 ^5,11 제시 세포 ATP의 정량에 기초 문화 대사 생존 세포의 수를 측정함으로써 확인 된 리드 화합물의 항 바이러스 효능 및 독성을 ?...

토론

바이러스 히트 초기 식별, 항 바이러스 약물 발견과 개발을위한 중요한 단계 중 하나는, 정량 가능한 마커를 선택하는 간단한 프로토콜을 개발, 충분한 신호와 10 % 미만의 CV를 획득 포함하는 견고한 분석법을 개발하는 것이다. 대부분의 생화학 적 또는 세포 - 기반 화면 인해 선별 과정에서 필요한 재현성 및 스크리닝하는 분자의 잠재적으로 많은 수의 가장 강력한, 간단하고 저렴한 분석, 기초 화...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM medium	Gibco	1134218	For cell culture
FBS	Gibco	16000044	For cell culture
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	1000185	For cell culture
DPBS	Gbico	1049769	For cell culture
CellTiter-Glo (CTG) kit	Promega	TB288	For cell viability measurement
70% ethanol	Fisher	S25309B	Diluted from 95%
Antiviral huashilcompounds	NIH MLSMR and de novo synthesis
BTV-10	ATCC	VR-187
BSR cell	Developed in house
Synergy-II multi-mode microplate reader	BioTek		For luminescent signal reading
MicroFlo select dispenser	BioTek		Adding cells, virus, and reagents
384-well flat-bottom microplate	CORNING	28908031	For cell culture
Gen. 5 software	BioTek		For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader
GraphPad Prism 5	GraphPad	Version 5	For biostatic analysis and plot