Sauvetage de virus de la maladie de Newcastle recombinant à partir d'ADNc

Résumé

Virus de la maladie de Newcastle (NDV) a été largement étudiée au cours des dernières années afin de développer de nouveaux vecteurs pour la vaccination et le traitement, entre autres. Ces études ont été possibles grâce à des techniques de sauvetage virus recombinant à partir d'ADNc, comme celles que nous décrivons ici.

Résumé

Le virus de la maladie de Newcastle (NDV), le membre prototype du genre Avulavirus de la famille des Paramyxoviridae ^1, est un, de sens négatif non segmenté simple brin, virus enveloppé à ARN (Figure 1) avec des applications potentielles en tant que vecteur pour la vaccination et traitement de maladies humaines. Exploration de ces applications en profondeur est seulement devenu possible après la mise en place de techniques de génétique inverse pour sauver des virus recombinants de plasmides codant pour leurs génomes complets comme ADNc ^2-5. ADNc viral peut être facilement modifiée in vitro en utilisant des procédures de clonage standard pour modifier le génotype du virus et / ou pour inclure de nouvelles unités de transcription. Sauvetage de ces virus génétiquement modifiés constitue un outil précieux pour comprendre les facteurs qui affectent plusieurs stades de l'infection, ainsi que permet le développement et l'amélioration des vecteurs pour l'expression et la livraison des antigènespour la vaccination et de la thérapie. Ici, nous décrivons un protocole pour le sauvetage de NDVs recombinantes.

Introduction

Virus de la maladie de Newcastle (NDV), un paramyxovirus aviaire appartenant au genre Avulavirus ^1, est un agent zoonotique économiquement pertinent et donc largement étudiée et surveillée, qui peuvent gravement affecter l'élevage de volailles dans le monde entier. Bien que n'étant pas un agent pathogène humain, NDV a également été étudiée à fond au-delà du champ de vétérinaire à la fois comme un paramyxovirus de modèle et en raison de ses très intéressantes, les propriétés oncolytiques naturelles ^6. Recherche sur le NDV a grandement bénéficié de l'évolution des techniques de génétique inverse pour, non segmentés virus à ARN négatif simple brin de sens, d'abord décrits pour le virus de la rage par Conzelmann et coleagues ^2. Une variété de NDVs génétiquement modifiées, portant des gènes ou des modifications de leur génome de type sauvage étrangers ont été largement étudiées depuis. Travailler avec ces virus recombinants a été critique à caractériser les différents facteurs de virulence non seulement de NDV, mais aussi d'autres HUMA pertinenten agents pathogènes tels que les virus influenza A ⁷ - ou l'émergence virus Nipah ^8. En outre, un certain nombre de différentes études ont exploré l'utilisation de ces techniques pour améliorer l'activité anti-tumorale innée de NDV ^6,9,10, principalement en améliorant les propriétés immunostimulantes du virus. Autre domaine de recherche concerné sur NDVs recombinants a été la production de vaccins candidats contre d'autres maladies virales telles que la grippe ^{5,11,12, 13} VIH, la rougeole ^{14, 15} SRAS, ou celle causée par le virus respiratoire sincytial (RSV) ^16. Parmi les différents avantages remarquables fournis par NDV sont l'absence d'immunité préexistante dans les populations humaines, la stabilité des inserts étrangers génétiques, un manque d'activité et recombinatoire ensemble un profil de sécurité élevé combiné avec les propriétés immunostimulantes naturels mentionnés ci-dessus ^17. Il est également intéressant de noter l'utilisation potentielle de vaccins bivalents recombinants dans poultry, de protection à la fois contre le NDV et influenza aviaire hautement pathogène virus ^11,12. Cela peut être un excellent moyen de réduire les risques de propagation de la dernière sauvage des animaux domestiques, ce qui contribuerait à éviter un possible saut inter-spécifique de la grippe aviaire à l'homme redoutable. Enfin, le journaliste exprimant NDV ont été utilisés pour l'évaluation des réponses immunitaires innées ainsi que l'identification de l'interféron antagoniste codée par plusieurs virus ^18-27.

Le processus de délivrance d'un recombinant, non segmenté, virus ARN à brin négatif se compose essentiellement de forcer artificiellement un cycle de réplication virale dans une cellule produisant par transfection de l'ADNc codant pour la machinerie moléculaire infectieuse minimale, dite ribonucléoprotéine ou RNP (Figure 2). Les RNP consistent en la polymerase virale (P et les protéines L), la nucléoprotéine (NP) et la longueur totale de l'ARN antigénomique du virus. Cet ARN antigénomique + e estmodèle de e requise pour la génération des ARN-génomes complémentaires, qui, également associés avec le reste des protéines de la RNP virale, reprend le même complexe infectieux d'un virus naturel libérerait le cytoplasme de la cellule lors de l'infection (Figure 2A ). De cette étape en avant, le cycle viral peut procéder naturellement et virions recombinants, encapsidation des génomes modifiés, sera généré (figure 2B). Remarquablement, la transfection de l'ADNc génomique à la place de l'ADNc antigénomique nuit considérablement ou supprime sauvetage efficacité ^2,28-30 complètement. Même lorsque l'ADNc antigénomique est transfecté, l'efficacité de l'encapsidation de l'ARN recombinant dans des RNP dans les cellules transfectées est probablement très faible. Pour cette raison, les protocoles de sauvetage pour NDV comprennent souvent des différentes étapes de l'amplification de ces particules virales libérées par les cellules transfectées à l'origine par leur co-culture avec des cellules permissives et / ou par l'infection des œufs embryonnés.

Avant la délivrance, l'ADNc peut être manipulé par des techniques de clonage standard afin de générer les modifications désirées. Alors que les mutations spécifiques des différents produits des gènes et des séquences régulatrices du virus peuvent être carrément obtenus de cette façon, la plupart des travaux publiés concernant NDV recombinant a nécessité l'ajout d'une nouvelle unité de transcription dans le génome du NDV. Comme d'autres membres de la famille des paramyxovirus, le génome du NDV code pour huit protéines différentes en six unités transcriptionnelles qui sont exprimés de façon différentielle en fonction de leur localisation relativement à l'extrémité 3 'dans un gradient critique pour le cycle de vie viral ^une diminution. De ce fait, l'emplacement de la nouvelle unité de transcription dans le génome doit être soigneusement choisie pour obtenir un équilibre entre l'expression du transgène et de la déficience de la réplication virale. Insertion entre gènes P et M a été le plus utilisé, tautres sites Hough ont également été testés ^13,31.

Quelle que soit la pièce, le clonage de l'ADNc dans NDV doit suivre certaines règles pour générer une construction rescuable: (i) tout nouveau gène à être inclus dans le génome NDV doit être sous le contrôle des signaux appropriés pour l'ARN-dépendante de l'ARN viral polymerase. Ces séquences doivent être ajoutés en amont du nouveau cadre de lecture ouvert (ORF) de sorte que la polymerase peuvent reconnaître la fin du gène précédent (GE) et le début de la nouvelle transgène (GS), espacée par une seule séquence intergénique de nucleotides (IG) . L'addition d'un Kozak valide (K) Séquence d'améliorer traduction ribosomale eucaryotique est également recommandé pour une meilleure expression de la protéine étrangère ^32, (ii) la réplication efficace du NDV, comme pour la plupart des membres de la famille des Paramyxoviridae, est fonction de la longueur du génome étant multiple de six ^33, par conséquent, une insertion dans le NDV doit suivre cette «règle de six». Si nécessaire, required nucléotides supplémentaires peuvent être ajoutés en aval de l'ORF de nouveau, et (iii) la séquence du transgène doit être vérifié pour trouver possible GE et GS comme des séquences qui pourraient nuire à l'efficacité de sauvetage, l'expression du transgène et / ou la viabilité du virus. S'ils sont présents, ces séquences doivent être éliminés par mutagenèse silencieuse. La génération d'ADNc de pleine longueur recombinant suivant les règles mentionnées ci-dessus est la première étape en vue de produire efficacement un NDV génétiquement modifiés comme indiqué ici.

Dans le système toutes les constructions d'ADN sont sous le contrôle du promoteur de la polymérase T7 ARN (figure 3). Cette polymerase cytoplasmique est fournie en trans par co-infection avec un virus recombinant modifié de la vaccine Ankara (MVA-T7) ^34. Figure 3A montre le plasmide pNDV-B1, qui code pour la longueur complète de l'ADNc antigénomique ^5. Figure 3B montre les plasmides PTM1 codant NP, P et L ORF. Les plasmides pCITE-GFP, qui code pour, under du promoteur T7, la protéine fluorescente verte (GFP), et pCAGGS GFP ^18, qui code pour le même ORF sous le promoteur de l'actine bêta poulet ^35, sont utilisés comme contrôles. Dans ce protocole, on montre la procédure pour sauver NDV recombinant à partir de l'ADNc de la souche de NDV lentogène Hitchner B1 ⁵ (Figure 4).

Protocole

Une. Préparation des cellules de mammifères (figure 4A, Jour 1)

Scission HEp-2 ou des cellules A549 le jour avant la transfection dans des plaques à 6 puits. Densité de cellules doit atteindre 80 à 90% de confluence le jour suivant. Habituellement, un confluent boîte de 100 mm peut être divisé en 8 puits (environ 1 x 10 ⁶ cellules par puits). Pour chaque virus pour être sauvé, 2-4 puits différents devraient être inclus, ainsi que deux puits supplémentaires pour les contrôles pCAGGS-GFP et pCITE-GFP ^18, visant à surveiller la transfection et MVA-T7 efficacité d'infection, respectivement.

2. L'infection des cellules de mammifères avec recombinant modifié le virus de la vaccine Ankara Exprimant le bactériophage T7 RNA Polymerase (MVA-T7) (figure 4A, Jour 2)

1. Warm up PBS 1x/BA/PS et médias à 37 ° C.
2. Laver les cellules deux fois avec 1 ml de PBS 1x/BA/PS.
3. Infecter les cellules de mammifères en culture avec le virus MVA-T7 à une multiplicité d'infection (moi) De 1 pfu / cellule dans un volume final de 200 ul dans du PBS / BA / PS pendant 1 heure à température ambiante.
4. Au cours de l'infection virale incubation, préparer le mélange de transfection comme décrit dans 3.

3. La transfection de cellules de mammifères (figure 4A, Jour 2)

1. Préparation de Lipofectamine: Mélanger 1-2 pg de LPF2000 avec 250 pi de OptiMEM par tentative de sauvetage et incuber pendant 5 min à température ambiante.
2. Préparation de l'ADN: Faire un cocktail de plasmide pour chaque sauvetage dans 50 pi de OptiMEM. Ajouter 0,4 pg de PTM1-NP, 0,2 pg de PTM1-P, et 0,2 pg de PTM1-L par tube. Ajouter 1 ug de l'ADNc de pleine longueur clone de NDV être secouru à chaque tube. Préparer aussi deux transfections de contrôle, une avec 2 pg de pCAGGS-GFP (pour vérifier l'efficacité de la transfection) et l'autre avec 2 pg de pCITE-GFP (pour vérifier T7 polymerase entraîné expression par le MVA-T7).
3. Après que la solution LPF2000-OptiMEM a été pré-incubé pendant 5 min (étape 3.1), ajouter 250ul de la solution dans les tubes d'ADN (étape 3.2) et incuber pendant 20 à 30 min à température ambiante.
4. Après incubation avec MVA-T7, enlever l'inoculum de virus par aspiration et le remplacer par le mélange de transfection d'ADN de LPF2000 (étape 3.3).
5. Ajouter 1 ml de DMEM 10% FBS / PS pour chaque plat.
6. Incuber les cellules infectées / transfectées pour 6-8 heures (ou toute la nuit) à 37 ° C, 5% de CO _2, puis remplacer le milieu de transfection avec 1,5 ml de DMEM frais 10% de FBS / PS.
7. À 24 heures post-transfection, les puits de contrôle peut être observée sous un microscope à fluorescence afin d'évaluer l'efficacité de transfection (pCAGGS-GFP) et l'activité de la polymerase T7 (pCITE-GFP) (Figure 5A). Procéder à la co-culture de cellules infectées / transfectées avec des fibroblastes aviaires tels que décrits ci-dessous.

4. Co-culture de cellules de mammifère avec des cellules aviaires (Figure 4A, Jour 3)

Habituellement, une boîte de 100 mm confluent des tissus de culture de poulet (CEF) or canard (defs) fibroblastes d'embryon est utilisé par deux puits transfectées. Veillez à préparer, à l'avance, assez 100 mm boîtes de culture de tissus de cellules aviaires par toutes les tentatives de sauvetage. Pour le sauvetage efficace du virus, de DMEM 10% FBS / PS milieu est enrichi avec 5% de liquide allantoïdien et 30 mM de _MgCl2. À ce stade, 24 h pi, des cellules de mammifères peuvent commencer à montrer un effet cytopathique (CPE) due à une infection MVA-T7, asevident sur ​​la figure 5A.

1. Warm up 1x PBS et médias à 37 ° C.
2. Laver les cellules de mammifères, 2x, avec 1 ml de PBS 1x.
3. Trypsiniser les cellules de mammifères avec 0,2 ml de trypsine-EDTA jusqu'à ce qu'elles se détachent. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de DMEM 10% FBS / PS, 5% de liquide allantoïdien, 30 mM de _MgCl2 et le transfert à une boîte de culture tissulaire de 100 mm. Ajouter 3 ml de même support.
4. Laver les cellules aviaires, deux fois, avec 4 ml de PBS 1x.
5. Trypsiniser cellules aviaires avec 1 ml de trypsine-EDTA et incuber pendant 1-2 min à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules se détachent. E Remettre en suspensioncellules de e en ajoutant 8 ml de DMEM 10% FBS / PS, 5% de liquide allantoïdien, 30 mM de _MgCl2 et ajouter 4 ml des cellules trypsinisées pour les cellules de mammifères dans le boîte de 100 mm pour culture de tissu de co-culture pendant un volume total de 8 ml (4 ml de mammifères, des cellules aviaires 4 ml).
6. Secouer doucement la main les cellules co-cultivées dans la boîte de 100 mm afin d'avoir une distribution uniforme et puis les placer dans l'incubateur à 37 ° C pendant 3-4 jours. Les critères pour infecter les œufs 3 ou 4 jours après co-culture de cellules de mammifères et aviaires dépend de la quantité d'effet cytopathique (arrondissement des cellules, la mort, le détachement de la surface, etc.) Est observé dans l'infection virale MVA-T7.

5. Infection de poulet embryonnés (figure 4A, Jours 6-7)

1. Après 3-4 jours de co-culture de cellules de mammifères et aviaires, retirer 1 ml de surnageant de culture tissulaire et l'ajouter à un tube Eppendorf.
2. Centrifuger le surnageant de culture tissulaire pendant 1 min à 12 000 rpm dans un banccentrifugeuse pour éliminer les débris cellulaires.
3. Bougie les oeufs à l'aide d'une boîte de mirage de lumière pour voir l'interface entre le sac de l'air et la cavité allantoïde. Faire une marque sur la frontière de l'interface éviter vaisseau sanguin localisation. Vaporiser éthanol à 70% sur les oeufs d'établir des conditions stériles. Faire doucement un trou dans la coquille d'oeuf sur la place nette et inoculer 500 pi du surnageant à l'aide d'une insuline (1 ml) seringue, visant l'aiguille verticalement et directement dans la cavité allantoïde. (Figure 4B).
4. Sceller le pseudo dans la coquille d'oeuf avec de la cire ou de la paraffine fondue.
5. Incuber les oeufs pendant 2-3 jours à 37 ° C.

6. Récolte de liquide allantoïdien infecté de poulet embryonnés (figure 4A, Jours 8-10)

1. Incuber les œufs infectés de 4.2 h ou pendant une nuit à 4 ° C afin de tuer l'embryon de poulet et de coaguler le sang.
2. Pulvériser les œufs avec 70% d'éthanol (pour maintenir des conditions stériles).
3. Enfoncer délicatement la section apicale de l'oeuf, sur la cavité d'air, avec une cuillère. Une fois la coquille est fêlée, enlever les fragments avec une pince et entièrement exposer la membrane allantoïde.
4. Exposer la cavité allantoïque par excision de la membrane allantoïdien avec des pinces et des ciseaux, ce qui évite d'endommager les vaisseaux sanguins et le jaune.
5. Pousser doucement sur l'embryon avec une spatule et recueillir le liquide allantoïdien d'écoulement vers le haut (8-12 ml par oeuf) avec une pipette de 10 ml. Éviter d'endommager la membrane du jaune. Transférer le liquide allantoïdien à un tube de centrifugation de 15 ml sur glace (utiliser un tube par œuf).
6. Clarifier le liquide allantoïdien par centrifugation pendant 5 min à 1500 rpm. Transférer le surnageant dans un nouveau tube sans perturber le culot.
7. Conserver les échantillons à 4 ° C pendant 1 semaine, jusqu'à ce que leur vérification de la présence de NDV par hémagglutination.

7. Hémagglutination (HA) Dosage

La présence de virus dans la Allantfluide de l'OCI à partir d'œufs infectés peut être déterminée de façon macroscopique par leur capacité à hemagglutinate dinde de globules rouges (RBC). Dans le cas de NDV, environ 10 ⁶ unités formant des plages (UFP) par ml sont nécessaires pour donner un signal positif dans le test HA. des dosages de HA sont réalisées dans des plaques à 96 puits à fond en V. Négatif (PBS 1x, liquide allantoïdien infecté) aussi bien que positifs (liquide allantoïdien de tout virus NDV) échantillons de contrôle doivent toujours être inclus dans n'importe quel dosage HA pour le valider. Pour effectuer un test HA:

1. Pipette 50 ul de PBS 1x par puits dans une plaque de 96 puits à fond en V.
2. Introduire à la pipette 50 ul des échantillons de fluide allantoïdien dans les puits de la première colonne de la plaque. Effectuer des dilutions en série de 2 fois le reste de la plaque et jetez la dernière, en sus de 50 pi à partir de puits dans la dernière colonne.
3. Distribuer 50 ul de 0,5% dinde RBC dans du PBS 1x par puits. Secouer doucement la plaque en tapotant.
4. Incuber la plaque à 4 ° C (ou glace) fou de 30 à 45 min ou jusqu'à ce qu'un culot clair est formé dans les puits témoins négatifs.

Résultats

Sauvetage de NDV est une procédure bien établie, régulièrement effectuées dans les laboratoires qui ont accès à l'ADNc complet du virus. Cependant, la nature stochastique intrinsèque du procédé, il est difficile d'atteindre 100% d'efficacité de sauvetage. Suivi des premières étapes du processus, spécialement l'efficacité de la transfection et l'infection par le MVA-T7, aide à identifier les problèmes possibles. Figure 5A montre transfection standard et l'efficaci...

Discussion

Plusieurs facteurs sont à considérer pour obtenir de bons résultats tout en sauvant NDV. Tout d'abord, la construction d'ADNc de pleine longueur à utiliser doit être conçu pour permettre l'incorporation fonctionnelle des nouvelles modifications / transgènes dans le génome du NDV. Cela signifie, comme indiqué ci-dessus, que (i) fin appropriée du gène (GE), intergénique (IG) et début de gène (GS) des séquences doivent être ajoutés si nécessaire, (ii) il n'existe pas de séquences GE ou GS...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	CORNING Cellgro	10-013-CV	Any supplier
OptiMEM	GIBCO	31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019
35% Bovine Albumin (BA)	Sigma	232-936-2	Any supplier
Trypsin-EDTA	CORNING Cellgro	25-052-CI	Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x	CORNING Cellgro	30-002-CI	Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Any supplier
Cell lines A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. Embryonated chicken eggs Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols. Turkey red blood cells (RBC) Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days. Plasmids Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography. Viruses The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures. Tissue culture media and solutions: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C. 10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature. 1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4 °C.