의 cDNA에서 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스의 구조

요약

뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV)는 광범위 중에서도, 백신 및 치료를위한 새로운 벡터를 개발하기 위해 지난 몇 년 동안 연구되어왔다. 이 연구로 인해 이러한 우리가 여기에서 설명하는 것과의 cDNA에서 재조합 바이러스를 구출하는 기술로 가능했습니다.

초록

뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV), 가족 Paramyxoviridae ^1의 Avulavirus 속의 프로토 타입 멤버가 아닌 분할, 음의 의미는 단일 가닥, 예방 접종에 대한 벡터 잠재적 인 응용 프로그램과 RNA 바이러스 (그림 1)을 포위하고있다 인간의 질병의 치료. 이러한 응용 프로그램의 심층 탐사는 cDNA를 ^2-5로 자신의 완전한 게놈을 암호화하는 플라스미드로부터 재조합 바이러스를 구출하는 역 유전학 기술의 설립 후 수있게되었다. 바이러스 cDNA를 편리 바이러스의 유전자형을 변경 및 / 또는 새로운 전사 단위를 포함하는 표준 클로닝 절차를 사용하여 시험 관내에서 수정 될 수있다. 이러한 유 전적으로 변형 된 바이러스의 구조는 인자 감염의 여러 단계에 영향을 미치는뿐만 아니라 항원의 발현 및 전달을위한 벡터의 개발 및 개선을 허용을 이해하기 위해 유용한 도구를 제공한다예방 접종 및 치료를위한. 여기에서 우리는 재조합 NDVs의 구조에 대한 프로토콜을 설명합니다.

서문

뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV)는 Avulavirus 속 ^1에 속하는 조류 paramyxovirus은 심각하게 전 세계의 가금류에 영향을 미칠 수있는 경제 관련 때문에 널리 연구되고 감시를 받고 인수 공통 에이전트입니다. 아니 인간의 병원체이지만, NDV는 철저 모델 paramyxovirus로 인해 고도의 흥미, 자연, 온 콜리 틱 속성 ⁶ 모두 수의사 필드 이상으로 연구되고있다. NDV에 대한 연구는 크게 첫 번째 Conzelmann 및 coleagues ^2로 광견병 바이러스에 대한 설명 단일 가닥이 아닌 분할 된 음의 센스 RNA 바이러스에 대한 역 유전학 기술의 개발 혜택. 외국 유전자 또는 야생형 유전자의 변형을 운반 유전자 변형 NDVs의 다양한 널리 그 이후로 연구되고있다. 이러한 재조합 바이러스로 작업은 NDV의뿐만 아니라 관련 구호 물자의뿐만 아니라 다른 독성 요소를 특성화하는 것이 중요했습니다N 인플루엔자 바이러스와 같은 병원체 ⁷ - 나 응급 니파 바이러스 ^8. 또한, 서로 다른 다수의 연구는 주로 바이러스의 면역 자극 특성을 향상시킴으로써, NDV ^6,9,10의 타고난 항 종양 활성을 개선하기 위해 이러한 기술을 사용하는 방법을 살펴 보았다. 재조합 NDVs에 대한 연구의 관련 영역이 인플루엔자 ^5,11,12와 같은 다른 바이러스 성 질병에 대한 백신 후보의 생성하고있다, HIV ^(13)는, SARS ^{15, 14} 홍역, 또는 그 호흡 sincytial 바이러스 (RSV) ^(16)에 의해 발생합니다. NDV 의해 제공된 다양한 주목할만한 장점은 인간 개체군에서 기존 면역 결핍이다 사이에, 외래 유전자 삽입, recombinatory 활성의 결여와 전체적으로 전술 천연 면역 자극 특성 ^(17)과 결합 된 높은 안전성 프로파일의 안정성. 또한 P의 재조합 이가 백신의 잠재적 인 사용을 주목할oultry, NDV 모두에 대한 보호 및 고병원성 조류 인플루엔자는 ^{11, 12를} 바이러스. 이 때문에 또한 인간에 지칠대로 지친 조류 독감의 가능한 간 특정 점프를 방지하는 데 도움이, 길 들여진 동물을 야생에서 확산 후자의 가능성을 줄일 수있는 좋은 방법이 될 수 있습니다. 마지막으로, 리포터 발현 NDV은 선천성 면역 반응의 평가뿐만 아니라 여러 바이러스 ^18-27 의해 인코딩 인터페론 길항 물질의 식별을 위해 사용되었다.

재조합의 구조 과정은 비 분할, 음의 가닥 RNA 바이러스는 기본적으로 인위적으로 리보 또는 RNP로 알려진 최소한의 감염성 분자 기계, (그림 2)를 코딩하는 cDNA를 형질 전환에 의해 생산 세포에서 바이러스의 복제 사이클을 강제에 구성되어 있습니다. RNP들이 바이러스 중합 효소 (P와 L 단백질)로 구성되어, 핵 단백질 (NP)와 바이러스의 전체 길이 antigenomic RNA. 이 RNA + antigenome는 일입니다또한 바이러스 RNP의 단백질의 나머지 부분과 연관된 상보적인 RNA-게놈의 생성에 필요한 전자 서식, 천연 바이러스 감염시 세포의 세포질 (도 2A에 출시 것이라고 같은 감염성 복잡한 되풀이되었습니다 ). 이후이 단계에서 바이러스 성주기는 자연스럽게 진행하고 수정 된 게놈을 encapsidating 재조합 비리는 (그림 2B)를 생성됩니다. 현저하게, 대신 antigenomic의 cDNA 게놈 cDNA를 형질 크게 손상 또는 완전히 복구 효율 ^2,28-30을 폐지. antigenomic cDNA를 형질 감염이 되어도, 형질 감염된 세포에서 RNP들로 재조합 RNA의 이입의 효율은 아마도 매우 낮다. 이 때문에, NDV에 대한 구조 프로토콜은 종종 관대 한 세포 및 / 또는에 의해를 공동 배양하여 원래 형질 세포에서 방출되는 몇 가지 바이러스 입자의 증폭에 대해 서로 다른 단계를 포함유정란의 감염.

이전 구조로, cDNA를 원하는대로 수정을 생성하기 위해 표준 복제 절차에 의해 조작 할 수 있습니다. 다른 유전자 생성물 및 바이러스 조절 서열의 특정 돌연변이는 똑 바르게 이러한 방법을 달성 할 수 있지만, 재조합 NDV 관련된 발행 작업의 대부분은 NDV 게놈에 전사 단위의 새로운 첨가를 요구했다. paramyxovirus 제품군의 다른 제품과 마찬가지로, NDV 게놈 차등 바이러스의 생활주기 ¹ 중요한 감소 그라데이션의 3 '말단에 자신의 위치와 관련에 따라 표현되는 여섯 전사 단위로 8 개의 서로 다른 단백질을 인코딩합니다. 이 때문에, 게놈 내 새로운 전사 유닛의 위치는 신중 바이러스 복제의 형질 전환 유전자 및 장애의 발현 사이의 균형을 달성하도록 선택되어야한다. P와 M의 사이 유전자 삽입은 대부분, t를 사용되어왔다무릎 다른 사이트는 ^13,31을 테스트되었습니다.

(I) NDV 게놈에 포함되는 새로운 유전자가 바이러스 성 RNA 의존-RNA에 해당하는 신호의 통제하에 있어야한다 : 무엇이든간에 삽입, NDV의 cDNA에 복제는 rescuable 구조를 생성하기 위해 몇 가지 규칙을 따라야합니다 중합 효소. 이러한 시퀀스는 새로운 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 상류에 추가되어야하므로 폴리머는 단일 염기 intergenic 서열 (IG)에 의해 이격 된, 이전의 유전자 (GE)과 새로운 형질 전환 유전자 (GS)의 시작 부분의 끝을 인식 할 수있다 . Paramyxoviridae 가족의 대부분의 회원으로 NDV의 (II)의 효율적인 복제, 게놈 길이의 여러 존재에 의존, 유효한 코작 (K) 진핵 생물의 리보솜의 번역을 개선하기 위해 일련의 추가는 또한 더 나은 외국 단백질 발현 ^32에 추천 여섯 ^(33)는, 따라서, NDV에 모든 삽입이 "6의 규정"에 따라해야합니다. 필요한 경우, REQuired 추가 뉴클레오티드 하류 새로운 ORF를 추가 할 수 있습니다, 그리고 (iii) 유전자의 순서가 찾아 확인해야 할 GE 및 구조의 효율성, 유전자 발현 및 / 또는 바이러스의 생존 능력에 지장을 줄 수있는 시퀀스 등 GS. 존재하는 경우,이 시퀀스는 침묵 돌연변이에 의해 제거해야합니다. 상술 한 규칙에 따라 재조합 전체 길이 cDNA를 효율적으로 생성 여기서 설명하는대로 유전자 재조합 NDV를 생성하기 위해 첫 번째 단계이다.

시스템의 모든 DNA 구조는 T7 RNA 중합 효소 프로모터 (그림 3)의 제어하에 있습니다. 이 세포질 효소는 재조합 수정 된 우두 앙카라 바이러스 (MVA-T7) ^(34)와 동시 감염에 의해 트랜스에 제공된다. 그림 3a는 전체 길이 antigenomic cDNA를 ^{5 인코딩} pNDV-B1 플라스미드를 보여줍니다. 그림 3b는 pTM1 플라스미드는 NP를 인코딩을 보여줍니다, P와 L의 ORF. , U를 인코딩 플라스미드 pCITE-GFP,개 nder T7 프로모터, 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 닭 베타 액틴 프로모터 ^35에서 동일한 ORF를 암호화는 pCAGGS GFP ^(18)는, 컨트롤로 사용됩니다. 이 프로토콜에서 우리는 lentogenic NDV 변형 Hitchner의 B1 ⁵ (그림 4)의 cDNA의에서 재조합 NDV를 구출하는 절차를 보여줍니다.

프로토콜

1. 포유 동물 세포의 준비 (그림 4A, 1 일)

분할 HEP-2 또는 A549 세포를 6 - 웰 플레이트에 형질 전날. 세포의 밀도는 다음 날 80-90% 합류에 도달해야합니다. 일반적으로 합류 100mm 요리 8 우물에 (물론 당 ^{6 ~} 10 x 1 주위 세포)를 분할 할 수 있습니다. 각각의 바이러스가 구출 될 때까지, 2-4 다른 우물이 포함되어야한다,뿐만 아니라 각각 형질 전환 및 MVA-T7 감염의 효율성을 모니터링하기위한 제어는 pCAGGS-GFP 및 pCITE-GFP ¹⁸ 2 여분의 우물,,.

2. 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소 (MVA-T7)를 발현하는 재조합 수정 된 우두 앙카라 바이러스와 포유 동물 세포의 감염 (그림 4A, 2 일)

1. 37 ° C에서 PBS 1x/BA/PS와 미디어를 따뜻하게
2. PBS 1x/BA/PS 1 ㎖로 두 번 세포를 씻으십시오.
3. 감염의 다중성 (AT MVA-T7 바이러스로 배양 된 포유 동물 세포를 감염 모이1) 실온에서 1 시간 동안 PBS / BA / PS 200 μL의 최종 볼륨 PFU / 셀.
4. 3에 설명 된대로 바이러스 감염 배양하는 동안, 형질 믹스를 준비합니다.

3. 포유 동물 세포의 형질 (그림 4A, 2 일)

1. 리포 펙 타민의 준비 : 구출 작전 당 티멤 250 ㎕ 씩 LPF2000 1-2 μg을 혼합하고 실온에서 5 분 동안 품어.
2. DNA의 준비 : 티멤 50 μL의 각 구조에 대한 플라스미드 칵테일을 확인합니다. 0.4 pTM1-NP ㎍의, pTM1-P 0.2 μg, 튜브 당 pTM1-L의 0.2 μg을 추가합니다. 각 튜브에 구출 할 NDV의 전체 길이의 cDNA 클론의 1 μg을 추가합니다. 또한 두 개의 제어 형질,는 pCAGGS-GFP의 2 μg 하나 (형질 전환 효율을 확인하기 위해) 및 (T7 효소가 MVA-T7에 의해 발현을 구동 확인) pCITE-GFP의 2 μg과 다른 준비를합니다.
3. LPF2000-티멤 용액을 5 분 (단계 3.1)에 대한 예비 인큐베이션 한 후, 추가 250DNA 튜브에 대한 해결책의 μL (3.2 단계) 및 실온에서 20 ~ 30 분 동안 품어.
4. MVA-T7과 부화 후, 흡인에 의해 바이러스 접종을 제거하고 DNA-LPF2000 형질 믹스 (단계 3.3)로 교체합니다.
5. 각 요리에 DMEM 10 % FBS / PS의 1 ML을 추가합니다.
6. 37 ° C, 5 % CO _2에서 6 ~ 8 시간 (또는 야간)에 감염된 / 형질 전환 세포를 품어하고 신선한 DMEM 10 % FBS / PS 1.5 ㎖로 형질 미디어를 교체합니다.
7. 24 시간 후 형질에서 제어 우물은 형질 전환 효율 (는 pCAGGS-GFP) 및 T7 효소 활동 (pCITE-GFP) (그림 5A)을 평가하기 위해 형광 현미경으로 관찰 할 수있다. 아래에 설명 된대로 새 섬유 아 세포로 감염된 / 형질 전환 세포의 공 배양을 진행합니다.

4. 조류 세포와 포유 동물 세포의 공동 문화 (그림 4A, 3 일)

일반적으로 닭의 합류 100mm 조직 배양 접시 (CEFs) OR 오리 (인증 된 정의) 배아 섬유 아 세포는 두 개의 형질 우물 당 사용된다. 사전에 모든 구조 시도 당 조류 세포의 충분한 100mm 조직 문화 요리를 준비해야합니다. 바이러스의 효율적인 구조를 들어, DMEM 10 % FBS / PS 미디어는 막액 30 mM의 _MgCl2를 5 %로 보충된다. 이 시점에서 24 시간 파이, 포유 동물 세포 인해 MVA-T7 감염,도 5a에 asevident에 세포 변성 효과 (CPE)를 보여주는 시작할 수 있습니다.

1. 37 ° C.에 PBS의 1X 및 미디어 워밍업
2. PBS 1X 1 ㎖로 2 배, 포유 동물 세포를 씻으십시오.
3. 그들은 분리 될 때까지 EDTA-트립신의 0.2 ml의 포유 동물 세포를 Trypsinize. DMEM 10 % FBS / PS 1 ㎖로 세포를 재현 탁 5 % 막액, 30 mM의 _{MgCl2를하고} 100mm 조직 배양 접시로 전송. 동일한 매체의 3 ML을 추가합니다.
4. PBS 1X의 4 ㎖로, 두 번, 조류 세포를 씻으십시오.
5. 세포가 분리 될 때까지 1 EDTA-트립신 ㎖ 및과를 Trypsinize 조류 세포는 37 ° C에서 1 ~ 2 분 동안 품어. 재현 탁 일8 DMEM 10 % FBS / PS, 5 % 막액, 30 mM의 MgCl2를 ₂ ㎖ 및 8의 총 볼륨의 공 배양 100mm 조직 배양 접시에있는 포유 동물 세포에 트립신 세포 4 ㎖를 추가를 추가 전자 셀 ML (4 ML의 포유류, 4 ㎖의 조류 세포).
6. 부드럽게 균일 한 분포가 다음 3 ~ 4 일 37 ° C에서 인큐베이터에 배치하기 위해 손으로 100mm 접시에 공동 배양 된 세포를 흔들. 3 4 일 포유류 및 조류 세포의 공동 배양 후 계란을 감염에 대한 기준은 (세포 반올림, 죽음, 표면 박리 등이.) MVA-T7 바이러스 감염에서 관찰 얼마나 많은 세포 변성 효과에 따라 달라집니다.

5. 닭 유정란의 감염 (그림 4A, 일 6 ~ 7)

1. 포유 동물 및 조류 세포의 공 배양 3-4 일 후, 조직 배양 상등액 1 ㎖를 제거하고 에펜 도르프 튜브에 추가한다.
2. 벤치에서 12,000 rpm에서 1 분 동안 조직 배양 상층 액을 원심 분리기세포 파편을 제거하는 최고 원심 분리기.
3. 공기 주머니와 뇨 공동 사이의 인터페이스를 확인하기 위해 빛을 불빛에 비춰 조사 상자를 사용하여 계란을 촛불. 인터페이스 테두리 혈관 지역화를 피하는 표시를합니다. 무균 조건을 확립하기 위해 계란을 통해 70 % 에탄올 스프레이. 부드럽게 표시된 자리에 달걀 껍질에 구멍을 뚫어 뇨 공동으로 수직으로 직접 바늘을 목표로, 인슐린 (1 ㎖)을 주사기를 사용하여 상층 액 500 μl를 접종. (그림 4B).
4. 녹은 왁스 나 파라핀 달걀 껍질에 흠을 봉인.
5. 37 ℃에서 2 ~ 3 일 계란을 품어

6. 감염된 닭 유정란에서 뇨의 유체 (그림 4A, 8 ~ 10 일)의 수확

1. 닭 배아를 죽이고 피를 응고하기 위해 4 ° C에서 2-4 시간 또는 하룻​​밤 감염된 알을 품다.
2. 70 % 에탄올 (멸균 조건을 유지하기 위해)으로 스프레이 계란.
3. 조심스럽게 숟가락으로 공기 구멍을 통해 계란의 꼭대기 부분을, 누르십시오. 달걀 껍질에 균열이되면, 집게와 조각을 제거하고 완전히 뇨 막을 노출.
4. 혈관의 손상과 노른자를 피하고, 집게와 가위로 뇨 막을 절개하여 뇨 구멍을 노출합니다.
5. 조심스럽게 주걱으로 배아를 아래로 누르고 10 ㎖ 피펫으로 상향 유동 막액 (달걀 당 8 ~ 12 ㎖)에 수집합니다. 노른자 막 손상을 방지. 얼음에 15 ML의 원심 분리기 튜브 (달걀 당 하나의 튜브를 사용)에 막액을 전송합니다.
6. 1,500 rpm에서 5 분간 원심 분리하여 막액 명확화. 펠렛을 방해하지 않고 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다.
7. 최대 1 주일 동안 4 ° C에서 저장 샘플, 혈구 응집 분석에 의해 NDV의 존재를 확인한까지.

7. 혈구 응집 (HA) 분석

allant에서 바이러스의 존재감염된 계란에서 OIC 유체는 칠면조 적혈구 (RBC)를 hemagglutinate 할 수있는 능력에 의해 육안으로 확인할 수 있습니다. NDV의 경우에는, 밀리리터 당 단위를 형성하는 약 10 ⁶ 플라크 (PFU)는 HA 분석에서 양성 신호를 제공하기 위해 요구된다. HA의 분석은 V-바닥 96 - 웰 플레이트에서 실시된다. 네거티브 (PBS 1X, 비감염 막액)뿐만 아니라 양극 (모든 NDV 바이러스로부터 막액) 컨트롤 샘플은 항상 검증을 어떤 HA 분석에 포함되어야한다. HA 분석을 수행하려면 :

1. 피펫 V-바닥 96 - 웰 플레이트에 웰 당 PBS의 1X의 50 μL.
2. 피펫 판의 첫 ​​번째 열에서 우물에 막액 샘플 50 μL. 판의 나머지 부분을 통해 2 배 시리얼 희석을 수행하고 마지막 열에서 우물에서 마지막으로, 추가 50 μl를 폐기합니다.
3. 잘 당 PBS 1X 0.5 % 칠면조 RBC의 50 μl를 분배. 부드럽게 눌러 판을 흔들.
4. 4 ° C에서 (또는 얼음) F에서 접시를 품어또는 30 ~ 45 분 또는 클리어까지 펠릿은 음성 대조군 웰에 형성된다.

결과

NDV의 구조는 정기적으로 바이러스의 전체 cDNA를 액세스 할 수있는 실험실에서 수행 잘 설립 절차입니다. 그러나, 본 방법의 본질적인 스토캐스틱 자연 어려운 100 % 복구 효율을 달성 할 수있다. 프로세스의 초기 단계, MVA-T7과 특수 형질 전환 효율과 감염을 모니터링 가능한 문제. 그림 5A 표준 형질 성공적인 NDV 구조에 대한 충분한 형질 전환 / 감염의 효율을 보여줍니다를 식별하는 데 ...

토론

몇몇 요인 NDV 구출하면서 좋은 결과를 달성하기 위해 고려되어야한다. 첫째, 사용되는 전장 cDNA 구조체는 NDV 게놈에 트랜스 진 새로운 / 수정 기능 내장 할 수 있도록 설계 될 필요가있다. (II)에는 추정 GE 또는 GS 시퀀스가​​ 외국에없는, 위에서 언급 한 바와 같이이 (I) 해당 유전자의 끝 (GE), intergenic (IG) 유전자의 시작 (GS) 시퀀스가​​ 필요한 경우 추가 할 수 있다는 것을, 의미 유전자, 그리고 (...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	CORNING Cellgro	10-013-CV	Any supplier
OptiMEM	GIBCO	31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019
35% Bovine Albumin (BA)	Sigma	232-936-2	Any supplier
Trypsin-EDTA	CORNING Cellgro	25-052-CI	Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x	CORNING Cellgro	30-002-CI	Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Any supplier
			Cell lines A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. Embryonated chicken eggs Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols. Turkey red blood cells (RBC) Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days. Plasmids Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography. Viruses The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures. Tissue culture media and solutions: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C. 10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2•6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature. 1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4°C.