Спасение рекомбинантный Ньюкасл вирусное заболевание из кДНК

Резюме

Вируса болезни Ньюкасла (NDV) была тщательно изучена в последние несколько лет, чтобы развить новые векторы для вакцинации и терапии, среди других. Эти исследования стало возможным благодаря методов по спасению рекомбинантный вирус из кДНК, таких, как мы описываем здесь.

Аннотация

Вируса болезни Ньюкасла (NDV), член прототип Avulavirus рода семьи Paramyxoviridae ^1, является несегментированная, отрицательной смысл, одноцепочечной, окутан РНК вируса (рис. 1) с потенциальными приложений в качестве вектора для вакцинации и лечение заболеваний человека. В глубокое исследование этих приложений стало возможным только после установления обратных методов генетики, чтобы спасти рекомбинантных вирусов из плазмид, кодирующих их полных геномов как кДНК ^2-5. Вирусный кДНК может быть удобно модифицировать в пробирке с помощью стандартных процедур клонирования, чтобы изменить генотип вируса и / или включить новые транскрипционные единицы. Спасение таких генетически модифицированных вирусов представляет собой ценный инструмент, чтобы понять факторы, влияющие несколько этапов инфекции, а также позволяет для развития и совершенствования векторов для экспрессии и доставки антигеновдля вакцинации и терапии. Здесь мы опишем протокол для спасения рекомбинантных NDVs.

Введение

Вируса болезни Ньюкасла (NDV), птичий парамиксовирус, принадлежащая к роду Avulavirus ^1, является экономически актуальны и таким образом широко исследованы и прослушивала зоонозных агент, который может серьезно повлиять на птицеводство по всему миру. Хотя это и не человеческий патоген, НДВ также хорошо изучены за пределы поля ветеринара и как модели парамиксовируса и из-за его высокой интересных, природных онколитических свойств ^6. Исследование NDV большую пользу от развития обратных методов генетики для одноцепочечными, несегментированная отрицательной смысловой РНК вирусов, впервые описанных для вируса бешенства по Конзельманн и Вашии коллегами ^2. Разнообразие генетически модифицированных NDVs, проведение чужеродных генов или модификации их дикого типа генома были широко изучены до сих пор. Работа с этих рекомбинантных вирусов имеет решающее значение для характеристики различных факторов вирулентности не только NDV но и другой соответствующей Хуман патогенов, таких как вируса гриппа А ⁷ - или возникающих Нипах вируса ^8. Кроме того, ряд различных исследований исследовали использование этих методов для улучшения врожденную противоопухолевую активность NDV ^6,9,10, в основном путем повышения иммуностимулирующие свойства вируса. Другая соответствующая область исследований на рекомбинантных NDVs было поколение вакцин-кандидатов против других вирусных заболеваний, таких как грипп ^{5,11,12, 13} ВИЧ кори ^{14, 15} SARS, или что вызвано дыхательных sincytial вируса (RSV) ^16. Среди различных примечательных преимуществ, предоставляемых по NDV являются отсутствие существовавшие ранее иммунитета в человеческих популяциях, стабильность иностранных генетических вставок, отсутствия recombinatory деятельности и общих высоким профилем безопасности в сочетании с вышеупомянутым естественных иммуностимулирующих свойств ^17. Стоит также отметить, потенциальное использование рекомбинантных двухвалентных вакцин в рoultry, защищает от обоих NDV и высокопатогенного гриппа птиц вирусы ^11,12. Это может быть отличным способом, чтобы уменьшить шансы последнего распространяется от дикой к домашним животным, таким образом, также помогает предотвратить возможную межвидовой скачок страшного птичьего гриппа для человека. Наконец, репортер-выражения NDV были использованы для оценки врожденных иммунных реакций, а также идентификации интерферона антагониста, кодируемого нескольких вирусов ^18-27.

Спасение процесс рекомбинантной несегментированная, вирус отрицательной мель РНК в основном состоит на искусственно заставляя вирусную цикл репликации в производящей клетки путем трансфекции кДНК, кодирующей минимальный инфекционный молекулярные машины, известной как рибонуклеопротеидных или RNP (рис. 2). В RNPs состоять из вирусной полимеразы (P и L белков), нуклеопротеина (NP) и полной длины антигеномного РНК вируса. Эта РНК + antigenome-йэ шаблон необходим для генерации дополнительных РНК-геномов, которые, также связанных с остальной частью белков вирусной RNP, повторяет тот же инфекционный комплекс, который естественным вирус бы выпустить на цитоплазме клетки при инфекции (рис. 2А ). От этого шага года, вирусная цикл может продолжаться естественным и рекомбинантные вирионы, encapsidating измененные геномы, будет генерироваться (рис. 2б). Примечательно, что трансфекции геномной кДНК вместо антигеномного кДНК значительно ухудшает или полностью отменяет эффективности спасательных ^2,28-30. Даже когда антигеномного кДНК трансфицируют, эффективность капсидировани рекомбинантного РНК в РНП в трансфицированных клетках, вероятно, очень низка. Из-за этого, спасательные протоколы для NDV часто включают в себя различные шаги для амплификации нескольких вирусных частиц, выпущенных из первоначально трансфицированных клеток на сокультивировани их разрешающих клеток и / илиинфекция в яйцах с зародышем.

До спасения, кДНК можно манипулировать с помощью стандартных процедур клонирования в целях получения желаемых изменений. Хотя конкретные мутации различных генных продуктов и регуляторных последовательностей вируса может быть прямо достигается таким образом, многие из опубликованных работ с участием рекомбинантных NDV потребовало добавление нового единицы транскрипции в геном NDV. Как и другие члены семейства парамиксовирусов, геном НДВ кодирует восемь различных белков в шести транскрипционных единиц, которые по-разному выраженных в зависимости от их местонахождения относительно 3 'конца в убывающей градиентом критической для жизненного цикла вируса ^1. Из-за этого, расположение нового транскрипционной единицы внутри генома должны быть тщательно подобраны, чтобы достичь баланса между экспрессии трансгена и ухудшение вирусной репликации. Вносимые между Р и М генов был использован самый, тHough другие сайты также были протестированы ^13,31.

Какой бы ни была вставка, клонирование в НДВ кДНК необходимо следовать некоторым правилам, чтобы генерировать rescuable конструкцию: (I) любой новый ген, которые будут включены в геном NDV должен находиться под контролем соответствующих сигналов для вирусной РНК-зависимой РНК полимеразы. Эти последовательности должны быть добавлены перед новой открытой рамки считывания (ORF), так полимераза может распознать конец предыдущей гена (GE) и началом нового трансгена (GS), расположенных на одной нуклеотидной межгенной последовательности (Ig) . Добавление действительного Козак (К) последовательности, чтобы улучшить эукариотической перевод рибосомальную также рекомендуется для лучшего выражения инородного белка ^32; (II) эффективное тиражирование NDV, как и для большинства членов семьи Paramyxoviridae, зависит от длины генома быть кратна шесть ^33, поэтому любая вставка в NDV должен следовать этому "правилу шести". При необходимости REQuired дополнительные нуклеотиды могут быть добавлены по потоку новый ORF, и (III) последовательность трансген должен быть проверен, чтобы найти можно GE и GS, такие как последовательности, которые могут ухудшить эффективность спасательных, экспрессию трансгена и / или вирусов жизнеспособность. Если присутствуют, эти последовательности должны быть удалены немого мутагенеза. Генерация рекомбинантного кДНК полной длины следующей вышеупомянутые правила является первым шагом для того, чтобы эффективно производить генетически модифицированного NDV как подробно здесь.

В системе все конструкции ДНК находятся под контролем полимеразы Т7 РНК промотора (рис. 3). Это цитоплазматический полимеразы приведена в транс по ко-инфекции с рекомбинантным модифицированного вируса коровьей оспы Анкара (MVA-Т7) ^34. Фиг.3А показывает pNDV-B1 плазмиду, кодирующую полноразмерную кДНК антигеномного ^5. Фиг.3В показывает Ptm1 плазмидами, кодирующими NP, P и L ОРС. Плазмиды pCITE-GFP, который кодирует, UNDER промотор Т7, зеленый флуоресцентный белок (GFP), и pCAGGs GFP ^18, который кодирует ту же самую ORF под курица бета промотор актина ^35, используют в качестве контрольной группы. В этом протоколе мы покажем процедуру, чтобы спасти рекомбинантный NDV из кДНК со сниженной вирулентностью НДВ штамм Hitchner B1 ⁵ (рис. 4).

протокол

1. Подготовка клетках млекопитающих (фиг. 4А, день 1)

Сплит Нер-2 или А549 за день до трансфекции в 6-луночных планшетах. Плотность клеток должна достичь 80-90% слияния на следующий день. Как правило, сливающийся 100 мм блюдо можно разделить на 8 скважин (около 1 × 10 ⁶ клеток на лунку). Для каждого вирус быть спасены, 2-4 различных скважин должны быть включены, а также две дополнительные скважины для управления pCAGGs-GFP и GFP ^pCITE-18, направленные контролировать эффективность трансфекции и инфекции MVA-T7, соответственно.

2. Заражение клетках млекопитающих с рекомбинантной модифицированной коровьей оспы Анкара вирусов выражая бактериофага Т7 РНК-полимеразы (МВА-T7) (рис. 4А, 2-й день)

1. Разминка PBS 1x/BA/PS и СМИ при 37 ° С
2. Вымойте клеток, в два раза, с 1 мл PBS 1x/BA/PS.
3. Заразить культивируемых клетках млекопитающих с вирусом MVA-T7 при множественности заражения (МВД) 1 КОЕ / клетку в конечном объеме 200 мкл в ЗФР ​​/ BA / PS течение 1 часа при комнатной температуре.
4. Во время вирусной инфекции инкубации подготовить трансфекции смесь, как описано в 3.

3. Трансфекция клеток млекопитающих (рис. 4А, 2-й день)

1. Подготовка Lipofectamine: Смешать 1-2 мкг LPF2000 250 мкл OptiMEM в спасательной и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
2. Получение ДНК: Создать плазмиды коктейль для каждого помощь в 50 мкл OptiMEM. Добавить 0,4 мкг Ptm1-NP, 0,2 мкг Ptm1-P, и 0,2 мкг Ptm1-L на пробирку. Добавить 1 мкг полноразмерного кДНК клона NDV быть спасенной в каждую пробирку. Также подготовить два трансфекций управления, один с 2 мкг pCAGGs-GFP (проверить эффективность трансфекции), а другая с 2 мкг pCITE-GFP (проверить полимераза Т7 приводом выражение на MVA-T7).
3. После того как раствор LPF2000-OptiMEM был предварительно инкубировали в течение 5 мин (шаг 3.1), добавить 250мкл раствора в пробирки ДНК (шаг 3,2) и инкубируют в течение 20-30 мин при комнатной температуре.
4. После инкубации с MVA-T7, удалить вирус прививочный стремлением и заменить на ДНК-LPF2000 трансфекции смеси (шаг 3.3).
5. Добавить 1 мл DMEM 10% FBS / PS к каждому блюду.
6. Выдержите зараженные / трансфекции клеток в течение 6-8 часов (или на ночь) при 37 ° С, 5% СО _2, а затем заменить трансфекции СМИ с 1,5 мл свежей DMEM 10% FBS / PS.
7. Через 24 часа после трансфекции, контрольные лунки можно наблюдать под флуоресцентным микроскопом, чтобы оценить эффективность трансфекции (pCAGGs-GFP) и полимеразную активность Т7 (pCITE-GFP) (фиг.5А). Продолжайте совместного культивирования инфицированных / трансфицированных клеток фибробластов с птичьего как описано ниже.

4. Совместное культивирование клеток млекопитающих с клетки птиц (рис. 4А, 3-й день)

Как правило, сливающийся 100 мм тканевой культуры блюдо из курицы (CEFs) ог утки (DEFS) фибробласты эмбриона используется в двух трансфектированных скважин. Будьте уверены, чтобы подготовиться, заранее, достаточно 100 мм культур тканей блюда птичьего клеток на все попытки спасателей. Для эффективного спасения вируса, DMEM 10% FBS / PS носитель с добавлением 5% аллантоисной жидкости и 30 мМ MgCl _2. В этот момент 24 ч пи, клетки млекопитающих могут начать показывать цитопатического эффекта (CPE) за счет MVA-T7 инфекции, asevident на фиг.5А.

1. Разминка PBS 1X и средств массовой информации до 37 ° C.
2. Вымойте клетки млекопитающих, 2x, с 1 мл PBS 1x.
3. Trypsinize клетки млекопитающих с 0,2 мл EDTA-трипсина, пока они не отключены. Ресуспендируют клеток в 1 мл DMEM 10% FBS / PS, 5% аллантоисной жидкости, 30 мМ MgCl ₂ и переход на 100 мм чашки для культивирования тканей. Добавьте 3 мл же средствах массовой информации.
4. Промыть клетки птиц, в два раза, с 4 мл PBS 1X.
5. Trypsinize клетки птиц по 1 мл EDTA-трипсина и инкубировали в течение 1-2 мин при 37 ° С, пока клетки отделить. Ресуспендируйте йе клетки добавляя 8 мл DMEM 10% FBS / PS, 5% аллантоисной жидкости, 30 мм MgCl ₂ и добавить 4 мл трипсинизировали клеток к клеткам млекопитающих в совместном культивировании 100 мм блюдо культуры ткани для общего объема 8 мл (4 мл млекопитающих, 4 мл клетки птиц).
6. Аккуратно встряхните рукой на совместном культивировании клеток в 100 мм блюдо, чтобы иметь равномерное распределение, а затем поместить их в инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 3-4 дней. Критерии для заражения яйца 3 или 4 дня после совместного культуры млекопитающих и птиц клеток зависит от того, сколько цитопатический эффект (ячейка округление, смерть, отрыв от поверхности, и т.д..) Наблюдается в вирусной инфекции МВА-T7.

5. Заражение Куриный куриных эмбрионов (рис. 4А, Дни 6-7)

1. Через 3-4 дней совместного культуры млекопитающих и птиц клеток, удаление 1 мл супернатанта тканевой культуры, и добавить в пробирку Эппендорфа.
2. Центрифуга супернатанта тканевой культуры в течение 1 мин при 12000 оборотов в минуту в скамейкецентрифуга для удаления остатков клеток.
3. Свеча яйца с использованием световой короб просвечивании, чтобы увидеть интерфейс между мешок воздуха и аллантоидной. Сделайте отметку на границе интерфейс избегая локализацию кровеносных сосудов. Спрей 70% этанола по яйцам установить стерильных условий. Аккуратно сделать отверстие в скорлупе на отмеченных месте и привить 500 мкл супернатанта с помощью инсулина (1 мл) шприц, с целью иглу вертикально и прямо в аллантоидной. (Рис. 4В).
4. Закройте ник в яичной скорлупы с расплавленным воском или парафином.
5. Выдержите яйца в течение 2-3 дней при 37 ° С

6. Урожай аллантоисной жидкости от зараженных Куриный куриных эмбрионов (рис. 4А, Days 8-10)

1. Выдержите зараженные яйца на 2-4 часа или на ночь при 4 ° С, чтобы убить курицу эмбриона и коагуляции крови.
2. Спрей яйца с 70% этанола (для поддержания стерильных условий).
3. Осторожно коснитесь верхушечный раздел яйца, над воздушной полости, с ложкой. После того, как яичная скорлупа треснула, удалить фрагменты щипцами и полностью разоблачить аллантоисной мембрану.
4. Expose аллантоидной путем вырезания аллантоисной мембрану пинцетом и ножницами, избегая повреждения кровеносных сосудов и желток.
5. Осторожно надавите эмбрион с помощью шпателя и собирать восходящего потока аллантоисной жидкости (8-12 мл на яйцо) с 10 мл пипетки. Избегайте повреждения желток мембрану. Передача аллантоисной жидкости в центрифужную пробирку 15 мл на льду (использовать одну трубу на яйцо).
6. Уточнить аллантоисной жидкости центрифугированием в течение 5 мин при 1500 оборотах в минуту. Передача супернатант в чистую пробирку, не нарушая гранул.
7. Храните образцы при 4 ° С в течение до 1 недели, до проверки их на наличие NDV по гемагглютинации.

7. Гемагглютинации (HA) Анализ

Наличие вируса в Allantовой жидкость из инфицированных яиц может быть определена макроскопически по их способности hemagglutinate индейки эритроциты (RBC). В случае NDV, приблизительно 10 ⁶ бляшкообразующих единиц (БОЕ) на мл, должны дать положительный сигнал в тесте HA. HA Анализы осуществляли в виде пластин V-дно 96-луночных. Отрицательный (PBS 1x, неинфицированных аллантоисной жидкости), а также положительный (аллантоисной жидкости из любого вируса NDV) контрольные образцы должен всегда быть включен в любой HA анализа для подтверждения. Для выполнения анализа HA:

1. 50 мкл PBS 1X на лунку в 96-луночный планшет V-дно.
2. 50 мкл аллантоиса образцов жидкости в скважинах на первом столбце пластины. Выполнение 2-кратные серийные разведения до конца пластины и отбросить последний, дополнительные 50 мкл из лунки в последней колонке.
3. Внесите 50 мкл 0,5% индейки РБК в PBS 1x в хорошо. Аккуратно встряхните пластину, нажав.
4. Инкубировать при 4 ° С (или льда) Fили 30-45 мин или до получения прозрачного гранул образуется в отрицательных контрольных лунок.

Результаты

Спасение NDV является хорошо установленный порядок, регулярно проводится в лабораториях, которые имеют доступ к полному кДНК вируса. Тем не менее, внутренний стохастический характер метода делает его трудно достичь 100% эффективность помощь. Мониторинг ранние этапы процесса, специально ...

Обсуждение

Несколько факторов должны быть рассмотрены для достижения хороших результатов во время спасения NDV. Во-первых, кДНК полной длины конструкция для использования должна быть разработана, чтобы позволить функциональное включение новых модификаций / трансгенов в геном NDV. Это означает, как...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	CORNING Cellgro	10-013-CV	Any supplier
OptiMEM	GIBCO	31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019
35% Bovine Albumin (BA)	Sigma	232-936-2	Any supplier
Trypsin-EDTA	CORNING Cellgro	25-052-CI	Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x	CORNING Cellgro	30-002-CI	Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Any supplier
Cell lines A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. Embryonated chicken eggs Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols. Turkey red blood cells (RBC) Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days. Plasmids Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography. Viruses The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures. Tissue culture media and solutions: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C. 10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature. 1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4 °C.