Analyse du stress oxydatif dans embryons de poissons zèbres

Résumé

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Résumé

Des niveaux élevés d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) peuvent entraîner une modification de l'état redox cellulaire vers l'état de stress oxydatif. Cette situation provoque l'oxydation de molécules (lipides, ADN, protéines) et conduit à la mort cellulaire. Le stress oxydatif a également un impact sur la progression de plusieurs pathologies telles que le diabète, les rétinopathies, la neurodégénérescence, et le cancer. Ainsi, il est important de définir des outils pour étudier les conditions de stress oxydatif, non seulement au niveau des cellules individuelles, mais aussi dans le contexte des organismes entiers. Ici, nous considérons l'embryon de poisson zèbre comme un utile système in vivo pour effectuer des études et présenter un protocole pour mesurer le stress oxydatif in vivo. Profitant de sondes fluorescentes ROS et des lignes fluorescentes de poisson zèbre transgénique, nous développons deux méthodes différentes pour mesurer le stress oxydatif in vivo: i) un "embryon toute méthode ROS-détection" pour la mesure qualitative du stress oxydatif et ii) un "unicellulaire ROS méthode de détection "pour des mesures quantitatives de stress oxydatif. Ici, nous démontrons l'efficacité de ces procédés, en augmentant le stress oxydatif dans les tissus par des agents oxydants et des méthodes physiologiques ou génétiques. Ce protocole est prête pour les écrans génétiques avant et il aidera relations adresse de cause à effet de ROS dans des modèles animaux de pathologies liées au stress oxydatif, comme les troubles neurologiques et le cancer.

Introduction

Le stress oxydatif est spécifiquement définie comme un état qui résulte d'un état redox cellulaire asymétrique. Les réactions d'oxydoréduction complexes qui se produisent régulièrement dans les cellules déterminent l'état redox cellulaire. Les réactions d'oxydoréduction sont constitués de toutes les réactions chimiques qui se composent dans le transfert d'électrons entre les atomes des molécules biologiques produisant la réduction et l'oxydation de molécules (à savoir les réactions d'oxydo-réduction). Ces réactions sont catalysées par des espèces activées électroniquement (par exemple des espèces pro-oxydantes), qui se caractérisent par une extrême instabilité structurelle et activation spontanée d'électrons asymétriques qui échangent avec les biomolécules voisins. Ces réactions résultent en irréguliers dommages à l'ADN, des protéines carboxylation, et l'oxydation des lipides, et peuvent conduire à une mort cellulaire ^1. Des niveaux accrus de stress oxydatif ont été associées avec le vieillissement et la progression de différents états pathologiques ^2. Le stress oxydatif aété signalé comme étant responsable de modifications vasculaires dans le diabète et les maladies cardio-vasculaires ^3,4. Il joue également un rôle critique dans la dégénérescence neuronale dans la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson ^5. En outre, le stress oxydatif a été démontré comme un facteur essentiel dans la gouvernance progression du cancer et les événements métastatiques ^6,7. En outre, les réponses inflammatoires et immunitaires peuvent susciter et à soutenir davantage le stress oxydatif ^8.

Dans les cellules vivantes, les espèces pro-oxydantes sont dérivées de l'oxygène (ROS, les espèces réactives de l'oxygène) ou de l'azote (RNS; espèces réactives de l'azote). ROS comprennent le radical hydroxyle, l'anion superoxyde ^(OH.) (O ₂ ^-), et le peroxyde d'hydrogène (H ₂ O _2). Le principal RNS est l'oxyde nitreux ^(NO).. Une série d'espèces réactives secondaires peut être généré par des interactions spontanées entrn ROS et RNS ou les ions métaux libres ^9. Par exemple, l'anion superoxyde réagit avec l'oxyde nitreux pour former peroxynitrate (ONOO ^-), tandis que H ₂ O ₂ avec la réaction Fe ^{2 +} génère des radicaux hydroxyle. ROS et RNS, en raison de leur capacité à réagir avec plusieurs biomolécules, sont considérés comme une menace dangereuse pour le maintien de l'état redox physiologiques ^10. Pour maintenir les cellules de l'état d'oxydo-réduction sont équipées d'une série de détoxification de molécules anti-oxydantes et les enzymes. La superoxyde dismutase (SOD), catalase, glutathion peroxydase et peroxyrédoxines constitue essentiellement l'anti-oxydant enzymatique-arsenal qui fournit une protection cellulaire à partir d'espèces pro-oxydantes, y compris H ₂ O _2, OH et OONO ^{-. 11.} Également des molécules anti-oxydantes comme la vitamine C et E, polyphénols et CoenzymeQ10 (CoQ10) sont d'une importance critique pour étancher ROS et leur dangereux derivatives ^12,13. Cependant, une production excessive des ROS et RNS ou un dysfonctionnement dans le système anti-oxydant, déplace l'état redox cellulaire vers stress oxydatif ^14.

Outre leur connotation négative, ROS peut jouer différents rôles physiologiques dans les cellules d'origine différente. Les cellules produisent normalement ROS comme molécules de signalisation de la médiation des événements biologiques normaux tels que la défense de l'hôte et la réparation des plaies ^15-17. Les espèces réactives sont normalement produites dans les cellules par des enzymes intracellulaires telles que NOx (NADPH oxydase) et XO (xantine oxydase) en réponse à des facteurs de signalisation, des facteurs de croissance, et des fluctuations de niveaux intracellulaires de calcium ^18,19. Il a été rapporté que les ROS peut différentiellement moduler l'activité des facteurs nucléaires importantes telles que p53 ou des composants cellulaires tels que l'ATM-kinase, un régulateur maître de la réponse aux dommages de l'ADN ^20. Analogue ROS influencent fortement la signalisation cellulaire par la médiation eoxydation de e et l'inactivation des protéines tyrosine phosphatases (PTP), qui sont établis en tant que régulateurs critiques de la transduction du signal ^21. En outre, la protéomique basée méthodologies démontrent que RNS sont également responsables de modifications et altérations de la signalisation moléculaire de protéines spécifiques. RNS réagissent avec les groupements thiols de cystéine en les modifiant en S-nitrothiols (SNO) et de déclenchement voies moléculaires concomitantes avec des états pathologiques tels que les maladies inflammatoires et auto-immunes ^22,23.

Etant donné que des expériences de culture cellulaire ne se reproduisent que partiellement la multitude de facteurs qui agissent in vivo, il est d'un grand intérêt de réaliser des études d'oxydo-réduction dans les modèles animaux ^24,25. Pour ce faire, le poisson-zèbre a été considéré comme un modèle animal vertébré approprié pour étudier la dynamique de stress oxydatif ^26. Le poisson zèbre est un nouveau système de modèle qui accorde plusieurs avantages pour étudier les événements cellulaires et génétiques au cours des vertébrés developpement et la maladie. Grands groupes d'embryons hebdomadaire peuvent être générées et disponibles pour des besoins expérimentaux. En outre, la clarté optique extraordinaire embryons de poisson zèbre, ainsi que leur petite taille, permet l'imagerie cellulaire unique et le suivi dynamique dans toute une organismes ^27. Dans la dernière décennie, un nombre considérable de mutants de poisson zèbre a été générée pour modéliser des conditions pathologiques comme le cancer et les maladies génétiques ^28-31. Plus important encore, une multitude de lignées transgéniques ont été produites pour permettre de nombreuses possibilités de manipulations génétiques et biologiques ^32. Par exemple, des lignées spécifiques de tissus de poisson-zèbre transgénique sont régulièrement utilisés pour des études in vivo. Ces lignées expriment une protéine fluorescente sous le contrôle d'un promoteur choisi, en offrant la possibilité d'identifier des cellules individuelles in vivo, ainsi que la structure anatomique qu'elles comprennent.

Plusieurs études toxicologiques ont déjà utilisé til de poisson zèbre pour évaluer l'effet in vivo de produits chimiques sur homéostasie redox, suggérant la pertinence de ce vertébré comme un modèle animal pour le domaine de la découverte de médicaments et le stress oxydatif ^33-35. Même si certains des sondes fluorescentes ont été testés pour surveiller le stress oxydatif chez les larves de poisson zèbre ^36,37, il n'y a pas de tests mis en place pour détecter et mesurer les niveaux de stress oxydatif dans les tissus de poisson zèbre et les cellules vivantes. Ici, nous décrivons un procédé pour la quantification in vivo du stress oxydatif dans les cellules d'embryons de poisson zèbre vivant. Les outils d'imagerie, tri FACS, des sondes fluorescentes et les conditions pro-oxydantes sont combinés pour générer simple test pour la détection et la quantification des espèces oxydantes dans des embryons et des tissus de poisson zèbre.

Protocole

1. Préparation des instruments et solutions de travail

1. Préparer la solution de l'eau des poissons. Préparez une solution en dissolvant 2 g de sel de mer de l'océan instantanée 'dans 50 ml d'eau distillée. Ajouter 1,5 ml de stocker l'eau de poissons à 1 L d'eau distillée pour préparer prêt à utiliser de l'eau de poisson (60 pg / ml sels de mer de concentration finale). Autoclave le prêt à utiliser l'eau du poisson avant l'utilisation. Cette solution est utilisée en tant que support d'embryon de poisson zèbre.
2. Préparer la méthylcellulose pour le montage de l'embryon. Dissoudre 1,5 g de méthylcellulose dans 50 ml d'eau stérile de poisson. Faciliter la dissolution à l'aide d'un aimant sur une plaque d'agitation. La dissolution complète de la poudre peut nécessiter plusieurs heures. Vérifiez la solution pour plus de clarté et aliquote en petits tubes. Conserver à -20 ° C pendant des mois et dégeler aliquotes à usage. Centrifuger la méthylcellulose à 950 g pendant 5 min avant de l'utiliser. Éviter les cycles de gel-dégel de aliquotes.
3. Préparer 50 ml de tricaine / acétate d'éthyle-3 benzoate msel éthanesulfonate (solution mère) en dissolvant 200 mg de tricaine dans 100 ml d'eau et ajuster le pH à 7,0 à l'aide de Tris-HCl 1 M (pH 9). Conservez ce stock à 4 ° C pendant au plus 30 jours. ATTENTION: tricaine est toxique. Utilisez conformément aux lignes directrices de traitement appropriées.
4. Induisant un stress oxydatif dans les embryons de poisson zèbre
   1. Préparer une solution oxydante pour générique stress oxydatif induction: Faire 50 ml de solution d'oxydant par addition de H ₂ O ₂ stock solution (de peroxyde d'hydrogène; 100 mM) à l'eau du poisson. Utilisation _de H ₂ O ₂ à une concentration finale comprise entre 2 mM et 100 pM. Préparer cette solution juste avant l'utilisation. La solution oxydante peut être appliqué à la fois toute la montagne ROS-détection et unicellulaires méthodes ROS-détection. Ne rangez pas cette solution. ATTENTION: H ₂ O ₂ est dangereux, et nocif par inhalation et par ingestion. Contact avec une matière combustible peut provoquer un incendie. Manipuler sous une hotte de laboratoire et porter pers appropriéeséquipement de protection onal.
   2. Préparer une solution oxydante pour mitochondries dérivés stress oxydatif induction: Faire une solution mère d'oxydant (5 mM) en dissolvant 3,9 mg de la roténone dans 2 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO). Conserver cette solution à la température ambiante dans l'obscurité.
      1. Dissoudre la roténone solution stock à 10 ml d'eau de poissons pour faire une solution prête à utiliser. Utiliser la roténone à une concentration comprise entre 5 à 50 uM. Ne pas utiliser la roténone à des concentrations supérieures à 100 um. À des concentrations appropriées, cette solution oxydante peut être appliquée à la fois à l'ensemble de montage ROS-détection et monocellulaires méthodes de détection des ROS. ATTENTION: La roténone est toxique et dangereux. Manipuler selon les conseils de prudence appropriés.
   3. Induire un stress oxydatif par le gène knock-down: knock-down de l'expression du gène nrf2a dans embryons de poisson zèbre par micro-injection morpholino comme indiqué précédemment par Timme-Laragy A. et al, 2012 ^38..
   4. Provoquer oxidAtive stress après des lésions tissulaires: générer une marge de blessure à la nageoire caudale des embryons de poisson zèbre à 72 HPF comme décrit précédemment par Niethammer et al, 2009 ^39..
5. Préparer 5 ml de solution ROS-détection pour cellule unique méthode ROS-détection:
   1. Solution pour la détection de ROS général: Dissoudre la sonde moléculaire ROS-sensible générique dans HBSS (solution saline équilibrée de Hanks) afin de préparer une solution de travail (gamme de concentration: 2,5-10 M). Cette solution doit être préparée peu avant utilisation.
   2. Solution pour la détection spécifique de ROS induite par les mitochondries: Peu de temps avant l'utilisation, dissoudre une sonde mitochondriale de ROS-sensible avec du DMSO faire une solution mère de 5 mM. Dissoudre solution mère dans du HBSS afin de préparer une solution de travail (gamme de concentration: 2,5-10 M).
      REMARQUE: Évitez la lumière et l'oxygène exposition de solutions de travail ROS-détection et leurs solutions mères respectives. Protéger le tube de la lumière à l'aideune feuille d'aluminium. Ne pas entreposer ou sondes réutilisation dissous dans du HBSS. Conserver les solutions mères à -20 ° C pendant un mois.
      ATTENTION: Manipuler sondes moléculaires et DMSO sous une hotte en conformité avec les lignes directrices appropriées.
6. Préparer 5 ml de solution ROS-détection pour la méthode de montage ROS-détection: Dissoudre la solution sonde boursier ROS-sensible générique (stabilisé dans le DMSO) dans HBSS afin de préparer une solution de travail (gamme de concentration: 2,5-5 M). Evitez la lumière et de l'exposition à l'oxygène. Protéger le tube de la lumière. Préparer cette solution avant de l'utiliser. Ne pas stocker ou réutiliser cette solution. ATTENTION: Manipuler sondes moléculaires sous une hotte en conformité avec les lignes directrices appropriées.
7. Ajoutez 25 ml de solution d'arrêt par addition de 10 ml de sérum bovin fœtal à 15 ml de PBS 1x. Conserver la solution stérile. Conserver cette solution à 4 ° C. Cette solution n'est nécessaire que pour une seule cellule - méthode de détection ROS.
8. Régler l'incubateur de l'air de poisson zèbre à 28 ans &# 176; C.
9. Régler la centrifugeuse à 4 ° C pour le procédé de détection de ROS cellulaire unique.

2. L'accouplement des poissons adultes et la sélection des embryons de poissons zèbres

1. Mise en place adulte paire poisson zèbre traverse selon des protocoles standard ^40. Sélectionnez la ligne transgénique approprié en fonction des besoins expérimentaux spécifiques.
2. Ramassez les œufs et les placer dans un plat de 90 mm avec le milieu de l'eau du poisson / de l'embryon. Conserver les œufs à 28 ° C jusqu'à ce que les embryons vont se développer et croître jusqu'au stade désiré de développement (par exemple, 48 HPF, 72 HPF; HPF: heures après la fécondation).
3. Écran pour le développement des embryons. Exclure tous les œufs non fécondés ou d'embryons sous-développés.
4. Anesthésier embryons en ajoutant 1 ml de tricaïne (solution mère) dans 50 ml d'eau de poissons.
5. Sélectionnez Tg embryons fluorescentes sous une loupe binoculaire.

3. Traitement des embryons avec l'agent oxydant

1. Utilisez au moins 30 embryons entre 48 hpf et 72 HPF par des conditions différentes. Laver embryons fois à l'eau du poisson frais pour éliminer tricaine.
2. Diviser embryons fluorescentes en trois plats. Ne pas placer plus de 30 embryons / plat.
3. Retirer la solution de lavage et ajouter 10 ml de la solution d'oxydant ou de 10 ml d'eau du poisson comme solution de contrôle.
4. Incuber les embryons pour 10 min à 1 h à 28 ° C. La période d'incubation dépend du niveau de stress oxydatif d'être induite dans des tissus spécifiques. De courtes périodes sont les meilleurs que les cellules touchées par le stress oxydatif subissent progressivement la mort cellulaire.
5. embryons de transfert dans un nouveau plat contenant HBSS et embryons de lavage en remuant. Pré-HBSS chaud à 28 ° C.

4. Méthode de détection Mont ROS entier

1. Recueillir des embryons après traitement oxydant et mettre pas plus de 10 embryons dans un petit tube. Rincer avec de l'HBSS autant que possible. Protéger le tube de la lumière en utilisant une feuille d'aluminium.
2. Ajouter 1 ml de solution de détection pour ROSchaque tube.
3. Incuber les embryons dans l'obscurité pendant 15 min à 28 ° C pour éviter l'exposition de la lumière.
4. Pendant la durée d'incubation préparer une lame de verre pour l'analyse de l'embryon entier. Mettez 300 pi de méthylcellulose sur une "dépression" lame de verre et l'étaler sur la surface du verre avec une pointe de pipette. Éviter les bulles tout en libérant la méthylcellulose.
5. A la fin de la période d'incubation, retirer immédiatement la solution ROS-détection et laver deux fois avec 2 ml de HBSS. Laver les embryons en renversant le tube plusieurs fois. Ne pas pipeter ou vortex.
6. embryons en une pipette Pasteur en verre de Aspirer. embryons de position près de l'ouverture de la pipette et en douceur les éjectent dans la méthylcellulose. Orienter les embryons de manière appropriée avec un fil de nylon fin.
7. Comparer la fluorescence des embryons de contrôle avec des embryons traités. Alternativement, fixer les paramètres de la loupe binoculaire ou microscope confocal fluorescence de sorte que tous les embryons sont imagées par la mêmeparamètres d'imagerie.

5. Single Cell méthode ROS-détection

1. Commencez à l'étape: 3.5. Assurez-vous d'avoir au moins 35 embryons pour chaque condition.
2. Transfert d'embryons dans un nouveau plat. Enlever l'eau des poissons autant que possible. Ajouter 10 ml de PBS glacé 1x et 400 pi de inhibiteurs de la protéase cocktail. Dechorionate manuellement embryons avec une pince et retirer le sac du jaune d'oeuf avec une aiguille fine. Remarque: la suppression jaune sac assure échantillons propres pour l'analyse FACS suivant. Cette étape peut être évité selon l'instrument FACS.
3. Transfert de-vitellins embryons dans une plaque de 24 puits à puits multiples (15 embryons / puits) et supprimer toute l'eau du poisson.
4. Ajouter 300 ul de HBSS, 30 pl de la collagénase P, 50 ul de trypsine-EDTA dans chaque puits.
5. Homogénéiser embryons par un léger pipetage de haut en bas avec une pointe de pipette serré (1000 pi).
6. Incuber à 28 ° C pendant 20 min et l'homogénéiser les échantillons par pipetage toutes les 5 min.
7. Vérifiez DISR tissuuption en observant une aliquote de homogénat au microscope composé. Faciliter la suspension de cellules individuelles par pipetage. Ne pas incuber les embryons pendant plus de 30 min.
8. Arrêter la réaction en ajoutant 200 ul de solution d'arrêt. Mélanger à la pipette doucement.
9. Transférer la suspension cellulaire dans un tube pré-réfrigérés avec fond étanche. Gardez le tube sur la glace et éviter l'exposition de la lumière.
10. Centrifuger pendant 5 minutes à 250 g à 4 ° C.
11. Retirez la phase supérieure et les cellules re-suspension avec de la glace froide HBSS par pipetage.
12. Compter les cellules et assurez-vous que vous avez le même nombre de cellules dans l'ensemble de vos échantillons. Ne pas utiliser moins de 2 x 10 ⁶ cellules.
13. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 250 xg à 4 ° C.
14. Retirer le surnageant et suspendre le culot avec 1 ml de glace réfrigéré HBSS contenant la sonde ROS-sensible.
15. Incuber le tube à la température ambiante pendant 3 minutes dans l'obscurité. Varier la durée d'incubation en fonction du niveau de stress oxydatif et à til sensibilité de la sonde.
16. Transférer les cellules dans un tube FACS. Garder les tubes sur la glace et éviter l'exposition de lumière avant l'analyse FACS.
17. Trier les cellules avec un trieur de cellules activé par fluorescence (FACS). Longueurs d'onde réglée conformément à fluorescence Tg de tissu (par exemple, la GFP) et les spectres d'excitation / émission de la sonde moléculaire utilisée pour la détection ROS (par exemple, les sondes ROS-sensibles mitochondriales spécifiques, sondes ROS-sensibles génériques).
18. Pour chaque condition, mesurer tous les échantillons dans la même séance expérimentale en appliquant les mêmes paramètres FACS. Calculer le pourcentage de cellules fluorescentes comme la moyenne des différentes répétitions biologiques. Analyser au moins deux répétitions pour chaque condition.

Résultats

En appliquant la méthode décrite ici, nous pouvons facilement mesurer et détecter le stress oxydatif (et niveaux de ROS) dans les tissus embryonnaires de poisson zèbre. Après avoir traversé le poisson zèbre adulte, les oeufs sont recueillis et ont permis de développer à 28 ° C à 72 heures après la fécondation (HPF). Pour induire un stress oxydatif, nous proposons deux approches différentes: 1) le traitement des embryons avec de fortes réactifs pro-oxydants ou 2) la promotion de la formation de ROS après ...

Discussion

Étapes critiques

La procédure de détection d'un stress oxydatif dans les embryons de poisson zèbre décrits ici comprend deux méthodes différentes. L'ensemble de la méthode de montage ROS-détection est principalement un dosage qualitatif pour ROS-détection, tandis que la méthode de détection de ROS cellulaire unique permet des mesures quantitatives plus précises (figure 1). Les deux méthodes offrent un moyen rapide et facile d'évaluer in vivo ROS-...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Hydrogen peroxide solution	SIGMA	516813	DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1X	GIBCO	14025
Methyl cellulose	SIGMA	M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture	INSTANT OCEAN	SS15-10
Tricaine	SIGMA	A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe:                              CellROX Deep Red Reagent	INVITROGEN	C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX	INVITROGEN	M36008	dissolve one vial with 13μl of DMSO
Hydroethidine	INVITROGEN	D23107
Rotenone	SIGMA	R8875	Prepare 5mM stock solution in DMSO.
Dimethyl sulfoxide	SIGMA	D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine	EnzoLifeScience	BML-EI395	dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide	Molecular probes       (Life Technologies)	P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)	Molecular probes         (Life Technologies)	A1310
Nrf2a Morpholino	GeneTools	5'-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3'	Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 )
Collagenase P	ROCHE	11213857001	Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20°C
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	GIBCO	10010-056
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	ROCHE		Dissolve one tablet in 1ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red	GIBCO	15400-054	Prepare 1X working solution before usage
Compound microscope	ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination	Nikon	AZ100
camera	ZEISS	AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition	ZEISS	ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter	BD FACSCalibur
Centrifuge	Eppendorf	5417R
FACS tubes	BD	342065
Multiwell Plate	BD Falcon	353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90mm	VWR	391-1915
Confocal microscope	Leica	Leica SP5