Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Özet

Reaktif oksijen türlerinin (ROS) yüksek düzeyde oksidatif stres durumuna karşı hücresel redoks durumunda bir değişikliğe neden olabilir. Bu durum, moleküllerin (yağ, DNA, protein) oksidasyonuna neden olur ve hücre ölümüne yol açar. Oksidatif stres de etkiler, diyabet, retinopati, nörodejenerasyon ve kanser gibi çeşitli patolojik koşulların ilerlemesi. Bu nedenle, tek hücre düzeyinde değil, aynı zamanda bütün organizmaların bağlamında sadece oksidatif stres koşulları araştırmak için araçlar tanımlamak önemlidir. Burada, bu tür çalışmalar gerçekleştirmek ve in vivo oksidatif stresi ölçmek için bir protokol mevcut in vivo sisteminde yararlı olarak Zebra balığı embriyo düşünün. "I) oksidatif stres nitel ölçümü için" bütün embriyo ROS-algılama yöntemi "ve ii): floresan ROS prob ve zebra balığı transgenik floresan hatlarının yararlanarak, in vivo oksidatif stresi ölçmek için iki farklı yöntem geliştirmekoksidatif stres kantitatif ölçümleri için, tek hücreli bir ROS algılama yöntemi ". Burada, oksitleyici maddeler ve fizyolojik ya da genetik yöntemlerle dokularda oksidatif stresi artırarak bu işlemlerin etkinliğini göstermektedir. Bu protokol, ileri genetik ekranlar için müsait olan ve bu tür nörolojik bozukluklar ve kanser gibi oksidatif stresle ilgili patolojiler hayvan modellerinde ROS adresi neden-sonuç ilişkilerini yardımcı olacaktır.

Giriş

Oksidatif stres özellikle dengesiz hücresel redoks durumundan kaynaklanan bir durum olarak tanımlanır. Rutin hücrelerin içinde meydana kompleksinin redoks reaksiyonları hücresel redoks-durumunu belirlemek. Redoks reaksiyonları azaltma ve molekül (yani redoks reaksiyonları) oksidasyonunu üreten biyolojik moleküllerin atomları arasında elektron transferinde oluşan, kimyasal reaksiyonlar oluşur. Bu reaksiyonlar, bir uç yapı kararsızlık ve komşu biyomoleküllerle alışverişi dengesiz elektron kendiliğinden aktivasyonu ile karakterize edilir elektronik aktif bir tür (örneğin pro-oksidatif türleri) ile katalize edilir. Bu düzensiz reaksiyonlar DNA hasarı, protein karboksilasyon ve lipid oksidasyon haline neden ve sonuçta hücre ölümüne 1. yol açar. Oksidatif stres seviyelerinin artması yaşlanma ve farklı patolojik durumların 2'nin ilerlemesi ile ilişkilendirilmiştir. Oksidatif stres vardiyabet, kalp-damar hastalıkları 3,4 vasküler değişikliklerden sorumlu olduğu bildirilmiştir. Ayrıca, Alzheimer hastalığı nöronal dejenerasyon önemli bir rol oynar ve Parkinson hastalığı 5. Ayrıca, oksidatif stres kanser ilerlemesini ve metastatik olayları 6,7 yöneten kritik bir faktör olarak kanıtlanmıştır. Buna ek olarak, enflamasyon ve immün yanıtları ortaya ve diğer destek oksidatif stres 8 olabilir.

Veya nitrojen (RNS; reaktif nitrojen türleri); canlı hücreler olarak, pro-oksidatif oksijen türleri (ROS reaktif oksijen türleri) türetilir. (H 2 O 2) ve hidrojen peroksit - (O 2) ROS superoksit anyon (. OH) hidroksil radikali içerir. Birincil RNS nitröz oksit (NO). Olduğunu. İkinci reaktif türlerin bir dizi betwee kendiliğinden etkileşimleri ile üretilebilirn ROS ve RNS veya ücretsiz metaller 9 iyonların. H 2 O 2 Fe2 + hidroksil radikalleri meydana ile reaksiyona sokulması sırasında, - örneğin, süperoksit anyon peroxynitrate (ONOO) oluşturmak için azot oksit ile reaksiyona girer. ROS ve RNS nedeniyle çok biyomoleküller ile tepkimeye yetenekleri için, fizyolojik redoks durumuna 10 bakımı için tehlikeli bir tehdit olarak kabul edilir. Korumak için redoks durumu hücreleri, anti-oksidan moleküllerini ve detoksifiye edici enzimler, bir dizi ile donatılmıştır. . 11 - süperoksit dismutaz (SOD), katalaz, glütatyon peroksidaz ve Peroxiredoxins esas H2O 2, OH ve Oono de dahil olmak üzere pro-oksidatif türlerden hücresel koruma sağlayan, anti-oksidan enzimatik-cephanelik oluşturmaktadır. Ayrıca C vitamini ve E, polifenoller ve CoEnzymeQ10 (CoQ10) gibi anti-oksidan moleküller ROS ve tehlikeli DE gidermek için kritik öneme sahip12,13 türevleri üzerinde. Bununla birlikte, ROS ve RNS, ya da anti-oksidan sisteminde bir fonksiyon bozukluğu, aşırı üretimi oksidatif stres 14 doğru hücresel redoks durumunu değiştirir.

Onların olumsuz çağrışım yanı sıra, ROS farklı kökenli hücrelerde çeşitli fizyolojik roller oynayabilir. Hücreler normalde böyle konak savunma ve yara onarımı 15-17 gibi normal biyolojik olaylara aracılık için sinyal molekülleri olarak ROS üretir. Reaktif türlerin normal sinyalizasyon faktörleri, büyüme faktörleri, ve kalsiyum seviyeleri 18,19 hücre içi dalgalanmalara tepki olarak bu NOx (NADPH oksidaz) ve XO (ksantin oksidaz) gibi hücre içi enzimlerin hücrelerinde üretilir. Bu ROS diferansiyel örneğin p53 ya da ATM-kinaz, DNA hasarı 20 için cevabın bir ana regülatör olarak, hücresel bileşenler olarak önemli bir nükleer faktör aktivitesini modüle edebilir olduğu bildirilmiştir. Benzer ROS kuvvetle inci aracılık ederek hücresel sinyalizasyonu etkileyebilire oksidasyon ve sinyal iletimi 21 arasında önemli bir düzenleyici olarak oluşturulan protein tirozin fosfatazlar (PTP), inaktivasyonu. Ayrıca, proteomik göre yöntemler RNS aynı zamanda spesifik protein modifikasyonları ve moleküler sinyallemesinin değişikliklerden sorumlu olduğunu göstermektedir. S-RNS nitrothiols (SNO) içine değiştirerek ve bu enflamatuar ve otoimmün hastalıklarda 22,23 gibi patolojik durumları ile birlikte moleküler yolları tetikleme sistein tiyol grupları ile reaksiyona girmektedir.

Hücre kültürü deneyleri sadece kısmen in vivo etkili faktörlerin sayıda yeniden beri, hayvan modellerinde 24,25 redoks çalışmalar gerçekleştirmek için büyük ilgi olduğunu. Bunu başarmak için, zebra balığı oksidatif stres dinamiklerini 26 incelemek için uygun bir omurgalı hayvan modeli olarak kabul edilmiştir. Zebra balığı çeşitli avantajları omurgalı dev sırasında hücresel ve genetik olayları incelemek için izin veren yeni bir model sistemelopment ve hastalık. Embriyolarının büyük kümeler deneysel ihtiyaçları için haftalık oluşturulur ve mevcut olabilir. Ayrıca Zebra balığı embriyolarının olağanüstü optik netlik, hem de kendi küçük boyutu, bütün organizmalar 27 tek hücre görüntüleme ve dinamik bir izleme sağlar. Son on yılda, zebra balığı mutantlar önemli sayıda kanser ve genetik hastalıklar 28-31 gibi insan patolojik durumları modellemek için oluşturulan edilmiştir. En önemlisi, transjenik soylarda çok sayıda genetik ve biyolojik manipülasyonlar 32 arasında geniş olanaklar sağlamak için hazırlanmıştır. Örneğin, transgenik dokuya özgü zebra balığı hatları düzenli olarak in vivo çalışmalar için kullanılmaktadır. Bu hatlar, in vivo olarak, tek hücreleri tanımlamak için yeteneği, hem de bu ihtiva anatomik yapısını sunan seçilen bir promoterin kontrolü altında bir floresan proteini ifade eder.

Çeşitli toksikolojik çalışmalar zaten t kullanmışo ilaç keşfi ve oksidatif stres 33-35 alanında için bir hayvan modeli olarak, bu omurgalının uygunluğunu gösteren, redoks homeostazı ile ilgili kimyasalların in vivo etkisini değerlendirmek için zebra balığı. Bazı floresan probları Zebra balığı larvaları 36,37 oksidatif stresi izlemek için test edilmiş olsa da, Zebra balığı dokulardaki oksidatif stres düzeyleri ve yaşam hücreleri algılamak ve ölçmek için hiçbir kurulmuş tahliller vardır. Burada zebrafish embriyoların canlı hücreler oksidatif stres in vivo ölçümü için bir prosedür tarif eder. Görüntüleme araçları, FACS, flüoresan probları ve pro-oksidatif koşullar her zebra balığı embriyolar ve dokularda oksidatif türlerinin saptanması ve miktarının belirlenmesi için basit bir deney oluşturmak için birleştirilir.

Protokol

Araçların ve Çalışma Çözümleri 1. Hazırlanması

  1. Balık su çözeltisi hazırlayın. Damıtılmış su, 50 ml deniz tuzları "Instant Ocean" 2 g eriterek bir stok çözeltisi yapın. Balık suyu (60 ug / ml nihai konsantrasyon deniz tuzu) kullanıma hazır hazırlamak için 1 L damıtılmış su stok balık su 1.5 ml ilave edilir. Kullanımdan önce balık suyu kullanmaya hazır otoklavlayın. Bu çözüm, zebra balığı, embriyo ortamı olarak kullanılır.
  2. Embriyo montaj için metilselüloz hazırlayın. Balık steril 50 ml su içinde 1.5 g metilselüloz çözülür. Bir karıştırıcı plaka üzerinde bir mıknatıs kullanılarak erimesini kolaylaştırmak. Tozun tam çözünme birkaç saat gerekebilir. Küçük tüpler içine netlik ve kısım için çözüm kontrol edin. Ay boyunca -20 ° C'de saklayın ve kullanımda alikotları çözülme. Kullanmadan önce, 5 dakika boyunca 950 x g'de santrifüje metilselüloz. Alikotların donma-erime döngülerinden kaçınmak.
  3. Tricaine / etil 3-aminobenzoat m, 50 ml hazırlamak100 ml su içinde, 200 mg tricaine eritilmesi ve Tris-HCl, 1 M (pH 9) ile pH 7.0 'ye ayarlanması ile etansülfonat tuzu (stok çözelti). En fazla 30 gün boyunca 4 ° C'de, bu stok saklayın. DİKKAT: tricaine toksiktir. Uygun kullanım talimatlarına uygun olarak kullanın.
  4. Zebra balığı embriyolar oksidatif stres yaratmadan
    1. Genel oksidatif stres oluşumu için bir oksitleyici çözelti hazırlayın: H 2 O 2 stok çözeltisi (hidrojen peroksit, 100 mM) eklenmesi ile oksidan, çözelti 50 ml olun balık su. 2 mM ile 100 uM arasında bir nihai konsantrasyon 2 H O 2 kullanın. Kısa bir süre kullanımdan önce bu çözüm hazırlayın. Oksidan, çözelti, bütün montaj ROS-algılama ve tek hücreli ROS-algılama yöntemlerinin her ikisine de uygulanabilir. Bu çözüm saklamayın. DİKKAT: H 2 O 2, tehlikeli ve solunduğunda zararlıdır ve yutulduğunda. Yanıcı maddelerle temasında yangına neden olabilir. Davlumbaz altında işlemek ve uygun pers giymekÖnal koruyucu ekipman.
    2. Mitokondri türevi oksidatif stres oluşumu için bir oksitleyici çözelti hazırlayın: dimetil sülfoksit (DMSO) içinde bir 2 ml rotenone 3.9 mg çözülmesiyle bir oksidan stok çözeltisi (5 mM) olun. Karanlıkta, oda sıcaklığında, bu çözüm tutun.
      1. Çözümü kullanmak için hazır hale getirmek için balık suda 10 ml rotenone stok solüsyonu çözülür. 5-50 uM arasında bir konsantrasyonda rotenon kullanın. 100 uM daha yüksek konsantrasyonlarda rotenon kullanmayın. Uygun konsantrasyonlarda, bu oksidan, çözelti, bütün montaj ROS-algılama ve tek hücreli ROS-algılama yöntemlerinin her ikisine de uygulanabilir. DİKKAT: Rotenone zehirli ve tehlikelidir. Uygun önlem ifadeleri göre tutun.
    3. Gen tarafından oksidatif strese neden knock-down: Knock-down nrf2a gen ifadesini Zebra balığı embriyolarının morfolinodur mikroenjeksiyon tarafından önceden Timme-Laragy A. ve diğerleri, 2012 38 tarafından bildirilen..
    4. Oxid Inducedoku hasarı sonrası stres Ative:. önceden Niethammer ve ark, 2009 39 tarafından açıklandığı gibi 72 hpf Zebra balığı embriyolarının kuyruk yüzgecinin bir yara marjı oluşturur.
  5. Tek hücre ROS-saptama yöntemi için ROS-algılama çözeltisi 5 ml hazırlanması:
    1. Bir çalışma çözeltisi (: 2.5-10 uM konsantrasyon aralığı) hazırlamak amacıyla, HBSS (Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi) 'de genel ROS-duyarlı molekül prob eritin: Genel ROS tespiti için çözümü. Bu çözüm, kısa bir süre kullanımdan önce hazırlanmış olmalıdır.
    2. Mitokondri tarafından uyarılan özgü saptama ROS Çözüm: kullanımdan hemen önce, DMSO, 5 mM stok çözelti yapma ile bir mitokondriyal ROS duyarlı probu çözülür. Bir çalışma çözeltisi (: 2.5-10 uM konsantrasyon aralığı) hazırlamak amacıyla HBSS içinde stok çözeltisi çözülür.
      NOT: ROS-algılama çalışma çözümleri ışık ve oksijen maruz kalma ve kendi stok çözümleri kaçının. Kullanılarak ışık tüpü korumakbir alüminyum folyo. Saklamak veya HBSS'de çözülmüş yeniden kullanımı sondalar etmeyin. Bir ay boyunca -20 ° C 'de stok çözelti saklayın.
      DİKKAT: Uygun kurallarına uygun bir davlumbaz altında moleküler problar ve DMSO'yu tutun.
  6. Bütün montaj ROS-saptama yöntemi için ROS-algılama çözeltisi 5 ml hazırlayın: bir çalışma çözeltisi (: 2,5-5 uM konsantrasyon aralığı) hazırlamak amacıyla, HBSS (DMSO içinde stabilize edilmiş) genel ROS duyarlı probu stok çözeltisi içinde çözündürülür. Işık ve oksijen maruz kalmaktan kaçınınız. Işıktan tüp koruyun. Kullanmadan önce bu çözüm hazırlayın. Bu çözümü saklamak veya yeniden kullanmayın. DİKKAT: Uygun kurallarına uygun bir davlumbaz altında moleküler problar taşıyınız.
  7. PBS 1x 15 ml cenin sığır serumu 10 mi eklenerek Durdurma Solüsyonu 25 ml olun. Steril çözüm tutun. 4 ° C 'de, bu çözüm Mağaza ROS algılama yöntemi - Bu çözüm sadece tek bir hücre için gereklidir.
  8. 28 ve at Zebrafish hava inkübatör ayarlayın# 176; C.
  9. Tek hücre ROS-saptama yöntemi boyunca 4 ° C'de santrifüj ayarlayın.

2.. Yetişkin Balıkların Çiftleşme ve Zebra balığı Embriyolar Seçimi

  1. Set-up yetişkin zebrabalıkları çifti standart protokollere göre 40 haçlar. Spesifik deneysel ihtiyaçlarına uygun olarak, uygun transjenik çizgi seçin.
  2. Yumurta toplamak ve balık su / embriyo orta ile 90 mm çanak içine koyun. Embriyolar geliştirmek ve istenilen gelişimsel aşamada büyüyecek kadar 28 ° C'de yumurta tutmak (örneğin, 48 hpf, 72 hpf; hpf: saat sonra döllenme).
  3. Embriyoların geliştirilmesi için ekran. Tüm döllenmemiş yumurta veya az gelişmiş embriyolar dışlamak.
  4. 50 ml su içinde balık tricaine (stok çözelti) içinde 1 ml ilave etmek suretiyle embriyolar anestezisi.
  5. Stereomicroscope altında Tg floresan embriyolar seçin.

Oksidan Agent ile Embriyoların 3. Tedavisi

  1. 48 saat arasında en az 30 embriyolar kullanınpf ve 72 farklı durum başına HPF. Tricaine çıkarmak için taze balık iki kere su ile embriyolar yıkayın.
  2. Üç yemeklerin içine floresan embriyolar Split. En fazla 30 embriyo / çanak koymak.
  3. Yıkama çözeltisini çıkarın ve oksidan, çözelti 10 ml ya da kontrol çözeltisi gibi balık su 10 ml ekleyin.
  4. 28 ° C'de 1 saat 10 dakika boyunca inkübe embriyolar Kuluçka süresi, belirli dokularda indüklendiği oksidatif stres düzeyine göre değişir. Oksidatif stres etkilenen hücreleri ilerleyici hücre ölümünü geçmesi gibi kısa dönemler iyisidir.
  5. Dönen tarafından HBSS ve yıkama embriyoları içeren yeni bir çanak içine embriyolar transfer. 28 ° C'de önceden sıcak HBSS

4.. Tüm Dağı ROS Algılama Yöntemi

  1. Oksidan tedaviden sonra embriyolar toplayın ve küçük bir tüp içinde en fazla 10 embriyolar koydu. HBSS ile mümkün olduğu kadar yıkayın. Alüminyum folyo kullanarak ışık tüpü koruyun.
  2. ROS için algılama çözeltisi 1 ml ilave edilirHer bir tüp.
  3. Işık maruz kalmasını önlemek için 28 ° C'de 15 dakika boyunca karanlıkta inkübe embriyolar.
  4. Inkübasyon süresi boyunca bütün embriyo analizi için bir cam slayt hazırlar. Bir "depresyon" cam slayt metilselüloz 300 ul koyun ve bir pipet ile cam yüzeye yayılır. Metilselüloz bırakırken kabarcıkları kaçının.
  5. İnkübasyon süresi sonunda, hemen ROS algılama çözüm kaldırmak ve 2 ml HBSS ile iki kez yıkayın. Tüpü birkaç kez baş aşağı çevirerek embriyolar yıkayın. Pipet veya vorteks etmeyin.
  6. Kadar cam Pasteur pipet içine aspire embriyolar. Pipet açılışına yakın ve yavaşça pozisyon embriyolar metilselüloz içine bunları çıkarın. Ince naylon hattı ile uygun embriyolar yönlendirmek.
  7. Tedavi edilen embriyolar ile embriyo kontrol floresan karşılaştırın. Tüm embriyolar aynı kullanarak görüntülü böylece Alternatif olarak, flöresanlı bir stereomikroskop veya konfokal mikroskop parametrelerini saptamakgörüntüleme ayarları.

5.. Tek Hücre ROS-algılama Yöntemi

  1. 3.5: aşama başlatın. Her durum için en az 35 embriyo var emin olun.
  2. Yeni bir çanak içine embriyolar aktarın. Balık suya mümkün olduğunca kaldırın. Buz soğukluğunda PBS 1x 10 ml ve Proteaz İnhibitörleri Kokteyl 400 ul ekleyin. Elle forseps ile embriyolar dechorionate ve ince bir iğne ile yumurta sarısı çuval çıkarın. Not: sarısı çuval Çıkarma aşağıdaki FACS analizi için temiz örnekleri sağlar. Bu adım, FACS alet uygun bir biçimde yok edilebilir.
  3. Aktarım de-yolked, 24 oyuklu çoklu gözenekli plakanın içine embriyolar (15 embriyo / çukur) ve tüm balık suyu çıkarmak.
  4. HBSS 300 ul, 30 ul kolajenaz P, her bir oyuğa 50 ul tripsin-EDTA ekleyin.
  5. Sıkı bir pipet (1.000 ul) ile hafifçe yukarı pipetleme ve aşağı embriyolar homojenize.
  6. 20 dakika boyunca 28 ° C'de inkübe edilir ve her 5 dakikada pipetleme örnekleri homojenize edilmiştir.
  7. Doku DISR edinbileşik mikroskobunda homojenat bir kısım gözlemleyerek uption. Pipetleme tek hücre süspansiyonu kolaylaştıracak. Fazla 30 dakika boyunca embriyolar inkübe etmeyin.
  8. Durdurma Solüsyonu 200 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun. Hafifçe pipetleme karıştırın.
  9. Dar bir tabana sahip önceden soğutulmuş bir tüp içine hücre süspansiyonu aktarın. Buz üzerinde tüp tutun ve ışık maruz kalmaktan kaçının.
  10. 4 ° C'de 250 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj
  11. Hafifçe pipetleme buz HBSS ile üst faz ve yeniden askıya hücreleri çıkarmak.
  12. Hücrelerin sayısı ve sizin tüm örneklerde hücrelerin aynı numara olduğundan emin olun. Az 2 x 10 6 hücre kullanmayın.
  13. 4 ° C'de 250 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj hücreleri
  14. Süpernatantı ve ROS duyarlı probu içeren buz gibi soğutulmuş HBSS 1 ml pelet askıya.
  15. Karanlıkta 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin tüpü. Oksidatif stres seviyesine göre inkübasyon süresi değişebilir ve tProbun o hassasiyeti.
  16. Bir FACS tüpü hücreleri aktarın. Buz üzerinde tüpler tutmak ve FACS analizden önce ışık maruz kalmaktan kaçının.
  17. Bir floresan-aktive edilmiş hücre ayırıcı (FACS) hücreleri sıralar. Tg doku floresan (örneğin, GFP) ve ROS tespiti (örneğin, belirli mitokondriyal ROS-duyarlı sondalar, genel ROS-duyarlı problar) için kullanılan moleküler prob uyarma / emisyon spektrumları uygun set dalga boyları.
  18. Her bir durum için, aynı FACS ayarlarını uygulayarak, aynı deneysel oturumdaki tüm örneklerini ölçmek. Farklı biyolojik kez tekrarlanan deneyin ortalaması olarak floresan hücrelerin yüzdesini hesaplayın. Her bir durum için en az iki analiz çoğaltır.

Sonuçlar

Burada anlatılan yöntemi uygulayarak, kolayca ölçebilir ve zebra balığı embriyonik dokularda oksidatif stres (ve ROS seviyelerini) algılar. Yetişkin zebrafish geçtikten sonra, yumurta toplandı ve 72 saat sonrası fertilizasyon (hpf) 28 ° C'de gelişmeye bırakıldı. Güçlü pro-oksidan reaktifleri ile embriyoların 1) tedavi veya doku yaralanma sonrası 2) teşvik ROS oluşumu: oksidatif strese neden amacıyla, iki farklı yaklaşımı öneriyoruz.

Hidrojen peroksit (2...

Tartışmalar

Kritik Adımlar

Burada tarif zebra balığı embriyolar oksidatif stres saptanması için prosedür, iki farklı yöntem ihtiva eder. Tek hücre ROS-saptama yöntemi (Şekil 1), daha özel niceliksel ölçümlerini sağlar iken bütün montaj ROS-saptama yöntemi, esas olarak ROS-nitel olarak saptanması için bir deneydir. Her iki yöntem de Zebra balığı embriyolarının üzerinde in vivo ROS-algılama değerlendirmek için hızlı ve kolay bir yol sunar. Ancak, h...

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

Support in Massimo Santoro lab come from HFSP, Marie Curie Action, Telethon and AIRC. We thank Dafne Gays and Emiliano Panieri for critical reading of the manuscript.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Material/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
Hydrogen peroxide solutionSIGMA516813DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1XGIBCO14025
Methyl celluloseSIGMAM0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt MixtureINSTANT OCEANSS15-10
TricaineSIGMAA5040
Cgeneric ROS-sensitive probe:                              CellROX Deep Red ReagentINVITROGENC10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX INVITROGENM36008dissolve one vial with 13μl of DMSO
HydroethidineINVITROGEND23107
RotenoneSIGMAR8875Prepare 5mM stock solution in DMSO. 
Dimethyl sulfoxideSIGMAD2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidineEnzoLifeScienceBML-EI395dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide Molecular probes       (Life Technologies) P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD) Molecular probes         (Life Technologies) A1310
Nrf2a MorpholinoGeneTools5'-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3'Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 )
Collagenase PROCHE11213857001Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20°C
Phosphate-Buffered Saline (PBS)GIBCO10010-056
Fetal Bovine Serum GIBCO10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail TabletsROCHEDissolve one tablet in 1ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol redGIBCO15400-054Prepare 1X working solution before usage
Compound microscope ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illuminationNikonAZ100
camera ZEISSAxioCamMRm
software for fluorescence image acquisitionZEISSZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorterBD FACSCalibur
Centrifuge Eppendorf5417R
FACS tubes BD342065
Multiwell Plate BD Falcon353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90mmVWR391-1915
Confocal microscopeLeicaLeica SP5

Referanslar

  1. Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
  2. Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Exp Cell Res. 314, 1918-1922 (2008).
  3. Chen, A. F., et al. Free radical biology of the cardiovascular system. Clin Sci (Lond. 123, 73-91 (2012).
  4. Selvaraju, V., et al. Diabetes, oxidative stress, molecular mechanism, and cardiovascular disease--an overview. Toxicol Mech Methods. 22, 330-335 (2012).
  5. Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, (2012).
  6. Shi, X., Zhang, Y., Zheng, J., Pan, J. Reactive oxygen species in cancer stem cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1215-1228 (2012).
  7. Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles' heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1212-1214 (2012).
  8. Park, H., Bourla, A. B., Kastner, D. L., Colbert, R. A., Siegel, R. M. Lighting the fires within: the cell biology of autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 12, 570-580 (2012).
  9. Nathan, C., Ding, A. SnapShot: Reactive Oxygen Intermediates (ROI). Cell. 140, 951-951 (2010).
  10. Brown, G. C., Borutaite, V. Interactions between nitric oxide, oxygen, reactive oxygen species and reactive nitrogen species. Biochem Soc Trans. 34, 953-956 (2006).
  11. Brieger, K., Schiavone, S., Miller, F. J., Krause, K. H. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Med Wkly. 142, (2012).
  12. Littarru, G. P., Tiano, L., Belardinelli, R., Watts, G. F. Coenzyme Q(10), endothelial function, and cardiovascular disease. Biofactors. 37, 366-373 (2011).
  13. Landete, J. M. Dietary intake of natural antioxidants: vitamins and polyphenols. Crit Rev Food Sci Nutr. 53, 706-721 (2013).
  14. Finkel, T. Oxidant signals and oxidative stress. Curr Opin Cell Biol. 15, 247-254 (2003).
  15. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
  16. Sarsour, E. H., Kumar, M. G., Chaudhuri, L., Kalen, A. L., Goswami, P. C. Redox control of the cell cycle in health and disease. Antioxid Redox Signal. 11, 2985-3011 (2009).
  17. Nathan, C., Shiloh, M. U. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 8841-8848 (2000).
  18. Finkel, T. Signal transduction by reactive oxygen species. J Cell Biol. 194, 7-15 (2011).
  19. Autreaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
  20. Maryanovich, M., Gross, A. A ROS rheostat for cell fate regulation. Trends Cell Biol. 23, 129-134 (2013).
  21. Tonks, N. K. Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling. Cell. 121, 667-670 (2005).
  22. Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxid Redox Signal. 14, 1049-1063 (2011).
  23. Foster, M. W., Hess, D. T., Stamler, J. S. Protein S-nitrosylation in health and disease: a current perspective. Trends Mol Med. 15, 391-404 (2009).
  24. Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metab. 14, 819-829 (2011).
  25. Knoefler, D., et al. Quantitative in vivo redox sensors uncover oxidative stress as an early event in life. Mol Cell. 47, 767-776 (2012).
  26. Fang, L., Miller, Y. I. Emerging applications for zebrafish as a model organism to study oxidative mechanisms and their roles in inflammation and vascular accumulation of oxidized lipids. Free Radic Biol Med. 53, 1411-1420 (2012).
  27. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  28. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  29. Jing, L., Zon, L. I. Zebrafish as a model for normal and malignant hematopoiesis. Dis Model Mech. 4, 433-438 (2011).
  30. Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 311-340 (2002).
  31. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  32. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
  33. Duan, J., Yu, Y., Li, Y., Sun, Z. Cardiovascular toxicity evaluation of silica nanoparticles in endothelial cells and zebrafish model. Biomaterials. 34, 5853-5862 (2013).
  34. Sobrino-Figueroa, A. S. Evaluation of oxidative stress and genetic damage caused by detergents in the zebrafish Danio rerio (Cyprinidae). Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 165, 528-532 (2013).
  35. Xu, H., et al. Oxidative stress and immune related gene expression following exposure to di-n-butyl phthalate and diethyl phthalate in zebrafish embryos. Ecotoxicol Environ Saf. 93, 39-44 (2013).
  36. Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J Immunol Methods. 292, 119-129 (2004).
  37. Rieger, S., Sagasti, A. Hydrogen peroxide promotes injury-induced peripheral sensory axon regeneration in the zebrafish skin. PLoS Biol. 9, (2011).
  38. Timme-Laragy, A. R., et al. Nrf2b, novel zebrafish paralog of oxidant-responsive transcription factor NF-E2-related factor 2 (NRF2). J Biol Chem. 287, 4609-4627 (2012).
  39. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
  40. Murphy, M. P., et al. Perspective. Cell Metabolism. 13 (4), 361-366 (2011).
  41. Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. J Biol Chem. 278, 8516-8525 (2003).
  42. Rhee, S. G., Chang, T. S., Jeong, W., Kang, D. Methods for detection and measurement of hydrogen peroxide inside and outside of cells. Mol Cells. 29, 539-549 (2010).
  43. Murphy, M. P., et al. Unraveling the biological roles of reactive oxygen species. Cell Metab. 13, 361-366 (2011).
  44. Covassin, L., et al. Global analysis of hematopoietic and vascular endothelial gene expression by tissue specific microarray profiling in zebrafish. Dev Biol. 299, 551-562 (2006).
  45. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  46. Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends Cell Biol. 16, 105-112 (2006).
  47. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  48. Moussavi Nik, S. H., et al. The BACE1-PSEN-AbetaPP regulatory axis has an ancient role in response to low oxygen/oxidative stress. J Alzheimers Dis. 28, 515-530 (2012).
  49. Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136, 865-875 (2009).
  50. Mukaigasa, K., et al. Genetic evidence of an evolutionarily conserved role for Nrf2 in the protection against oxidative stress. Mol Cell Biol. 32, 4455-4461 (2012).
  51. Mugoni, V., et al. Ubiad1 is an antioxidant enzyme that regulates eNOS activity by CoQ10 synthesis. Cell. 152, 504-518 (2013).
  52. Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
  53. Sun, Y., Dong, Z., Khodabakhsh, H., Chatterjee, S., Guo, S. Zebrafish chemical screening reveals the impairment of dopaminergic neuronal survival by cardiac glycosides. PLoS One. 7, (2012).
  54. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48, 983-1001 (2010).
  55. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radic Res. 44, 587-604 (2010).
  56. Karlsson, M., Kurz, T., Brunk, U. T., Nilsson, S. E., Frennesson, C. I. What does the commonly used DCF test for oxidative stress really show. Biochem J. 428, 183-190 (2010).
  57. Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
  58. Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxid Redox Signal. 8, 354-361 (2006).
  59. Yoo, S. K., Starnes, T. W., Deng, Q., Huttenlocher, A. Lyn is a redox sensor that mediates leukocyte wound attraction in vivo. Nature. 480, 109-112 (2011).
  60. Uusitalo, L. M., Hempel, N. Recent Advances in Intracellular and In Vivo ROS Sensing: Focus on Nanoparticle and Nanotube Applications. Int J Mol Sci. 13, 10660-10679 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imsel BiyolojiSay 89Br rerioZebra bal embriyolarendotelyal h crelerredoks durum analizioksidatif stres alg lamaIn vivo ROS l mleriFACS fluoresan ile etkin hale h cre s ralay cmolek ler problar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır