Les dosages biochimiques pour l'analyse des activités de l'ATP-dépendant remodelage de la chromatine enzymes

Résumé

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

Résumé

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Introduction

SNF2 complexes chromatine de la famille de remodelage comprennent une sous-unité ATPase central SNF2 comme ^1,2. Certaines fonctions des ATPases SNF2 comme les enzymes de sous-unités simples, tandis que d'autres fonctionnent comme la sous-unité catalytique de grands complexes multi-sous-unités. Élucider les mécanismes moléculaires par lesquels chacune des sous-unités de complexes de remodelage de la chromatine contribuent à leurs activités nécessite la capacité à effectuer des dosages biochimiques qui dissèquent le processus de remodelage.

ATP-dépendante des nucléosomes remodelage par le complexe INO80 humain et d'autres enzymes de remodelage de la chromatine peut être envisagé comme un processus en plusieurs étapes qui commence par la liaison du remodelage enzyme de nucléosomes, suivie de l'activation de son ADN et / ou des nucléosomes dépendante ATPase, la translocation de l'enzyme sur l'ADN nucléosomique remodelage, et éventuel repositionnement des nucléosomes ^1,2. La compréhension des détails moléculaires de l'ATP-dépendante processus de remodelage de la chromatine récessite dissection de la réaction de remodelage en ses différentes étapes de définition et des contributions des sous-unités individuelles du complexe de remodelage de chromatine à chaque étape de la réaction. Ces analyses nécessitent la capacité d'analyser le remodelage du nucléosome et autres activités utilisant des substrats moléculaires définies in vitro.

Dans un protocole de JOVE précédente, nous avons décrit les procédures utilisées pour générer des complexes et Subcomplexes de remodelage INO80 avec des compositions de sous-unités définies ^3. Ici, nous présentons trois dosages biochimiques qui permettent une analyse quantitative de la liaison, l'ADN et nucléosome activé ATPase, et les activités de remodelage du nucléosome associés à ces complexes nucléosome.

Protocole

1. dépendant de l'ATP nucléosome Rénovation Essais

Pour mesurer ATP-dépendant des activités de remodelage des nucléosomes, immunopurifié INO80 ou sous-complexes de INO80 sont incubées avec de l'ATP et un substrat de mononucleosomal, qui contient un seul nucléosome positionné à une extrémité d'un fragment d'ADN de 216 pb, marqué au ^32P. Les produits de réaction sont ensuite soumis à une électrophorèse dans des gels de poly-acrylamide natif.

1. Pour générer le P-marqué, «601» fragment ³² d'ADN, amplification de pGEM-3Z-601 ⁴ un fragment d'ADN de 216 pb contenant une 601 séquence de positionnement des nucléosomes d'extrémité positionnée, en utilisant les oligonucléotides 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG et 5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG que amorces sens et antisens.
   1. Mettre en place une réaction PCR de 100 pi, comme décrit dans le tableau 1.
   2. Effectuer les réactions PCR dans un thermocycleur en utilisant le programme suivant: 1 mn à 96 ° C, followed de 45 sec à 94 ° C, 30 sec à 57 ° C, 60 secondes à 72 ° C pendant 30 cycles; se terminant par 7 min à 72 ° C.
   3. Après la réaction de PCR est terminée, retirez les nucléotides non constituées en faisant passer les produits de la réaction deux fois à travers des colonnes de centrifugation sans nucléase.
   4. Exécuter 5 ul du produit de PCR purifié dans un gel d'agarose à 1,2% pour confirmer que la réaction PCR a généré l'~ fragment d'ADN de 216 pb désiré.
   5. Diluer 5 ul du produit de PCR purifié 20 fois, et de mesurer la concentration d'ADN en utilisant un spectrophotomètre UV. Le rendement moyen est d'environ 40 ng / ul.
   6. Mesurer la radioactivité de 1 ul du produit de PCR purifié dans un compteur à scintillation. Estimer l'efficacité de l'étiquetage en calculant le cpm / ng. On s'attend à une réaction de marquage succès pour obtenir ~ 15 000 cpm / ng de 601 fragment d'ADN.
2. Transfert de cellules Hela nucléosomes sur l'ADN marqué 601 en utilisant une méthode de dilution en série ^5.
   1. Mélanger 2 pmol deMarqué au ^32P 601 fragment d'ADN de 6 pg de nucléosomes Hela (préparé comme décrit ⁵⁾ dans 50 pl d'un tampon contenant 1,0 M de NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM, mM PMSF 0,1, et 1 mM DTT et incuber à 30 ° C pendant 30 min.
   2. Diluer le mélange séquentiel à 0,8 M, 0,6 M et 0,4 M de NaCl, par dilution avec 12,5 ul, 20,8 ul, et 41,6 pi, respectivement, de 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0), EDTA 1 mM, PMSF 0,1 mM, et DTT 1 mM, avec une incubation de 30 min à 30 ° C après chaque dilution.
   3. Diluer ensuite le mélange à 0,2 M puis de NaCl 0,1 M par addition de 125 ul et 250 ul du même tampon contenant 0,1% de Nonidet P-40, 20% de glycérol, et 200 pg / ml de BSA, avec une incubation de 30 min à 30 ° C entre les deux dilutions finales. Stocker le substrat mononucléosome à 4 ° C pendant 3 mois.
3. Réaliser des réactions de nucléosomes glissement dépendant de l'ATP dans un volume total de 10 pl. Le reacomposants ction sont répertoriés dans le tableau 2. Puisque la concentration de NaCl optimale pour l'activité des nucléosomes de remodelage INO80 est d'environ 50 mM de NaCl (résultats non publiés), ajuster la concentration totale de NaCl dans chaque réaction à 50 mM, en tenant compte de la quantité de NaCl contenue dans les préparations de l'enzyme et nucléosomes.
   1. Avant de commencer à mettre en place les tests, fonte des gels de poly-acrylamide natifs (18 x 16 cm). Pour préparer un gel contenant 5% d'acrylamide (acrylamide: bis-acrylamide à 37,5: 1), 0,5 x TBE (45 mM de Tris borate, 1 mM EDTA), 0,01% de persulfate d'ammonium (APS), et 0,001% de N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine (TEMED), mélanger les ingrédients énumérés dans le tableau 3. Laisser le gel polymériser pendant au moins 2 heures à température ambiante.
   2. Pendant ce temps, pour chaque réaction à effectuer, mélanger dans un tube de silicone de 1,5 ml pré-réfrigérés ~ 20 nM INO80 ou INO80 sous-complexe (préparé comme décrit ³⁾ avec une quantité de tampon EB100 ( Tableau 4) suffisante pour obtenir un volume de 4,75 ul. Immédiatement recongeler des fractions contenant de INO80-restant dans la glace sèche en poudre ou de l'azote liquide.
   3. Configuration d'un cocktail de maître avec le reste des ingrédients, mise à l'échelle par un facteur de 'X' (où X = nombre total de réactions 3). La quantité de chaque ingrédient nécessaire pour une seule réaction de 10 ul est listé dans le tableau 5; la recette doit être agrandi en fonction du nombre de réactions à effectuer. Mélangez bien en appuyant sur le tube ou par aspiration et refoulement avec un Pipetman et tourner le tube pendant quelques secondes dans une microcentrifugeuse de paillasse.
   4. Verser 5,25 pi du cocktail maître à chacun des tubes réactionnels mis en place à l'étape 1.3.2. Bien mélanger par pipetage de haut en bas. Démarrer la réaction en transférant des tubes de réaction dans un bain à 30 ° C-bloc de la chaleur ou de l'eau et incuber pendant 2 heures.
   5. Pendant ce temps, préparer «l'élimination mix 'cocktail contenant de l'ADN de concurrentet nucléosomes, mise à l'échelle par un facteur de X (X = nombre total de réactions + 4). La quantité de chacun des ingrédients nécessaires à la préparation de 1,5 ul de mélange pour retirer une seule réaction est listé dans le tableau 6; la recette doit être agrandi en fonction du nombre d'essais à effectuer.
   6. Terminer réactions en ajoutant 1,5 ul du mélange retirer. Mélangez bien, spin-down, et incuber à 30 ° C pendant encore 30 min.
   7. Pendant ce temps, pré-exécuter le gel de polyacrylamide natif dans une unité d'électrophorèse vertical à 100 V pendant 30 min à 4 ° C, à l'aide 0.5x TBE comme tampon avec une barre d'agitation magnétique à l'intérieur de la chambre inférieure pour maintenir la circulation de tampon constant.
   8. Pour charger l'échantillon, ajouter 2,5 pi de colorant de charge contenant 3x TBE, 30% de glycérol, 0,25% de bleu de bromophénol, et 0,25% Xylène Cyanol FF. Mélangez bien, centrifuger brièvement les échantillons, et les charger sur le gel à l'aide des conseils de chargement.
   9. Exécuter le gel à 200 V pendant 4,5 heures à 4 ° C avec une circulation d'un tampon.
   10. Pour détecter le signal, le gel à transférer un empilement de deux feuilles de papier filtre. Enroulez le papier filtre avec le gel sur le dessus, avec un collier en plastique transparent, puis l'exposer à un écran au phosphore de stockage à 4 ° C pendant le temps désiré.
   11. Balayer l'écran d'un système de scanner d'imagerie par isotope et analyser les données en utilisant un logiciel approprié.

2 mononucléosome essais de liaison

Pour doser l'affinité de liaison d'un complexe de INO80 donné pour mononucléosomes, effectuer un décalage de mobilité électrophorétique Assay (EMSA) en utilisant le substrat de mononucleosomal généré à l'étape 1.2.

1. Mettre en place la réaction mélanges pour les analyses de liaison comme décrit pour les essais de remodelage du nucléosome mais omettre l'ATP et la suppression mélange des réactions; incuber à 30 ° C pendant 30 min.
2. Ajouter 2,5 pi de colorant de charge à chaque mélange réactionnel, et l'appliquer à un gel de polyacrylamide natif contenant 3,5% d'acrylamide (acrylamide: bis 37,5: 1), 1% de glycérol, 0.5x TBE, 0,01% APS, et 0,001% TEMED.
3. Utilisation 0.5x TBE comme tampon, exécutez le gel à 200 V pendant 2,5 heures à 4 ° C avec circulation de tampon et exposer à un écran au phosphore de stockage.

3. ADN et Nucléosome dépendantes ATPase dosages

Réaliser des tests de ATPase dans des mélanges réactionnels 5 ul contenant 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 60 mM de NaCl, 6,6 mM de _MgCl2, mM EDTA 0,8, 0,015% de Nonidet P-40, 2,5% de glycerol, 0,1 mg / ml de BSA, 1 mM de DTT, 0,1 mM PMSF, 2 mM d'ATP, 2 pCi de [α- ³² P] ATP (3000 Ci / mmol). Pour chaque complexe INO80 ou la quantité de complexe INO80 à doser mis en place trois réactions parallèles, un tampon de EB100 contenant à mesurer l'ADN ou nucléosome indépendant ATPase, un contenant fermé ADN plasmidique circulaire (5000 pb, ~ 30 nM) pour mesurer l'ADN ATPase dépendante, et un contenant (~ 185 nM) de Hela pour mesurer nucléosome dépendant ATPase. Mettre en place toutes les réactions sur la glace.

1. Pour chaque réaction, combiner 10-50 nM des INO80 ou INO80 Subcomplexes immunopurifiés avec une quantité de tampon de EB100 suffisante pour obtenir un volume de 2,2 ul dans lubrifiés 1,5 ml microtubes pré-réfrigérés. Immédiatement recongeler des fractions contenant INO80-dans de la glace sèche en poudre ou de l'azote liquide.
2. Mettre en place un master cocktail. La quantité de chaque ingrédient nécessaire pour une seule réaction est listé dans le tableau 7. Grande échelle la recette par mise à l'échelle par un facteur de 3 (X + 2) 1, où X = le nombre de préparations de INO80 à doser.
3. Pour préparer le tampon contenant 'sous-cocktails seulement, ADN, ou nucléosomes, distribuent 2,5 (X + 2) ul du maître cocktail dans trois tubes séparés. Ajouter 0,3 (X + 2) ul soit EB100, l'ADN plasmidique circulaire fermé (1,5 ug / ul), ou (1,5 pg / la ul) de Hela et bien mélanger.
4. Distribuer 2,8 pi de la sous-cocktail approprié pour les tubes de réaction contenant des enzymes créé à Saint-ep 3.1. Pipette doucement monter et descendre à mélanger; éviter d'introduire des bulles.
5. Pour démarrer les réactions, transférer les tubes de réaction à un bloc C à la chaleur de 30 °.
6. Après 5, 15, 30, et 60 min d'incubation, repérer 0,5 ul de chaque mélange réactionnel sur une chromatographie cellulose polyéthylèneimine sur couche mince (CCM) plaque (20 x 10 cm), en ligne droite d'au moins 1,5 cm du bord inférieur . Remettre immédiatement les tubes de réaction pour le bloc C de chaleur de 30 ° de sorte que plusieurs points dans le temps peuvent être prises à partir d'un seul tube. Après avoir repéré, sécher les plaques de CCM en utilisant un sèche-cheveux.
7. Transférer les plaques de CCM à une chambre de verre contenant suffisamment de phosphate 0,375 M de potassium (pH 3,5) pour permettre aux bas de 0,5 cm de la plaque de CCM à être immergé dans la solution.
8. Couvrir la chambre, et développer jusqu'à ce que la face de la phase liquide atteint la partie supérieure des plaques de CCM. Immédiate sécher les plaques à fond en utilisant un sèche-cheveux.
9. Exposer les plaques de CCM séchées à un écran de phosphore de stockage à température ambiante.Balayez l'écran d'un système de scanner d'imagerie isotopique et de déterminer la quantité de substrat de l'ATP radioactif et le produit ADP.
10. Pour calculer la quantité d'ATP hydrolysé, multiplier la ATP% hydrolyse par la quantité d'ATP présente dans le mélange réactionnel de départ à l'aide de la formule suivante: pmol d'ATP hydrolysé = 10 pmol d'ATP à partir réaction x [ADP / ATP (+ ADP)]

Résultats

Les chiffres montrent des résultats représentatifs de tests biochimiques utilisés pour caractériser les activités de INO80, y compris nucléosome glissière (figure 1) et de liaison (Figure 2) des tests et des analyses d'ADN ou de l'ATPase nucléosome-dépendant (figure 3).

L'expérience a montré à la figure 1, on compare la capacité des complexes de INO80 intact purifié à travers FLAG-Ies2 ou FLAG-INO8...

Discussion

Afin de s'assurer que nucléosome remodelage et activités ATPase on observe dans des dosages dépendent de l'activité catalytique des complexes de INO80, et non sur contaminant rénovation et / ou d'enzymes ATPase, nous nucléosome régulièrement dosage remodelage et l'activité ATPase de versions catalytiquement inactives de complexes INO80, purifié dans parallèle avec le type sauvage INO80 utilisant la même procédure. Une réaction témoin négatif dépourvu ATP doit également être effectué l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	P8340
10x PCR reaction buffer	Roche Applied Science	11435094001
Roche Taq DNA Polymerase	Roche Applied Science	11435094001
NucAway Nuclease-free Spin Columns	Ambion	Cat. # AM10070
ultrapure ATP	USB/Affymetrix	77241 25 UM
bovine serum albumin	Sigma	A9418
N,N,N´,N´-tetramethylethylenediamine (TEMED)	Thermo Scientific	17919	Fisher Scientific
40% Acrylamide/Bis 37.5:1	Amresco	0254-500ML
Sonicated salmon sperm DNAs	GE Healthcare	27-4565-01
10% ammonium persulfate (APS)	Thermo Scientific	17874
benzonase	Novagen	Cat. No. 70664
[α-32P] ATP (3000 Ci/mmol)	PerkinElmer	BLU003H250UC
dCTP, [α-32P]- 6000Ci/mmol	PerkinElmer	BLU013Z250UC
Equipment	Company
PCR thermal cycler PTC 200	MJ Research	PTC 200
Hoefer vertical electrophoresis unit	Hoefer	SE600X-15-1.5
lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes	Costar	3207
Storage Phosphor Screen	Molecular Dynamics	63-0034-79
3MM filter paper	Whatman	28458-005	VWR
Typhoon PhosphorImager	GE Healthcare	8600
ImageQuant software	GE Healthcare	ver2003.02
TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F	Millipore	5725-7
Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4	Millipore	IPFL07810
General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe	Biodex	Model 14C