ATP依存性クロマチンリモデリング酵素の活性を分析するための生化学的アッセイ

要約

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

要約

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

概要

SNF2家族のクロマチンリモデリング複合体は、中央SNF2様ATPアーゼサブユニット^1,2を含む。単一のサブユニットの酵素など、一部SNF2様ATPアーゼ機能、他の人がより大きなマルチサブユニット複合体の触媒サブユニットとして機能している。クロマチンリモデリング複合体のサブユニットのそれぞれが自分の活動に貢献する分子メカニズムを解明することリモデリングプロセスを分析生化学的アッセイを行う能力が必要です。

人間INO80複合体および他のクロマチンリモデリング酵素によるATP依存ヌクレオソームのリモデリングは、その、DNAおよび/またはヌクレオソーム依存ATPaseの活性化に続いて、ヌクレオソームのリモデリング酵素の結合で始まる多段階のプロセスとして考えることができるヌクレオソームDNA上のリモデリング酵素の転座、およびヌクレオソーム^1,2の最終的な再配置。 ATP依存性クロマチンリモデリングプロセスrの分子の詳細を理解するその個別のステップや反応の各ステップにクロマチンリモデリング複合体の各サブユニットの寄与の定義にリモデリング反応の解剖をequires。このような分析は、 インビトロで規定された分子基質を用いてヌクレオソームのリモデリングおよび他の活動を分析する能力を必要とする。

以前JOVEプロトコルでは、定義されたサブユニット組成物³とINO80クロマチンリモデリング複合体とsubcomplexesを生成するために使用される手順を説明した。ここでは、3ヌクレオソーム結合、DNAおよびヌクレオソーム活性化ATPアーゼの定量分析を可能にする生化学的アッセイ、およびこのような複合体に関連したヌクレオソームのリモデリング活動を紹介します。

プロトコル

1 ATP依存性ヌクレオソームリフォームアッセイ

ATP依存性ヌクレオソームのリモデリング活性を測定するために、INO80またはINO80のsubcomplexesは、ATPおよび216塩基対^、32 P-標識DNA断片の一端に配置された単一のヌクレオソームが含まmononucleosomal基質と共にインキュベートされる免疫精製。反応生成物は、ネイティブポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に供される。

1. ³² P-標識された、「601」DNA断片を生成すること、などのオリゴヌクレオチド5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGGおよび5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAGを使用して、をpGEM-3Z-601 ⁴から末端に位置する601ヌクレオソームの位置配列を含む216 bpのDNA断片を増幅フォワードおよびリバースプライマー。
   1. 表1に記載したように100μlのPCR反応をセットアップします。
   2. 以下のプログラムを使用して、サーマルサイクラー中でPCR反応を実行します。1分96℃、followeで94°C、57°Cで30秒、30サイクル、72℃で60秒で45秒間によってD; 72℃で7分で終わる。
   3. PCR反応が完了した後、ヌクレアーゼフリースピンカラムを二度反応生成物を通過させることによって、取り込まれなかったヌクレオチドを​​除去する。
   4. PCR反応は、所望の〜216 bpのDNA断片を生成したことを確認するために、1.2％アガロースゲル中で精製されたPCR産物5μlを実行する。
   5. 精製したPCR産物5μlの20倍に希釈し、UV分光光度計を用いてDNA濃度を測定する。平均収量は約40 ngの/μlです。
   6. シンチレーションカウンターでの精製したPCR産物1μlの放射能を測定します。 CPM / NGを算出することにより、標識効率を推定します。成功した標識反応は、601 DNA断片の〜15000のcpm / ngのをもたらすことが期待される。
2. 連続希釈法^5を用いて標識601のDNA上にHeLa細胞ヌクレオソームを転送します。
   1. の2ピコモルを混ぜる1.0 MのNaCl、10 mMトリス塩酸、pH 8.0、1 mMのEDTA、0.1mMのPMSF、及び1mMを含有する緩衝液50μl中のHelaヌクレオソーム（後述⁵のように調製した）6μgの³² P-標識された601のDNA断片DTTおよび30分間30℃でインキュベートする。
   2. 順次10mMトリス塩酸（pH8.0）を12.5μlの20.8μlを、および41.6μlを、、、1mMのEDTA、0.1mMのPMSFで希釈して0.8 M、0.6 M、0.4 MのNaClの混合物を希釈し、そして1mMのDTT、各希釈後、30℃で30分間のインキュベーションである。
   3. さらに0.2 Mに混合物を希釈した後、0.1MのNaClを125μlに添加することによって、その後、0.1％のNonidet P-40、30分のインキュベーションで20％グリセロール、および200μg/ mlのBSAを含有する同じ緩衝液を250μl最後の二つの希釈液は30℃で。最大3ヶ月間4℃でモノヌクレオソーム基質を保管してください。
3. 総容量10μlでの反応をスライドATP依存性ヌクレオソームを実行します。レアINO80ヌクレオソームのリモデリング活性のための最適なNaCl濃度であるためctionコンポーネントは、〜50mMのNaCl（未発表の結果） 表2に記載されている、考慮中に含まれる食塩の量を考慮して、50 mMの各反応中のNaClの総濃度を調整するヌクレオソームと酵素の調製。
   1. アッセイをセットアップするために開始する前に、ネイティブのポリアクリルアミドゲル（18×16 cm）のキャスト。 5％のアクリルアミドを含む単一のゲルを調製するために（アクリルアミド：37.5ビスアクリルアミド：1）、0.5×TBE（45 mMトリス、ホウ酸、1mMのEDTA）、0.01％の過硫酸アンモニウム（APS）、および0.001％N、N、N'、 N'の -tetramethylethylenediamine（TEMED）、 表3に列挙した成分を混合する。ゲルは、室温で少なくとも2時間重合することができるようにします。
   2. EB100バッファの量がまた、各反応を実行するために、予備冷却シリコン処理1.5mlのマイクロチューブに組み合わせる〜20 nMのINO80またはINO80のサブコンプレックス^（3記載のように調製した）（ 十分表4）4.75μlの容量を得た。すぐに粉末ドライアイスや液体窒素中で残っているINO80含有画分を再凍結する。
   3. 'X'（ここで、X =反応3の合計数）倍にスケールアップ、食材の残りの部分とマスターカクテルを設定します。 1つの10μlの反応に必要な各成分の量を表5に記載されている。レシピは、実行される反応の数に応じてスケールアップされるべきである。チューブをタップして、またはピペッティングでよく混合し、ダウンピペットマンとし、卓上型微量数秒間チューブをスピン。
   4. ステップ1.3.2で設定反応管のそれぞれにマスターカクテルの5.25μLを分注する。ピペッティングでよく混ぜる。 30℃のヒートブロックまたはウォーターバスに反応管を転送することにより反応を開始し、2時間インキュベートする。
   5. 一方、競合DNAを含むカクテル」のミックスを削除する」の準備とX（X =反応+ 4の合計数）倍にスケールアップヌクレオソーム、。単一の反応用混合物を除去する1.5μlの準備に必要な各成分の量を表6に記載されている。レシピは、実行されるアッセイの数に応じてスケールアップされるべきである。
   6. 取り外しミックス1.5を添加することにより反応を終了します。よく混合し、スピンダウンし、そしてさらに30分間30℃でインキュベートする。
   7. 一方、定数バッファの循環を維持するために、下部チャンバー内の磁気攪拌棒をランニング緩衝液として0.5×TBEを使用して、4℃で30分間、100Vで垂直電気泳動装置におけるネイティブポリアクリルアミドゲルを予め実行します。
   8. サンプルをロードするには、3倍のTBE、30％グリセロール、0.25％ブロモフェノールブルー、0.25％キシレンシアノールFFを含むローディング色素の2.5μlを添加する。簡単にサンプルをスピン、よく混ぜ、ロードのヒントを使用してゲルにロードします。
   9. バッファーの循環で、4℃で4.5時間、200Vでゲルを実行します。
   10. 信号を検出するために、濾紙の二枚のスタックにゲルを移す。透明なプラスチックのラップを使用して、上にゲルをろ紙をラップしてから、所望の時間、4℃で貯蔵燐光体スクリーンに公開。
   11. 同位体イメージングスキャナシステムで画面をスキャンし、適切なソフトウェアを用いてデータを分析する。

2モノヌクレオソーム結合アッセイ

モノヌクレオソームの指定されたINO80複合体の結合親和性をアッセイするために、ステップ1.2で生成されたmononucleosomal基板を用いた電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を行う。

1. セットアップ反応はヌクレオソームのリモデリングアッセイのために説明したが、ATPを省略して、反応からミックスを削除するなどの結合アッセイのためのミックス。 30分間30℃でインキュベートする。
2. 各反応混合物にローディング色素の2.5μlを加えて、3.5％のアクリルアミド（アクリルアミドを含む未変性ポリアクリルアミドゲルに適用されます。3ビス7.5：1）、1％グリセロール、0.5×TBE、0.01％APS、および0.001％TEMED。
3. ランニング緩衝液として0.5×TBEを使用して、バッファの循環で、4℃で2.5時間、200Vでゲルを実行し、ストレージ蛍光スクリーンに公開。

3 DNA-とヌクレオソーム依存ATPアーゼアッセイ

20mMトリス塩酸（pH7.5）、60mMのNaClを、6.6のMgCl _2、0.8mMのEDTA、0.015％のNonidet P-40、2.5％グリセロール、0.1 mg / mlのBSA、1を含む5μlの反応混合物中でATPアーゼアッセイを行うのDTT、0.1mMのPMSF、2mMの^ATP、[α-32 P] ATP（3,000 Ciを/ミリモル）の2μCiの。 INO80複合体の各INO80複合体または量は、3つの並列反応、DNA-またはヌクレオソームに依存しないATPアーゼを測定するための1を含むEB100バッファー、測定するために閉環状プラスミドDNA（5000塩基対、約30 nM）を含有するものを設定してアッセイするために、DNA依存ATPアーゼ、およびヌクレオソーム依存ATPアーゼを測定するために、ヒーラオリゴヌクレオソーム（〜185 nM）を含有するもの。全ての反応は氷上でセットアップします。

1. 各反応について、予備冷却潤滑1.5mlのマイクロチューブに2.2μlの容量を与えるのに十分なEB100バッファーの量と免疫精製INO80またはINO80 subcomplexesの10-50 nMのを兼ね備えています。すぐに粉末ドライアイスや液体窒素の任意のINO80含有画分を再凍結する。
2. マスターカクテルを設定します。単一反応のために必要な各成分の量を表7にリストされている。XはINO80の準備の数がアッセイされる= 3（X + 2）1、倍にスケールアップすることによりレシピをスケールアップ。
3. 「サブカクテル」を含むバッファを準備するためにのみ、DNA、またはヌクレオソームは、3つの個別のチューブにマスターカクテルの2.5（X + 2）μLを分注する。 0.3どちらEB100の（X + 2）μlを、閉じた環状プラスミドDNA（1.5μgの/μl）を、またはヒーラオリゴヌクレオソーム（1.5μgの/μl）を加え、よく混ぜる。
4. STに設定された酵素を含む反応チューブに適切なサブカクテルの2.8μlを分注EP 3.1。穏やかにピペッティングしてミックスダウンする。気泡を導入することを避ける。
5. 反応を開始するには、30℃のヒートブロックに反応チューブを移す。
6. 5後に、15分、30分、インキュベーションの60分、1.5センチ以上の距離下端から直線セルロース、ポリエチレンイミン、薄層クロマトグラフィー（TLC）プレート（20×10cm）に上に各反応混合物0.5μlのスポット。直ちにので、複数の時間点は、単一のチューブから取り出すことができる30℃のヒートブロックに反応管を返す。スポッティングの後、ブロードライヤーを使用してTLCプレートを乾燥する。
7. TLCプレートの底0.5センチメートルを溶液中に浸漬されるように十分に0.375 Mリン酸カリウム（pHは3.5）を含有するガラスチャンバーにTLCプレートに移す。
8. チャンバを覆い、かつ、液相の前面がTLCプレートの最上部に達するまで発達する。即時徹底的にブロードライヤーを使用して、プレートを乾燥させる。
9. RTで貯蔵燐光体スクリーンになるまで乾燥したTLCプレートを公開します。同位体イメージングスキャナシステムで画面をスキャンし、放射性のATP基質とADP生成物の量を決定する。
10. 加水分解されたATPの量を計算するには、次の式を使用して、出発反応混合物中に存在するATPの量により加水分解％のATPを掛け：ピコモルATP加水分解= 10ピコモルATPを反応xを開始する際に、[ADP /（ATP + ADP）]

結果

図面は、ヌクレオソームスライド（ 図1）との結合（ 図2）アッセイおよびDNA-またはヌクレオソーム依存性ATPアーゼアッセイ（ 図3）を含むINO80活動を特徴付けるために使用される生化学アッセイの代表的結果を示す。

図1に示されている実験は、完全なINO80複合体の能力は、FLAG-Ies2またはFLAG-INO80Eを通して精製し、INO80が2...

ディスカッション

確実にするために私たちはアッセイで観察することがヌクレオソームのリモデリングおよびATPアーゼ活性はINO80複合体の触媒活性にではなく、中で精製INO80複合体の触媒的に不活性なバージョンの改造を汚染し、および/またはATPアーゼの酵素、私たちは日常的にアッセイヌクレオソームのリモデリングとATPase活性に依存同じ手順を使用して、野生型INO80と平行である。 INO80複合体またはsubcomple...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	P8340
10x PCR reaction buffer	Roche Applied Science	11435094001
Roche Taq DNA Polymerase	Roche Applied Science	11435094001
NucAway Nuclease-free Spin Columns	Ambion	Cat. # AM10070
ultrapure ATP	USB/Affymetrix	77241 25 UM
bovine serum albumin	Sigma	A9418
N,N,N´,N´-tetramethylethylenediamine (TEMED)	Thermo Scientific	17919	Fisher Scientific
40% Acrylamide/Bis 37.5:1	Amresco	0254-500ML
Sonicated salmon sperm DNAs	GE Healthcare	27-4565-01
10% ammonium persulfate (APS)	Thermo Scientific	17874
benzonase	Novagen	Cat. No. 70664
[α-32P] ATP (3000 Ci/mmol)	PerkinElmer	BLU003H250UC
dCTP, [α-32P]- 6000Ci/mmol	PerkinElmer	BLU013Z250UC
Equipment	Company
PCR thermal cycler PTC 200	MJ Research	PTC 200
Hoefer vertical electrophoresis unit	Hoefer	SE600X-15-1.5
lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes	Costar	3207
Storage Phosphor Screen	Molecular Dynamics	63-0034-79
3MM filter paper	Whatman	28458-005	VWR
Typhoon PhosphorImager	GE Healthcare	8600
ImageQuant software	GE Healthcare	ver2003.02
TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F	Millipore	5725-7
Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4	Millipore	IPFL07810
General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe	Biodex	Model 14C