ATP에 의존 염색질 리모델링 효소의 활동을 분석하는 생화학 분석 실험

요약

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

초록

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

서문

SNF2 가족 염색질 리모델링 단지는 중앙 SNF2 같은 ATPase의 서브 유닛 ^{1, 2를} 포함한다. 단일 서브 유니트 효소와 같은 일부 SNF2 형상 ATPases 기능, 다른 큰 멀티 소단위 복합체 촉매 서브 유닛으로서 기능하는 동안. 리모델링 복합체가 그들의 활동에 기여 염색질의 서브 유니트 각각은 리모델링 과정을 해부 생화학 분석을 수행 할 수있는 능력을 필요로하는 분자 메커니즘을 해명.

인간 INO80 착물 및 기타 염색질 개조 효소에 의해 ATP 의존적 뉴 클레오 리모델링은 그 DNA- 및 / 또는 뉴 클레오 의존적 ATPase를 활성화 한 후, 뉴 클레오로 리모델링 효소의 결합을 시작하는 다단계 과정으로 구상 될 수있다 뉴 클레오 솜 DNA, 그리고 뉴 클레오 ^1,2의 최종 위치 조정에 리모델링 효소의 전위. ATP 의존적 크로 마틴 리모델링 프로세스 (R)의 분자 세부 사항을 이해반응의 각 단계에 크로 마틴 리모델링 복합체의 개별 서브 유닛의 기여의 리모델링의 각 단계에 대한 반응 및 정의의 절개를 equires. 이런 분석은 in vitro에서 정의 된 분자의 기판을 사용하여 뉴 클레오 리모델링 및 기타 활동을 분석 할 수있는 능력을 필요로한다.

이전 조브 프로토콜에서, 우리는 정의 서브 유닛 조성 ³ INO80 크로 마틴 리모델링 복합체 및 서브 콤플렉스를 생성하는 데 사용되는 절차를 설명했다. 여기서 우리는, DNA- 및 뉴 클레오-ATPase의 활성화, 이러한 복합체와 관련된 뉴 클레오 리모델링 활동을 결합 뉴 클레오의 정량 분석​​을 가능하게 세 가지 생화학 적 분석을 제시한다.

프로토콜

1 ATP에 의존하는 뉴 클레오 리모델링 분석 실험

뉴 클레오 리모델링 활동 ATP-의존성을 측정하기 위해, INO80를 immunopurified 또는 INO80의 서브 콤플렉스는 ATP와 216 bp의, ³² P-표지 된 DNA 단편의 일 단부에 위치하는 단일 뉴 클레오를 포함 mononucleosomal 기판과 함께 배양된다. 반응 생성물은 다음 네이티브 폴리 아크릴 아마이드 겔에서 전기 영동한다.

1. ³² P-표지 된 ', 601'DNA 단편을 생성하기에서 증폭을 pGEM-3Z-601 ⁴ 올리고 뉴클레오티드로서 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG 및 5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG을 사용하여 최종 위치 (601) 뉴 클레오 솜 위치 서열을 포함하는 216 염기쌍의 DNA 단편, 순방향 및 역방향 프라이머.
   1. 표 1에 기재된 바와 같이 100 ㎕의 PCR 반응을 설정한다.
   2. 다음 프로그램을 사용하여 서열 증폭기에서 PCR 반응을 수행하여 1 분을 96 ° C, followe에서94 ° C, 57 ° C, 30주기 동안 72 ° C에서 60 초에서 30 초에서 45 초만큼 D; 72 ° C에서 7 분으로 끝나는.
   3. PCR 반응이 완료되면, 클레아없는 스핀 컬럼을 통해 회 반응 생성물을 통과하여 통합되지 않은 뉴클레오타이드를 제거한다.
   4. PCR 반응은 원하는 ~ 216 염기쌍의 DNA 단편을 생성 된 것을 확인하는 1.2 % 아가 로즈 겔에서 정제 된 PCR 산물의 5 μL를 실행.
   5. 정제 된 PCR 생성물 20 배량의 5 μL 희석하고 UV 분광 광도계를 이용하여 DNA 농도를 측정한다. 평균 수율은 ~ 40 NG / μL이다.
   6. 섬광 계수기에서 정제 된 PCR 생성물의 1 μL의 방사능을 측정한다. 노출 당 비용 (CPM) / NG를 계산하여 라벨 효율을 추정한다. 성공적인 라벨링 반응물을 601 DNA 단편 ~ 15,000 CPM / NG을 수득 할 것으로 예상된다.
2. 용액을 희석 방법 ^5를 사용하여 표시 601 DNA에 헬라 세포 뉴 클레오을 전송합니다.
   1. 2 pmol의 혼합³² P-표지 된 601 DNA 단편 헬라 뉴 클레오 6 μg 1.0 M의 NaCl, 10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0, 1 mM의 EDTA, 0.1 mM의 PMSF 및 1 ㎜를 포함하는 완충액 50 μL에 (같이 제조 ⁵ 참조) DTT와 30 분 동안 30 ° C에서 배양한다.
   2. 순차적 0.8 M, 0.6 M로 혼합물을 희석하고, 10 mM Tris-HCl (pH8.0)을, 1 mM의 EDTA, 0.1 mM의 PMSF의 각각 12.5 μL, 20.8 μL, 41.6 μL, 희석 0.4 M의 NaCl, 및 1 mM의 DTT, 각 희석 한 후 30 ° C에서 30 분 배양과 함께.
   3. 또한 30 분 동안 배양하여 다음 0.1 % Nonidet P-40, 20 % 글리세롤, 및 200 μg / ㎖ BSA를 함유하는 동일한 완충액 250 μL을 125 μL 첨가함으로써, 0.1 M의 NaCl로 한 다음 0.2 M 및로 혼합물을 희석 마지막이 희석 사이에 30 ° C에서. 최대 3 개월 동안 4 ° C에서 mononucleosome 기판을 저장합니다.
3. 10 μL의 총 부피에 ATP에 의존하는 뉴 클레오 슬라이딩 반응을 수행합니다. 정말이에요INO80 뉴 클레오 리모델링 활성을위한 최적의 NaCl 농도이기 때문에 ction의 구성 요소. 표 2에 나와있는 것은 ~ 50 mM의 염화나트륨 (미발표 결과), 고려에 함유 된 염화나트륨의 양을 가지고, 50 mm의 각 반응에서의 NaCl의 총 농도를 조정 뉴 클레오 효소의 준비.
   1. 분석을 설정하기 시작하기 전에 기본 폴리 아크릴 아마이드 젤 (18 X 16cm)를 캐스팅. 5 %의 아크릴 아미드를 함유 한 겔을 제조 (아크릴 아미드 : 37.5 비스 아크릴 아미드 : 1), 0.5의 TBE (45 mM 트리스 보레이트, 1 mM의 EDTA), 0.01 %과 황산 암모늄 (APS), 및 0.001 % N, N, N', N'의 -tetramethylethylenediamine (TEMED는). 표 3에 나와있는 재료를 혼합 겔을 실온에서 적어도 2 시간 동안 중합하도록 허용합니다.
   2. 각각의 반응을 수행하는 한편, 프리 실리콘이 냉장 된 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 ~ 20 nM의 INO80 또는 INO80의 subcomplex에 결합 (EB100 버퍼의 양 (같이 제조 ³ 참조) 충분한 표 4) 4.75 μL의 부피를 수득 하였다. 가루 즉시 드라이 아이스 또는 액체 질소에 남아 INO80 - 함유 분획을 다시 동결.
   3. 'X'의 요소에 의해 확장, 나머지 재료와 함께 마스터 칵테일을 설정합니다 (여기서 반응의 X = 총 세). 단일 10 μL 반응에 필요한 각 성분의 양은 표 5에 열거한다; 레시피가 수행되는 반응의 수에 따라 확장 할 것이다. Pipetman와 튜브를 눌러 또는 피펫 팅 의해 아래로 잘 섞어 벤치 탑의 microcentrifuge에 몇 초 동안 튜브를 회전.
   4. 단계 1.3.2에서 설정 반응 관 각각에 마스터 칵테일 5.25 μl를 분배. 로 pipetting 아래로 잘 섞는다. 30 ° C 열 블록 또는 물을 욕조에 반응 튜브를 전송하여 반응을 시작하고 2 시간 동안 배양한다.
   5. 한편, 경쟁 DNA를 포함하는 칵테일 '믹스를 제거하는'준비와 뉴 클레오는 X (반응 + 4 X = 총)의 요인에 의해 확장. 단일 반응 혼합물을 1.5 ㎕의 제거를 준비하기 위해 필요한 각 성분의 양을 표 6에 열거한다; 레시피가 수행되는 분석의 수에 따라 확장 할 것이다.
   6. 제거 믹스의 1.5 μl를 첨가하여 반응을 종료합니다. 잘 믹스 스핀 다운, 그리고 추가로 30 분 동안 30 ° C에서 배양.
   7. 한편, 일정한 버퍼 순환을 유지하기 위해 하부 챔버 내부의 자기 교반 막대 버퍼를 실행으로 0.5 배의 TBE를 사용하여, 4 ° C에서 30 분 동안 100 V에서 수직 전기 영동 장치의 기본 폴리 아크릴 아마이드 겔을 미리 실행합니다.
   8. 샘플을로드 배 TBE, 30 % 글리세롤, 0.25 % 브로 모 페놀 블루, 0.25 % 크실렌 Cyanol FF를 포함 로딩 염료의 2.5 μl를 추가합니다. 간단히 샘플을 회전, 잘 혼합, 및로드 정보를 사용하여 겔에로드합니다.
   9. 버퍼 순환 4 ° C에서 4.5 시간 동안 200 V에서 젤을 실행합니다.
   10. 신호를 검출하기 위해, 여과지의 두 시트의 스택 겔 옮긴다. 투명한 플라스틱 포장을 사용하여 상단에있는 겔 필터 종이 랩, 다음 원하는 시간 동안 4 ° C에서 저장 형광체 화면에 노출.
   11. 동위 원소 촬상 스캐너 시스템의 화면을 검색하고 적합한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다.

2 Mononucleosome 결합 분석

mononucleosomes위한 소정 INO80 복합체의 결합 친화도 분석법을 위해, 단계 120에서 생성 mononucleosomal 기판을 이용한 전기 영동 이동성 시프트 분석법 (EMSA)을 수행.

1. 반응은 뉴 클레오 리모델링 분석에 대해 설명하지만 반응에서 ATP 및 제거 믹스를 생략으로 분​​석을 바인딩 믹스 설정; 30 분 동안 30 ° C에서 배양한다.
2. 각 반응 혼합물에 로딩 염료의 2.5 μl를 추가하고, 3.5 %의 아크릴 아마이드 (아크릴 아미드가 포함 된 기본 폴리 아크릴 아마이드 겔에 적용 : 세 비스7.5 : 1), 1 % 글리세롤, 0.5 배의 TBE, 0.01 %의 APS 및 0.001 % TEMED.
3. 버퍼를 실행으로 0.5 배의 TBE를 사용하여 버퍼 순환 4 ° C에서 2.5 시간 동안 200 V에서 젤을 실행하고 저장 형광체 화면에 노출.

3 DNA- 및 뉴 클레오 의존 ATPase의 분석 실험

20 mM 트리스 - 염산 (pH를 7.5), 60 mM의 염화나트륨, 6.6 mM의 _MgCl2를, 0.8 mM의 EDTA, 0.015 % Nonidet P-40, 2.5 % 글리세롤, 0.1 ㎎ / ㎖ BSA, 1을 포함하는 5 ㎕의 반응 혼합물에 ATPase를 세이를 수행 mM의 DTT, 0.1 mM의 PMSF, 2 mM의 ATP [α- ³² P] ATP의 2 μCi (3000 CI / mmol)을 첨가 하였다. INO80 단지의 각 INO80의 복잡하거나 시간 동안 원형 플라스미드 DNA 측정 (5,000 bp의, ~ 30 nm의) 폐쇄 함유 DNA- 또는 뉴 클레오 독립적 ATPase의 하나를 측정하는 세 병렬 반응, 일 포함 EB100 버퍼를 설정 정량 할 DNA- 의존적 ATPase를, 및 뉴 클레오 의존적 ATPase를 측정하는 한 헬러 oligonucleosomes (~ 185 나노 미터)을 포함. 얼음에 모두 반응을 설정합니다.

1. 각 반응의 경우, 사전 냉장 윤활 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 2.2 μL의 볼륨을 제공하기에 충분 EB100 버퍼의 양 immunopurified INO80 또는 INO80 서브 콤플렉스의 10 ~ 50 nm의 결합. 가루 즉시 드라이 아이스 또는 액체 질소에있는 INO80 - 함유 분획을 다시 동결.
2. 마스터 칵테일을 설정합니다. 단일 반응에 필요한 각 성분의 양을 표 7에 표시됩니다. X는 = INO80 준비의 수를 정량 할 3 (X + 2) 하나의 요인에 의해 확장하여 조리법을 확장 할 수 있습니다.
3. '서브 칵테일'포함 버퍼를 준비하려면 만, DNA, 또는 뉴 클레오는 3 개의 별도의 튜브에 마스터 칵테일의 2.5 (X + 2) μl를 분배. 0.3 어느 EB100의 (X + 2) μL 폐쇄 원형 플라스미드 DNA (1.5 μg / μL), 또는 헬라 oligonucleosomes (1.5 μg / μL)을 넣고 잘 섞는다.
4. 성에서 설정 한 효소 함유 반응 튜브에 적절한 서브 칵테일의 2.8 μl를 분배EP 3.1. 부드럽게 섞어 아래로 피펫; 거품을 도입하지 마십시오.
5. , 반응을 시작하는 30 ° C 열 블록에 반응 튜브를 전송합니다.
6. 적어도 1.5 cm 떨어진 하단 가장자리로부터 직선 5, 15, 30, 및 인큐베이션 60 분 후, 셀룰로스 폴리에틸렌 박층 크로마토에 각각 반응 혼합물의 0.5 ㎕를 스팟 (TLC) 플레이트 (20 × 10cm) . 바로 그래서 여러 시점이 하나의 튜브에서 취할 수 있습니다 30 ° C 열 블록에 반응 튜브를 반환합니다. 스포팅 후, 타격 건조기를 사용하여 TLC 판을 건조.
7. TLC 플레이트의 하단은 0.5 cm 용액에 침지 될 수 있도록 충분히 0.375 M 인산 칼륨 (pH를 3.5)를 함유하는 유리 챔버 TLC 플레이트를 옮긴다.
8. 챔버를 포함하고, 액상의 전면 TLC 플레이트의 상단에 도달 할 때까지 개발한다. 즉시 철저하게 타격 건조기를 사용하여 판을 건조.
9. RT에서 저장 형광면에 건조 TLC 판을 노출.동위 원소 촬상 스캐너 시스템의 화면을 스캔 방사성 ATP와 ADP 기판 생성물의 양을 결정한다.
10. 가수 분해 ATP의 양을 계산하기 위하여, 다음과 같은 수식을 사용하여 개시, 반응 혼합물 중의 ATP 존재하는 양에 의해 가수 분해 %의 ATP를 곱 pmol의의 ATP 가수 분해 = 10 pmol의의 ATP를 반응 X 개시까지 [ADP / (ATP + ADP)]

결과

수치는 뉴 클레오 슬라이딩 (그림 1) 및 바인딩 (그림 2) 분석 및 DNA- 또는 뉴 클레오 의존 ATPase의 분석 (그림 3)을 포함 INO80 활동을 특성화하는 데 사용되는 생화학 적 분석의 대표적인 결과를 보여줍니다.

그림 1의 실험은 그대로 INO80 단지의 능력 FLAG-Ies2 또는 FLAG-INO80E을 통해 정제 INO80은 216 BP, 방사성 동위 원소 표지 된 DNA 단...

토론

, 그리고 리모델링 및 / 또는 ATPase의 효소 오염에 우리가 분석에서 관찰하는 뉴 클레오 리모델링 및 ATPase의 활동 INO80 복합체의 촉매 활성에 따라 보장하기 위해, 우리는 정기적으로 분석 뉴 클레오 리모델링 및 INO80 단지의 촉매 비활성 버전의 ATPase의 활동은 정제 야생형 INO80 동일한 절차를 사용하여 평행. INO80 착체 또는 서브 콤플렉스의 다른 제제의 액티비티를 비교하는 실험의 해석을 복잡하게...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	P8340
10x PCR reaction buffer	Roche Applied Science	11435094001
Roche Taq DNA Polymerase	Roche Applied Science	11435094001
NucAway Nuclease-free Spin Columns	Ambion	Cat. # AM10070
ultrapure ATP	USB/Affymetrix	77241 25 UM
bovine serum albumin	Sigma	A9418
40% Acrylamide/Bis 37.5:1	Amresco	0254-500ML
Sonicated salmon sperm DNAs	GE Healthcare	27-4565-01
10% ammonium persulfate (APS)	Thermo Scientific	17874
benzonase	Novagen	Cat. No. 70664
dCTP, [α-32P]- 6,000 Ci/mmol	PerkinElmer	BLU013Z250UC
PCR thermal cycler PTC 200	MJ Research	PTC 200
Hoefer vertical electrophoresis unit	Hoefer	SE600X-15-1.5
lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes	Costar	3207
Storage Phosphor Screen	Molecular Dynamics	63-0034-79
3MM filter paper	Whatman	28458-005	VWR
Typhoon PhosphorImager	GE Healthcare	8600
ImageQuant software	GE Healthcare	ver2003.02
TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F	Millipore	5725-7
Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4	Millipore	IPFL07810
General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe	Biodex	Model 14C