Microscopie intravitale imagerie du foie suivante<em&gt; Leishmania</em&gt; Infection: Une évaluation de l&#39;hémodynamique hépatiques

Résumé

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Résumé

Microscopie intravitale (IVM) est une technique d'imagerie optique puissant qui a rendu possible la visualisation, la surveillance et la quantification des différents événements biologiques en temps réel et dans les animaux vivants. Cette technologie a considérablement fait progresser notre compréhension des processus physiologiques et les phénomènes de micro-organismes pathogènes médiation dans les organes spécifiques.

Dans cette étude, IVM est appliquée sur le foie de la souris et les protocoles sont conçus pour l'image in vivo du système circulatoire du foie et mesurer des globules rouges (RBC) à vitesse vaisseaux hépatiques individuels. Pour visualiser les différents sous-types de navires qui caractérisent l'organe hépatique et effectuer des mesures de vitesse d'écoulement du sang, C57BL / 6 souris sont injectées par voie intraveineuse avec un réactif de plasma fluorescent qui marque le système vasculaire du foie associée. IVM permet in vivo, en temps réel, la mesure de la vitesse de RBC dans un récipient d'intérêt spécifique. L'établissement de cette méthode, il sera possible deenquêter sur l'hémodynamique du foie dans des conditions physiologiques et pathologiques. En fin de compte, cette méthodologie basée imagerie sera important pour l'étude de l'influence de L. infection donovani sur l'hémodynamique hépatiques.

Cette méthode peut être appliquée à d'autres modèles infectieuses et des organes de la souris et peut être étendu à une pré-clinique essais de l'effet d'un médicament sur l'inflammation par quantification de son effet sur le flux sanguin.

Introduction

Hémodynamique spécifiques d'organes sont des caractéristiques physiologiques importants de tout organe d'un mammifère. Des anomalies dans la circulation sanguine peuvent être la conséquence de l'inflammation et un signe de dysfonctionnement des organes ^1. Ainsi, le flux sanguin organisation, la structure et la fonction apparaissent paramètres critiques pour l'analyse dans des conditions physiologiques et pathologiques. Les techniques qui ont été couramment utilisés pour l'analyse de la circulation sanguine dans un organe spécifique contiennent plusieurs limitations, y compris la limite de résolution de la technique elle-même (par exemple, l'imagerie Doppler du flux sanguin), la capacité de mesure du absolu flux sanguin seulement (volume de sang par unité servant un organe) (par exemple tomographie par cohérence optique) et la mesure du taux de changement de vitesse dans une population nombreuse et hétérogène de vaisseaux sanguins ^2,3. Le système circulatoire du foie relie différents sous-types de navires qui sont hétérogènes dans leur taille, la structure et la fonction. Danscette étude, la microscopie intravitale (IVM) la technologie d'imagerie est appliquée pour évaluer l'hémodynamique du foie in vivo, en temps réel, à haute résolution et en parallèle pour découvrir les caractéristiques des vaisseaux sanguins individuels qui composent l'organe hépatique. Le développement récent de cette technique d'imagerie optique puissant permet au chercheur de collecter des données dynamique sur des animaux vivants à une résolution spatiale et temporelle. En permettant la visualisation directe et surveillance en temps réel des processus biologiques spécifiques et rapides in vivo, IVM offre une occasion unique pour le chercheur aux vaisseaux sanguins individuels d'image, et de mesurer et de quantifier la vitesse des globules rouges simples (RBC) dans un spécialement sélectionnés navire hépatique.

Dans cette étude, nous avons mis en œuvre la technique IVM dans le foie de souris pour étudier l'influence de l'infection de la souris par le parasite Leishmania hépatotrope sur l'hémodynamique du foie. L. donovaniest l'agent responsable de la leishmaniose viscérale, une maladie grave caractérisée par des réponses inflammatoires aiguës-on-chronique et une pathologie qui est présent dans de multiples organes, y compris la rate et le foie. Dans un modèle expérimental chez la souris de la leishmaniose viscérale, l'infection du foie est auto-résoudre alors que l'infection de la rate est progressive ^4. Ces résultats d'infection Leishmania à l'égard des organes individuels ne sont pas encore complètement compris. Enquête de foie et la rate hémodynamique dans des conditions pathologiques va apporter un nouvel éclairage sur les interactions hôte-parasite et la pathogenèse de la maladie.

Notre système de modèle expérimental est basé sur l'exposition et l'imagerie du foie d'une souris anesthésiée qui a reçu une injection intraveineuse de colorants fluorescents spécifiques pour l'étiquetage de la intravasculature hépatique. Le foie est un organe favorable pour la microscopie intra-vital. Après avoir effectué un petit incision dans l'abdomen, le foie est extériorisé doucement et placé sur de la gaze humide, puis sur une lamelle avec l'objectif de réduire les artefacts de mouvement en raison de rythme cardiaque et la respiration. Le foie est ensuite placé à l'intérieur de la vue d'un objectif de microscope. Par rapport au noeud de la rate et de la lymphe qui nécessitent l'utilisation de deux microscopie photonique pour les études IVM, l'avantage du foie réside dans son architecture 3D homogène / anatomie qui permet l'utilisation d'un microscope confocal classique, avec une profondeur de pénétration maximum de environ 50 um, par imagerie par microscopie intravitale ^5-8.

Cette étude décrit deux méthodes d'imagerie indépendantes pour la mesure quantitative de RBC vitesse et la vitesse du flux sanguin dans les vaisseaux sanguins individuels. Dans la première méthode, le débit sanguin hépatique est acquise en utilisant un mode bidimensionnel xy dans le temps. Les données de XYT en découlant sont analysés en utilisant le plugin MtrackJ dans le logiciel ImageJ libre, qui permet le suivi des individuel globules rouges dans le temps. Dans la seconde méthode, un seul vaisseau sanguin est sélectionné et son flux sanguin correspondant est analysée en utilisant le mode de balayage ligne de la confocal à balayage laser microscope acquisition rapide. Le navire d'intérêt est numérisé à haute fréquence le long de son axe central par le biais d'une ligne axiale. La vitesse d'écoulement du sang est ensuite quantifié sur la base de la différence de contraste entre les érythrocytes et le plasma sombres non marquées marqué par fluorescence. Les intensités de fluorescence des globules rouges et le plasma acquises le long de la ligne de balayage sont en fonction du temps pour obtenir des stries, dont les angles sont proportionnels aux vitesses d'un RBC individu.

Le but de cet article est de fournir une méthode simple et reproductible pour l'imagerie et mesure de la vitesse du flux sanguin dans les différents vaisseaux sanguins du foie et de mettre à disposition les outils de base pour l'exécution réussie de la chirurgie de la souris, l'IVM et des analyses quantitatives de la vitesse de globules rouges individuels. Tson approche permettra aux chercheurs d'acquérir de nouvelles connaissances dans la vitesse du sang dans des conditions pathologiques.

Protocole

Déclaration éthique: Toutes les études sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et protocoles qui ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université d'Aix-Marseille, France. Femme C57BL / 6 à 8 - 10 semaines d'âge ont été commercialement obtenue et traitée conformément aux règles du Décret N ° 87-848 8, le 19 Octobre 1987, Paris. Toutes les expériences utilisant L. parasites donovani LD1S ont été menées conformément à la réglementation en matière de biosécurité de la législation française et l'Union européenne.

1. Infection de souris avec L. donovani Promastigote parasites

1. Préparation du milieu de culture in vitro pour le maintien de L. donovani parasites promastigotes, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
   1. Utilisez milieu M199. Supplément milieu M199 avec 10% de sérum de veau foetal (inactivé par la chaleur à 56 ° C pendant 30 min), 25 mM HEPES pH 6,9, 12 mM NaHCO _3, 1 mM glutamine, 16,040 RPMI mélange de vitamines, l'acide folique 10 mM, 100 mM d'adénosine, 7,6 mM d'hémine, 50 U / ml de pénicilline et 50 mg / ml de streptomycine.
2. Culture LD1S parasites dans 10 ml de milieu complet M199 à 26 ° C dans un ballon de 25 cm ² ventilé.
3. Utilisation étapes de centrifugation différentielle successives, préparer une population de parasites promastigotes qui sont enrichies en formes métacycliques.
   1. Récolter une culture de phase parasite mi-journal. Comptez sur un hemocytomer. Remettre en suspension 5 x 10 ⁵ parasites / ml dans 10 ml de milieu complet M199. Cultiver la culture du parasite dans des conditions anaérobies jusqu'à ce qu'ils atteignent la phase stationnaire tardive (dans environ 5-6 jours).
   2. Faites tourner la culture LD1S à 1200 g pendant 10 min à 26 ° C pour sédimenter les parasites non-métacycliques, récupérer le surnageant et tourner de nouveau à 2500 g à 26 ° C pendant 10 min.
      Remarque: Ce culot final est fortement enrichie en parasites promastigotes métacycliques.
   3. Reprendre le culot dans 100 ul de PBS. Retirer une petite aliquote de fixation avec 25% de glutaraldéhyde 1/100 v: v et compter les parasites en utilisant un hémocytomètre.
4. Diluer la population de parasites enrichi en métacyclique à 1 x 10 ^7/100 ul dans du PBS. Injecter la suspension du parasite dans la veine de la queue d'une souris anesthésiée (voir ci-dessous) en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille de 30 G. Pour les animaux de contrôle, d'injecter 100 pi de PBS dans la veine de la queue.

2. Interventions chirurgicales

1. Désinfecter l'espace de travail avec un spray désinfectant biocide et tous les instruments chirurgicaux avec 70% d'éthanol pendant 30 min.
2. Préparer une solution anesthésique, en fonction du poids de l'animal, contenant 125 mg / kg de kétamine et 12,5 mg / kg de xylazine dilué dans du PBS.
3. Peser la souris et par voie intrapéritonéale injecter la dose appropriée d'anesthésique en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille 30 G.
4. Garder la souris chaude et vérifiez que la souris est complètement anestheacquisition amorti en pinçant le coussinet plantaire avant de poursuivre. Re-injecter une dose de moitié de la solution anesthésique chez la souris toutes les 60 min.
5. Raser l'abdomen de la souris et nettoyez-le avec Vetedine. Faire une petite incision dans la peau et la musculature sous la cage thoracique du côté gauche de l'abdomen.
6. Placez un morceau de gaze humide sur l'abdomen juste en dessous de la zone ouverte. Exposer le foie et le placer sur la gaze. Disposez un autre morceau de gaze humide du foie.
7. Placer un 24 x 60 mm ² à 150 um d'épaisseur lamelle, cyanoacrylate lié à une structure métallique, sur le foie pour la visualisation au microscope.
8. Protégez les yeux de la souris avec une gaze humide.
9. Après la session d'imagerie, euthanasier l'animal anesthésié par dislocation cervicale.

3. Microscopie intravitale imagerie du foie de l'Architecture

1. Effectuer les expériences de microscopie intravitale sur un microscope confocal inversé équipé d'auhermostatic contrôlée chambre, un 63X glycérol d'huile immersion objectif apochromatique (NA 1.4), Argon (488 nm) et HeNe (543 nm, 633 nm) et une diode laser bleu (405 nm).
2. Placez la souris sur la scène du microscope avec la lamelle couvrant le visage du foie vers le bas sur l'objectif. Réglez la température de la chambre à 29 ° C. Réglez la mise au point avec l'autofluorescence du foie pour permettre la visualisation des sinusoïdes.
3. Pour visualiser le système vasculaire, préparer une solution de 500 ug de BSA-Alexa 647 dilué dans 100 ul de PBS, pour chaque souris. Injecter cette solution par voie intraveineuse dans la veine caudale de la souris sous anesthésie en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille 30 G.
4. Pour visualiser les cellules des noyaux du foie, préparer une solution de Hoechst 33342 dans du PBS. Injecter cette solution à 8 mg / kg par voie intraperitoneale de souris en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille 30 G.
5. Utilisez le mode séquentiel normal, l'objectif à immersion 63X et le scanner à 400 Hz à l'image de la hépatiqueles noyaux des cellules et le système vasculaire du foie. Tournez sur la diode bleue 405 nm pour Hoechst excitation et le laser de 633 nm pour BSA-Alexa 647 excitation. Allumez le laser à argon 488 nm et de définir une large bande d'acquisition de visualiser l'autofluorescence du foie.

4. Microscopie intravitale imagerie du foie pour la mesure de vitesse de débit sanguin

1. Ouvrez le logiciel LAS du microscope (LAS-AF spectateur version 3.1.0 build 8587). Sélectionnez le mode de scanner à résonance lors de l'ouverture du logiciel de microscope.
2. Cliquez sur l'onglet de configuration pour définir le matériel. Cliquez sur le laser et sélectionnez le laser HeNe 633. Cliquez sur paramètres et sélectionner la résolution 12 bits.
3. Cliquez sur le menu d'acquisition. Dans la fenêtre des paramètres de la voie de faisceau, sélectionnez l'objectif 63X et mettre en place la puissance laser 633 à 100%. Activer le gain du signal et désactiver des paramètres de réglage en sélectionnant Alexa-633 dans le menu déroulant PM1-3.
4. Dans l'onglet acquérir, sélectionnez l'acquisition 'XYT'Mode. Réglez largeur du format au 1024 x 1024. Sélectionnez la vitesse à 8000 Hz. Sélectionnez le sténopé de 3 unités Airy. Sélectionnez un facteur de zoom de 3. Ne pas sélectionner le mode bidirectionnel.

5. Analyse quantitative de RBC vitesse en utilisant les XYT Images (Méthode 1)

1. Cliquez sur l'icône 'Live' pour visualiser le flux sanguin sur un mode direct. Choisissez la zone d'intérêt et sélectionnez un vaisseau sanguin spécifique pour analyse. Réglez le navire d'intérêt à la position horizontale en ajustant le 'X', 'Y' et de rotation de terrain coordonnées de numérisation sur le panneau de contrôle USB.
2. Arrêtez le mode «Live» une fois que le navire d'intérêt est fixé. Modifiez le format ensemble largeur 1024 x 256 en mode d'acquisition fenêtre, line average = 1, moyenne de cadre = 1 réglage, sélectionnez "piles" 150. Cliquez sur «start» pour acquérir des images.
3. Pour l'analyse quantitative de la vitesse RBC en utilisant les images "XYT" ouvrent le logiciel ImageJ. Sélectionnez le "Fichier"onglet dans ImageJ, cliquez sur «Ouvrir» puis choisissez le fichier d'intérêt.
4. Allez dans le menu "plugin" dans ImageJ, sélectionnez LOCI et bio-formats importer options. Dans cette fenêtre, sélectionnez la pile de visualisation des paramètres comme «HyperStack '. Dans l'option d'ordre de superposition, sélectionnez l'option: "xyzct". Note: Ceci ouvre une fenêtre avec toute la série d'acquisitions.
5. Cliquez sur "Plugins" dans le menu et sélectionner l'option ImageJ MTrackJ. Cliquez sur l'icône «add» sur la petite fenêtre et cliquez sur le RBC à suivre. Cliquez sur le même RBC dans chaque trame suivante et cliquez sur l'icône «mesure» pour mesurer la vitesse.
   Remarque: Le fichier généré peut être enregistré au format .EXL.
6. Suivre un minimum de cinq globules rouges par navire et d'analyser un minimum de trois navires individuels de la même taille.

6. Analyse quantitative de RBC vitesse en utilisant les xt images en ligne (Méthode 2)

1. Cliquez sur 'Live' pour visualiser le sang ffaible en mode direct. Choisir un vaisseau sanguin pour l'analyse spécifique. Réglez le navire d'intérêt en position horizontale. Arrêtez le mode «Live» une fois que le navire d'intérêt est fixé.
2. Sélectionnez le mode de balayage «xt» et mettre la lumière centrale du vaisseau sélectionné le long de la ligne de balayage. Set largeur du format à 1024 x 512, la vitesse = 8,000Hz, de ligne moyenne = 32, temps = 512. Cliquez sur «start» et d'acquérir les images de ligne de xt.
3. Générer des stries pour l'analyse quantitative de la vitesse RBC en ouvrant le fichier de .lif et ouvrir l'image de la ligne de xt d'intérêt. Dans le logiciel LAS-AF, sélectionnez "expériences", ouvrir le .lif et sélectionnez l'image. Remarque: Il ouvrira automatiquement une kymographe.
4. Mesurer le temps (t, obtenu sur l'axe Y) requis pour une série de particules (montrant une réflexion sombre) à parcourir une certaine distance (d, obtenu sur l'axe X) sur cette kymographe. Sélectionnez l'outil "tracer une ligne" et tracez une ligne horizontale à la série. Notez la distance enpm et le temps en secondes générée à la suite de l'onglet en bas de l'image.
5. Calculer la vitesse V = distance / temps en utilisant les valeurs obtenues à partir de la kymographe.
6. Quantifier un minimum de cinq particules stries image xt et par un minimum de trois navires individuels de la même taille.

Résultats

L'organisation architecturale spécifique des sinusoïdes du foie peut être visualisé basé sur la propriété autofluorescente de cet organe (Figure 1, panneau B et C, vert), l'injection intrapéritonéale de Hoechst pour l'étiquetage des hépatocytes noyaux (figure 1B, bleu) et l'injection intraveineuse de BSA fluorescent pour la coloration du système circulatoire hépatique (figure 1C, rouge). Le foie est composé de plusieurs sous-types différen...

Discussion

Le développement récent de la microscopie intravitale du foie de souris ouvre de nouvelles possibilités pour l'enquête de la réponse physiologique à l'infection in vivo et en temps réel ^5,9,10. La circulation sanguine d'organes est un paramètre physiologique critique qui est souvent altérée dans de nombreuses maladies. Toutefois, le statut de l'hémodynamique du foie dans des conditions physiologiques et infectieuses reste un domaine mal exploré. Dans cette étude, les mét...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
BSA-Alexa 647	lifetechnologies	A34785
Dextran-FITC 500 mol wt	SIGMA	46947
Ketamine	PanPharma	20434
Xylazine	Bayer	KP07KEU
Vetedine	Pharma Animal	6869029
Cyanoacrylate liquid	Cyanolit	5833300005
Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013	Molecular machines	50103
Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm	DiaPath	61061
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS-SP5
LAS-AF viewer	Leica software	Version 3.1.0 buid 8587