Intravitale Microscopia Imaging del Fegato seguente<em&gt; Leishmania</em&gt; Infezione: Valutazione della epatiche Emodinamica

Riepilogo

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Abstract

Microscopia intravitale (IVM) è un potente tecnica di imaging ottico che ha reso possibile la visualizzazione, il monitoraggio e la quantificazione di vari eventi biologici in tempo reale e di animali vivi. Questa tecnologia ha notevolmente avanzato la nostra comprensione dei processi fisiologici e fenomeni patogeni mediata in organi specifici.

In questo studio, IVM viene applicato al fegato mouse e protocolli sono progettati per immagini in vivo il sistema circolatorio del fegato e misurare globuli rossi (RBC) Velocità in singoli vasi epatici. Per visualizzare i diversi sottotipi dei vasi che caratterizzano l'organo epatica ed eseguire misure di velocità del flusso sanguigno, topi C57BL / 6 vengono iniettate per via endovenosa con un reagente fluorescente plasma che contrassegna la vascolarizzazione epatica associata. IVM consente in vivo, in tempo reale, la misurazione della velocità RBC in un recipiente specifico di interesse. Stabilire questa metodologia renderà possibileindagare l'emodinamica del fegato in condizioni fisiologiche e patologiche. In definitiva, questa metodologia di imaging basata sarà importante per studiare l'influenza di L. infezione donovani sull'emodinamica epatici.

Questo metodo può essere applicato ad altri modelli infettive e organi di topo e potrebbe essere estesa ai test preclinici di effetto di un farmaco su infiammazione quantificando il suo effetto sul flusso ematico.

Introduzione

Emodinamica organo-specifiche sono importanti caratteristiche fisiologiche di qualsiasi organo dei mammiferi. Anomalie nel flusso di sangue possono essere la conseguenza di infiammazione e un segno di disfunzione d'organo ^1. Così, il flusso di sangue organizzazione, la struttura e la funzione appaiono parametri critici per l'analisi in condizioni fisiologiche e patologiche. Le tecniche che sono comunemente impiegate per analizzare il flusso di sangue in un organo specifico contengono diverse limitazioni, tra cui il limite di risoluzione della tecnica stessa (es Doppler del flusso di sangue), la capacità di misurazione del flusso sanguigno assoluta solo (volume di sangue per unità che serve un organo) (ad esempio Optical Coherence Tomography) e la misurazione delle variazioni medie di velocità in un grande ed eterogenea popolazione di vasi sanguigni ^2,3. Il sistema circolatorio del fegato collega diversi sottotipi vaso eterogenee nella loro dimensioni, struttura e funzione. Inquesto studio, la microscopia intravitale (IVM) tecnologia di imaging è applicata per valutare l'emodinamica fegato in vivo, in tempo reale, ad alta risoluzione e in parallelo per scoprire le caratteristiche dei singoli vasi sanguigni che compongono l'organo epatica. Il recente sviluppo di questa potente tecnica di imaging ottico consente al ricercatore di raccogliere dati dinamici sugli animali che vivono ad una risoluzione spaziale e temporale elevata. Consentendo la visualizzazione diretta e il monitoraggio in tempo reale dei processi biologici specifici e rapidi in vivo, IVM offre un'opportunità unica al ricercatore di vasi sanguigni immagine individuale, e misurare e quantificare la velocità di singole cellule rosse del sangue (globuli rossi) all'interno di un appositamente selezionati nave epatica.

In questo studio, abbiamo implementato la tecnica IVM nel fegato mouse per studiare l'influenza di infezione del mouse da parte del parassita Leishmania epatotropico sull'emodinamica fegato. L. donovaniè l'agente responsabile leishmaniosi viscerale, una malattia grave caratterizzata da risposte infiammatorie acute-on-cronica e una patologia che è presente in diversi organi, compreso la milza e nel fegato. In un modello sperimentale murino di leishmaniosi viscerale, l'infezione del fegato è auto-risolvere, mentre l'infezione della milza è progressiva ^4. Questi risultati di infezione Leishmania rispetto ai singoli organi non sono ancora completamente compreso. Indagine su fegato e della milza emodinamica in condizioni patologiche getterà nuova luce sulle interazioni ospite-parassita e patogenesi della malattia.

Il nostro sistema di modello sperimentale si basa sull'esposizione di imaging e il fegato di un topo anestetizzato che ha ricevuto l'iniezione endovenosa di coloranti fluorescenti specifici per l'etichettatura del intravasculature epatica. Il fegato è un organo favorevole per la microscopia intra-vitale. Dopo aver eseguito un piccolo incision nell'addome, il fegato è delicatamente esternalizzato e collocato su una garza bagnata, poi su un vetrino con l'obiettivo di ridurre eventuali artefatti da movimento a causa di battito cardiaco e la respirazione. Il fegato è poi collocato all'interno della vista di una lente microscopio. Rispetto al nodo milza e linfa che richiedono l'uso di due fotoni microscopia per studi IVM, il vantaggio del fegato risiede nella sua architettura 3D omogeneo / anatomia che consente l'uso di un microscopio confocale convenzionale, con una profondità massima penetrazione circa 50 micron, per la microscopia intravitale immagini ^5-8.

Questo studio descrive due metodi di imaging indipendenti per la misurazione quantitativa di RBC velocità e la velocità del flusso sanguigno nei singoli vasi sanguigni. Nel primo metodo, flusso ematico del fegato viene eseguita utilizzando una modalità bi-dimensionale xy nel tempo. I dati XYT risultanti vengono analizzati utilizzando il plugin MtrackJ nel software ImageJ gratuito, che consente la tracciabilità dei individUAL globuli rossi nel corso del tempo. Nel secondo metodo, un singolo vaso sanguigno è selezionato e il corrispondente flusso di sangue viene analizzato tramite la scansione di riga modalità veloce acquisizione del microscopio confocale a scansione laser. Il vaso di interesse viene scansionato ad alta frequenza lungo il suo asse centrale attraverso una linea assiale. La velocità del flusso di sangue viene poi quantificato in base alla differenza di contrasto tra senza etichetta eritrociti scuro e plasma fluorescente. Le intensità di fluorescenza di eritrociti e plasma acquisiti lungo la linea di scansione vengono rilevate in tempo per ottenere striature, i cui angoli sono proporzionali alle velocità di un individuo RBC.

L'obiettivo di questo articolo è di fornire un metodo semplice e riproducibile per l'imaging e misurando la velocità del flusso di sangue all'interno dei singoli vasi sanguigni del fegato e di mettere a disposizione gli strumenti di base per l'esecuzione di successo di chirurgia mouse IVM e analisi quantitative della velocità di singoli globuli rossi. Til suo approccio permetterà ai ricercatori di acquisire nuovi elementi in velocità del sangue in condizioni patologiche.

Protocollo

Dichiarazione etica: Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e protocolli che sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato istituzionale del Aix-Marseille Université, Francia. Femminile C57Bl / 6 topi a 8-10 settimane di vita sono stati in commercio ottenuti e trattati secondo le regole di Décret N ° 8 87-848, 19 Ottobre, 1987, Parigi. Tutti gli esperimenti usando L. parassiti donovani LD1S sono state condotte in conformità alla normativa biosicurezza della legislazione francese e dell'Unione europea.

1. L'infezione Mouse con L. donovani promastigote Parassiti

1. Preparare il terreno di coltura per la manutenzione in vitro di L. donovani parassiti promastigote, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
   1. Utilizzare M199 media. Supplemento M199 mezzo con siero bovino fetale al 10% (calore-inattivati ​​a 56 ° C per 30 min),, 1 glu mM HEPES 25 mM pH 6.9, 12 mM NaHCO ₃tamine, RPMI 16040 miscela di vitamine, 10 mM di acido folico, adenosina 100 mM, emina 7,6 mM, 50 U / ml di penicillina e 50 mg / ml di streptomicina.
2. Culture LD1S parassiti in 10 ml di mezzo completo M199 a 26 ° C in un pallone ventilata a 25 ^cm2.
3. Utilizzando successive fasi di centrifugazione differenziale, preparare una popolazione di parassiti promastigote che si arricchiscono in forme metacyclic.
   1. Raccolto un mid-log cultura fase di parassita. Conta su un hemocytomer. Risospendere 5 x 10 ⁵ parassiti / ml in 10 ml di mezzo completo M199. Crescere la coltura parassita in condizioni anaerobiche fino a raggiungere la fase stazionaria tardiva (in circa 5-6 giorni).
   2. Spin cultura LD1S a 1.200 xg per 10 min a 26 ° C a pellet parassiti non metacyclic, recuperare il surnatante e girare nuovamente a 2500 xga 26 ° C per 10 min.
      Nota: Questo pellet finale è altamente arricchito nei parassiti promastigote metacyclic.
   3. Risospendere il pellet in 100 ml di PBS. Rimuovere una piccola aliquota per il fissaggio con il 25% glutaraldeide 1/100 v: v e contare i parassiti con un emocitometro.
4. Diluire la popolazione parassitaria arricchito-metacyclic a 1 x 10 ^7/100 ml in PBS. Iniettare la sospensione parassita nella vena della coda di un mouse anestetizzato (vedi sotto) usando una siringa da 1 ml con un ago 30 G. Per gli animali di controllo, iniettare 100 microlitri di PBS nella vena della coda.

2. Procedure chirurgiche

1. Disinfettare lo spazio di lavoro con uno spray disinfettante biocida e tutti gli strumenti chirurgici con il 70% di etanolo per 30 minuti.
2. Preparare una soluzione di anestetico, secondo il peso dell'animale, contenente 125 mg / kg di ketamina e 12,5 mg / kg di xilazina diluito in PBS.
3. Pesare il mouse e intraperitoneale iniettare la dose appropriata di anestetico utilizzando una siringa da 1 ml con un ago 30 G.
4. Tenere il mouse caldo e controllare che il mouse è completamente anestheammortizzato pizzicando il rilievo del piede prima di procedere. Re-iniettare una mezza dose della soluzione anestetico nel topo ogni 60 min.
5. Shave addome del mouse e pulirlo con Vetedine. Fai una piccola incisione nella pelle e la muscolatura sotto la gabbia toracica sul lato sinistro dell'addome.
6. Lay una garza umida sull'addome appena sotto l'area aperta. Esporre il fegato e posizionarlo sul garza. Posare un pezzo di garza umida del fegato.
7. Inserire un 24 x 60 mm ^{2 sino} a 150 micron di spessore coprioggetto, cianoacrilato-legato ad un telaio metallico, sul fegato per la visualizzazione al microscopio.
8. Proteggere gli occhi del mouse con una garza umida.
9. Dopo la sessione di imaging, eutanasia l'animale anestetizzato per dislocazione cervicale.

3. intravitale Microscopia Imaging del Fegato Architettura

1. Eseguire gli esperimenti di microscopia intravitale su un microscopio confocale invertito dotato dicontrollato hermostatic camera, un apocromatico 63X obiettivo glicerolo olio di immersione (NA 1,4), argon (488 nm) e HeNe (543 nm, 633 nm) di laser e di un diodo blu (405 nm).
2. Posizionare il mouse sul palco del microscopio con il vetrino che copre il volto di fegato in giù sull'obiettivo. Impostare la temperatura della camera a 29 ° C. Regolare il focus usando l'autofluorescenza di fegato per consentire la visualizzazione delle sinusoidi.
3. Per visualizzare la vascolarizzazione, preparare una soluzione di 500 mg BSA-Alexa 647 diluito in 100 ml di PBS, per ogni mouse. Iniettare la soluzione per via endovenosa nella vena della coda del topo anestetizzato utilizzando una siringa da 1 ml con un ago 30 G.
4. Per visualizzare i nuclei delle cellule del fegato, preparare una soluzione di Hoechst 33342 in PBS. Iniettare questa soluzione al 8 mg / kg di topo per via intraperitoneale con una siringa da 1 ml con un ago G 30.
5. Utilizzare la modalità sequenziale normale, l'obiettivo ad immersione 63X e lo scanner a 400 Hz per l'immagine del epaticanuclei delle cellule e la vascolarizzazione del fegato. Accendere il 405 nm diodo blu per Hoechst l'eccitazione e il laser 633 nm per BSA-Alexa 647 eccitazione. Accendere il nm laser Argon 488 e definire una larga fascia di acquisizione per visualizzare il autofluorescenza fegato.

4. intravitale Microscopia Imaging del Fegato del Sangue di velocità del flusso di misura

1. Aprire il software LAS del microscopio (LAS-AF spettatore Versione 3.1.0 costruire 8587). Selezionare la modalità scanner di risonanza quando si apre il software microscopio.
2. Fare clic sulla scheda di configurazione per impostare l'hardware. Clicca sul laser e selezionare il laser HeNe 633. Fare clic su Impostazioni e selezionare la risoluzione 12 bit.
3. Fare clic sul menu di acquisizione. Nella finestra delle impostazioni pathway fascio, selezionare l'obiettivo 63X e impostare la potenza del laser 633 al 100%. Attivare il guadagno del segnale e fuori parametri impostati selezionando Alexa-633 dal menu PM1-3 discesa.
4. Nella scheda acquisiscono, selezionare l'acquisizione 'XYT'modalità. Impostare la larghezza formato a 1.024 x 1.024. Selezionare la velocità a 8.000 Hz. Selezionare il foro stenopeico di 3 unità Airy. Selezionare un fattore di zoom pari a 3. Non selezionare la modalità bidirezionale.

5. Analisi quantitativa di RBC Velocity Utilizzando le XYT Immagini (Metodo 1)

1. Clicca sull'icona 'Live' di visualizzare il flusso di sangue in una modalità live. Scegliere l'area di interesse e selezionare un vaso sanguigno specifico per l'analisi. Impostare il vaso di interesse in posizione orizzontale, regolando la 'X', 'Y' e scansione di rotazione campo coordinate sul pannello di controllo USB.
2. Arrestare la modalità 'live' una volta che la nave di interesse è fissato. Cambiare il set larghezza formato 1.024 x 256 nella finestra, media riga = 1, fotogramma media = 1 Impostazione modalità di acquisizione, selezionare "stack" 150. Fare clic su 'Start' per acquisire le immagini.
3. Per l'analisi quantitativa della velocità RBC utilizzando le immagini "XYT" aprire il software ImageJ. Selezionare 'File'scheda in ImageJ, fare clic su "Apri" e poi scegliere il file di interesse.
4. Vai al menu "plugin" in ImageJ, selezionare Bio-formati LOCI e le opzioni di importazione. In questa finestra, selezionare lo stack di visualizzazione dei parametri come 'HyperStack'. Nell'opzione ordine pila, selezionare l'opzione: "xyzct". Nota: Si apre una finestra con tutte le serie di acquisizioni.
5. Clicca su 'Plugin' nel menu ImageJ e selezionare l'opzione MTrackJ. Clicca sull'icona 'add' sulla piccola finestra e fare clic sul RBC per tenere traccia. Clicca sulla stessa RBC in ogni fotogramma seguente e cliccare sull'icona 'misura' per misurare la velocità.
   Nota: Il file generato può essere salvato in formato .EXL.
6. Traccia di un minimo di cinque globuli rossi per nave e analizzare un minimo di tre recipienti individuali della stessa dimensione.

6. Analisi quantitativa di RBC Velocity Utilizzando le xt Linea Immagini (metodo 2)

1. Clicca su 'Live' di visualizzare il sangue fbasso in modalità live. Selezionare un vaso sanguigno specifico per l'analisi. Impostare il vaso di interesse in posizione orizzontale. Arrestare la modalità 'live' una volta che la nave di interesse è fissato.
2. Selezionare la modalità di scansione 'xt' e impostare il lume centrale della nave selezionata lungo la linea di scansione. Imposta larghezza formato a 1.024 x 512, velocità = 8,000Hz, linea di media = 32, tempo = 512. Fare clic su 'Start' e acquisire le immagini della linea xt.
3. Generare striature di analisi quantitativa della velocità RBC aprendo il file .lif e aprendo l'immagine linea xt di interesse. Nel software LAS-AF, selezionare "esperimenti", aprire il .lif e selezionare l'immagine. Nota: Si aprirà automaticamente una chimografo.
4. Misurare il tempo (t, ottenuto sull'asse Y) necessaria per una striatura particella (mostrando riflessione scuro) a percorrere una determinata distanza (d, ottenuto sull'asse X) su questa chimografo. Selezionate lo strumento "disegnare la linea" e tracciare una linea orizzontale per la striscia. Nota la distanza inmicron e il tempo in secondi generati nella scheda risultati nella parte inferiore dell'immagine.
5. Calcola la velocità come V = distanza / tempo utilizzando i valori ottenuti dal chimografo.
6. Quantificare un minimo di cinque particelle striature immagine xt e per un minimo di tre recipienti individuali della stessa dimensione.

Risultati

L'organizzazione architettonico specifico delle sinusoidi del fegato può essere visualizzato basa sulla proprietà autofluorescenti di questo organo (figura 1, pannello B e C, verde), l'iniezione intraperitoneale di Hoechst per l'etichettatura di epatociti nuclei (Figura 1B, blu) e l'iniezione endovenosa di BSA fluorescente per la colorazione del sistema circolatorio epatica (Figura 1C, rosso). Il fegato è composto da vari differenti sottotipi imbarcaz...

Discussione

Il recente sviluppo della microscopia intravitale del fegato del topo apre nuove possibilità per la ricerca di risposta fisiologica alle infezioni in vivo e in tempo reale ^5,9,10. Organo flusso di sangue è un parametro fisiologico fondamentale che viene spesso alterata in molte malattie. Tuttavia, lo stato di emodinamica del fegato in condizioni fisiologiche e infettive rimane una zona poco esplorata. In questo studio, metodi basati IVM, che in precedenza sono stati adattati per lo studio della mil...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
BSA-Alexa 647	lifetechnologies	A34785
Dextran-FITC 500 mol wt	SIGMA	46947
Ketamine	PanPharma	20434
Xylazine	Bayer	KP07KEU
Vetedine	Pharma Animal	6869029
Cyanoacrylate liquid	Cyanolit	5833300005
Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013	Molecular machines	50103
Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm	DiaPath	61061
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS-SP5
LAS-AF viewer	Leica software	Version 3.1.0 buid 8587