다음 간 생체 내에 현미경 이미징<em&gt; 슈만 편모충</em&gt; 감염 : 간 혈류의 평가

요약

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

초록

생체 내에 현미경 (IVM)을 실시간으로 라이브 동물의 다양한 생물학적 이벤트의 시각화, 모니터링 및 정량을 가능하게 한 강력한 광학 영상 기술이다. 이 기술은 크게 생리적 프로세스 및 특정 기관의 병원체 매개 현상에 대한 우리의 이해를 전진했다.

이 연구에서, IVM은 마우스 간인가하고, 프로토콜 설계 상으로 생체 내 간 순환계를 개별 용기 간 적혈구 (RBC)의 속도를 측정한다. 간 장기 특성을 다른 용기 아형을 시각화 및 혈액 유속 측정을 수행하기 위해 C57BL / 6 마​​우스에게 정맥 ​​내 간 - 관련 맥관 라벨 형광 플라즈마 시약으로 주입된다. IVM은 관심의 특정 용기 생체 실시간, RBC 속도의 측정에 가능하게한다. 이 방법을 설정하면하는 것이 가능하게됩니다생리적, 병리 적 조건에서 간 혈류 역학 조사. 궁극적으로,이 촬상 계 방법론 L.의 영향을 연구를 위해 중요한 것 간 혈류 역학에 donovani 감염.

이 방법은 다른 감염성 모델 마우스 기관에 적용될 수있다 또한 혈류에 미치는 영향을 정량함으로써 염증에 대한 약물의 효과의 임상 테스트를 미리하도록 확장 될 수있다.

서문

장기 별 혈역학는 포유류의 기관의 중요한 생리적 기능입니다. 혈액의 흐름에 이상이 염증의 결과 및 장기 부전 ^1의 표시 일 수있다. 따라서, 혈류 조직의 구조와 기능은 병리 생리 학적 조건 하에서 분석을위한 임계 파라미터로서 나타난다. 일반적으로 특정 기관에 혈액 흐름을 분석하기 위해 사용 된 기술은 기술 자체의 분해능 한계 등 여러 한계를 포함 (예를 들어 혈류 도플러 촬상) 당 혈액 만 (양의 절대 혈류 측정을위한 용량 기관) (예를 들어, 빛 간섭 단층 촬영)와 혈관 ^2,3의 크고 이질적인 인구에서 속도의 평균 변화의 측정을 제공하는 장치. 간의 순환 시스템은 크기, 구조와 기능에 이질적인 다른 선박의 하위 유형을 연결합니다. 에이 연구, 생체 내에 현미경 (IVM) 이미징 기술은 고해상도 실시간으로 생체 내 간 혈류 역학을 평가하기 위해 적용되고 평행 간 기관을 구성하는 개별 혈관의 특성을 밝히기 위해서. 이 강력한 광학 이미징 기술의 최근 발전은 연구자가 높은 공간 및 시간 해상도에서 살아있는 동물에서 동적 데이터를 수집 할 수있다. 직접적인 시각화 및 생체 내에서 특이적이고 신속한 생물학적 과정의 실시간 모니터링을 허용함으로써 IVM 이미지 개별 혈관 연구원 수있는 독특한 기회를 제공하고, 측정하고 특별히 선택된 내의 단일 적혈구의 속도 (RBC)를 정량화 간 선박.

본 연구에서 우리는 간에서 혈역학 hepatotropic 슈만 편모충 기생충에 의한 감염 마우스의 영향을 조사하기 위하여 마우스의 간에서 IVM 기법을 구현 하였다. L. donovani내장 리 슈만 편모충 증, 급성 온 만성 염증 반응을 특징으로하는 질환 및 중증 간 및 비장 등의 여러 기관에 존재하는 병변을 담당 에이전트이다. 내장 슈만 편모충 증의 실험 마우스 모델에서 간 감염 자체 해결 비장 감염 ⁴ 진보적 인 반면이다. 아직 완전히 이해되지 않은 개별 기관에 대하여 리 슈만 편모충 감염이 결과. 병적 인 상태에서 간 및 비장 혈역학의 조사는 호스트 기생충 상호 작용과 질병 발병 새롭게 조명한다.

우리의 실험 모델 시스템은 노광 및 간 intravasculature의 표지 특정 형광 염료의 정맥 주사를받은 마취 된 마우스의 간을 이미징에 기초한다. 간은 내 생명 현미경 유리한 기관이다. 작은 incisio을 수행 한 후n은 복부, 간은 부드럽게 외부화 된 후 심장 박동과 호흡으로 인해 어떤 모션 아티팩트를 감소시키는 것을 목표로 커버 슬립에 젖은 거즈에 배치합니다. 간 후, 현미경 렌즈의 시야 내에 배치된다. IVM 연구를위한 두 개의 광자 현미경의 사용을 필요로 비장과 림프절에 비해 간암의 이점은 최대 침투 깊이와, 종래의 공 초점 현미경의 사용을 허용 그 균질 3D 구조 / 해부학에 놓여 약 50 μm의, 생체 내에 현미경 영상 ^{5-8합니다.}

본 연구는 개개 혈관 RBC 속도와 혈류 속도의 정량적 측정을위한 두 개의 독립적 인 촬상 방법을 설명한다. 첫번째 방법에서, 간 혈류량은 시간 차원 XY 양방향 모드를 사용하여 획득된다. 그 결과 xyt 데이터는 individ의 추적을 허용 무료 ImageJ에 소프트웨어의 MtrackJ 플러그인을 사용하여 분석시간이 지남에 따라 연간 적혈구. 두번째 방법에서, 하나의 혈관이 선택되고, 그 대응하는 혈류는 공 초점 레이저 주사 현미경의 라인 주사 빠른 획득 모드를 사용하여 분석된다. 관심의 용기 축선을 통해 중심 축을 따라 높은 주파수에서 스캔됩니다. 혈액 유속이어서 표지 된 어두운 적혈구와 혈장 사이의 형광 표지 된 콘트라스트의 차이에 기초하여 정량화된다. 스캔 라인을 따라 얻은 적혈구와 혈장의 형광 강도가 줄무늬를 얻는 시간에 대해 도시되고, 각도가있는 개별 RBC의 속도에 비례한다.

이 문서의 목적은 간 개별 혈관 내 이미징을위한 간단하고 재현 가능한 방법 및 측정 혈류 속도를 제공하고, 마우스 수술, IVM 그리고 속도의 정량 분석​​의 성공적인 성능에 대한 기본적인 도구를 사용할 수 있도록하는 것이다 개별 적혈구. 티그의 접근 방식은 연구자가 병적 인 상태에서 혈액 속도에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다.

프로토콜

윤리 문 : 모든 동물 연구가 엑스 - 마르세유 Université, 프랑스의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 가이드 라인 및 프로토콜에 따라 수행되었다. 8에서 여성 C57BL / 6 마​​우스 - 오래된 10 주 상업적 Décret N ° 8 87-848 년 10 월 19 일 1987 년 파리의 규칙에 따라 획득 및 처리 하였다. L.를 사용하는 모든 실험 donovani LD1S 기생충은 프랑스와 유럽 연합 (EU) 법률에서 바이오 안전성 규정에 따라 실시 하였다.

L. 1. 마우스 감염 donovani Promastigote 기생충

1. L.의 유지 보수를 위해 시험 관내 배양 배지를 준비 donovani의 promastigote 기생충, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
   1. M199 매체를 사용합니다. (30 분 동안 56 ℃에서 열 - 불 활성화)를 10 % 소 태아 혈청 M199 배지를 보충하는 25mM HEPES pH가 6.9, 12 mM의 _NaHCO3를, 1 밀리미터 GLUtamine, RPMI 16,040 비타민 믹스, 10mM의 엽산, 100 mM의 아데노신, 7.6 mM의 헤민, 50 U / ㎖ 페니실린, 50 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신.
2. 문화는 25cm ² 통풍이 플라스크에 26 ° C에서 완전한 M199 배지 10ml에 기생충을 LD1S.
3. 연속 차동 원심 분리 단계를 사용하여, metacyclic 형태로 충실 promastigote 기생충의 인구를 준비합니다.
   1. 중반 로그 위상 기생충 문화를 수확. hemocytomer에 계산합니다. 완전한 M199 배지 10ml에 5 × ⁵ 기생충 / ㎖를 재현 탁. 그들은 (약 5-6일에서) 말 고정상에 도달 할 때까지 혐기성 조건에서 기생충 문화를 성장.
   2. 비 metacyclic 기생충 펠렛 뜨는을 복구하고 10 분 동안 26 ° C에서 2,500 XG에 다시 스핀 26 ° C에서 10 분 동안 1,200 XG에서 LD1S 문화를 스핀.
      참고 :이 최종 펠렛은 매우 metacyclic promastigote 기생충에 충실.
   3. 1의 펠렛을 재현 탁PBS의 00 μL. V 및 혈구를 사용하여 기생충을 계산 : 25 % 글루 타르 알데히드와 1/100 V를 고정을위한 작은 나누어지는을 제거합니다.
4. PBS에 1 × 10 ^{1백분의 7} μL로 농축-metacyclic 기생충 인구를 희석. 마취 된 쥐의 꼬리 정맥에 기생충 현탁액을 주사 30 G 바늘로 1 ML의 주사기를 사용하여 (아래 참조). 대조군의 경우, 꼬리 정맥에 100 ㎕의 PBS를 주입.

2. 외과 적 치료

1. 30 분 동안 70 % 에탄올로 살균 소독제 분무 작업 공간과 모든 수술기구를 소독.
2. 125 ㎎ / ㎏의 케타민 12.5 밀리그램 / PBS에 희석 kg 자일 라진을 함유하는, 동물의 중량에 따라 마취 용액을 준비한다.
3. 마우스를 달아 복강 30 G 바늘 1 ML의 주사기를 사용하여 마취의 적절한 투여 량을 주입.
4. 따뜻한 마우스를 유지하고 마우스가 완전히 anesthe 있는지 확인진행하기 전에 발 패드를 집어 HSV 공간. 60 분마다 마우스의 마취 용액 반 도즈를 재 주입.
5. 마우스의 복부를 면도하고 Vetedine로 청소. 복부의 왼쪽에있는 흉부 케이지 아래의 피부와 근육의 작은 절개를합니다.
6. 다만 열린 영역 아래 복부에 촉촉한 거즈 조각을 놓습니다. 간을 노출하고 거즈에 놓습니다. 간 위의 촉촉한 거즈의 다른 조각을 놓습니다.
7. 장소는 24 X 60mm ^2-150 μm의 두께 coverslip에, 시아 노 아크릴 레이트 결합 현미경 시각화를위한 간에, 금속 프레임에.
8. 젖은 거즈로 마우스의 눈을 보호합니다.
9. 촬상 세션 후, 경부 탈구에 의해 동물의 마취를 안락사.

간 아키텍처 3. 생체 내에 현미경 이미징

1. 에 장착 반전 촛점 현미경 생체 내에 현미경 실험을 수행hermostatic 실, 아포 크로매틱 63X 오일 글리세린 침지 목표 (NA 1.4), 아르곤 (488 ㎚)와 헬륨 네온 (543 nm의, 633 nm의) 레이저 및 청색 다이오드 (405 나노 미터)을 제어.
2. 목적에 간 얼굴을 덮고있는 커버 슬립과 현미경의 무대에 마우스를 놓습니다. 29 ° C까지 챔버의 온도를 설정합니다. 사인 곡선의 시각화를 허용하는 간 자기 형광을 사용하여 초점을 조절합니다.
3. 혈관을 시각화하기 위해 각 마우스 PBS 100 ㎕에 희석 500 μg의 BSA - 알렉사 647의 솔루션을 준비합니다. 30 G 바늘을 1 mL를 주사기를 사용하여 마취시킨 쥐의 꼬리 정맥에 정맥 내 용액을 주입한다.
4. 간세포 핵을 시각화하기 위해 PBS에 훽스트 33342의 용액을 제조 하였다. 복강 30 G 바늘 1 ML의 주사기를 사용하여 마우스의 8 ㎎ / ㎏에서이 솔루션을 주입한다.
5. 이미지 간 400 Hz에서 일반 연속 모드, 63X 침지 객관적이고 스캐너를 사용하여세포 핵 및 간 혈관. 훽스트 여기에 대한 405 nm의 청색 다이오드와 BSA - 알렉사 647 여기의 633 nm의 레이저를 켭니다. 아르곤 488 nm의 레이저를 켜고 간자가 형광을 시각화하기 위해 대규모 인수 대역을 정의합니다.

혈류 속도 측정을위한 간 4. 생체 내에 현미경 이미징

1. 현미경 (LAS-AF 뷰어 버전 3.1.0 빌드 8587)의 LAS 소프트웨어를 엽니 다. 현미경 소프트웨어를 열 때 공진 스캐너 모드를 선택합니다.
2. 하드웨어를 설정하려면 구성 탭을 클릭합니다. 레이저를 클릭하고 헬륨 네온 레이저 (633)를 선택합니다. 설정을 클릭하고 12 비트 해상도를 선택합니다.
3. 취득 메뉴를 클릭합니다. 빔 경로 설정 창에서, 목적 63X를 선택하고 100 %로 633 레이저 파워를 설정합니다. 신호 이득과 PM1-3 드롭 다운 메뉴에서 알렉사-633을 선택하여 설정 매개 변수 오프를 활성화합니다.
4. 획득 탭에서 'xyt'인수를 선택모드. 1,024 X 1,024에서 설정 서식의 폭. 8,000 Hz에서 속도를 선택합니다. 3 에어리 단위의 핀홀을 선택합니다. 양방향 모드를 선택하지 마십시오 3의 줌 배율을 선택합니다.

RBC 속도 5. 정량 분석​​ xyt 이미지를 사용 (방법 1)

1. 라이브 모드에 혈액의 흐름을 시각화하는 '라이브'아이콘을 클릭합니다. 관심 영역을 선택하고 분석을 위해 특정 혈관을 선택한다. USB 제어판 'X', 'Y'및 스캔 필드 회전 좌표를 조정하여 수평 위치에 관심 용기를 설정한다.
2. 관심 용기가 설정되면 '라이브'모드를 중지. 선택, 창, 선 평균 = 1, 프레임 평균 = 1을 설정 획득 모드에서 1,024 X 256 포맷 설정 폭을 변경 이미지를 얻기위한 '시작'에 150 클릭 "스택".
3. 사용 RBC 속도의 정량적 분석을위한 "xyt"이미지는 ImageJ에 소프트웨어를 엽니 다. '파일'을 선택ImageJ에있는 탭을 누른 다음 원하는 파일을 선택 "열기"를 클릭합니다.
4. ImageJ에있는 '플러그인'메뉴로 이동 궤적 및 바이오 형식 옵션을 가져 오기를 선택합니다. 이 창에서 'hyperstack'로 매개 변수를 볼 수 스택을 선택합니다. "xyzct"스택 순서 옵션에서 옵션을 선택합니다. 참고 :이 인수의 모든 일련의 창을 엽니 다.
5. ImageJ에 메뉴에서 '플러그인'을 클릭하고 MTrackJ 옵션을 선택합니다. 작은 창에 '추가'아이콘을 클릭하고 추적하기 위해 적혈구를 클릭합니다. 각각의 다음 프레임에서 같은 RBC 클릭하고 속도를 측정하는 '측정'아이콘을 클릭합니다.
   참고 : .exl 형식으로 저장할 수 있습니다 생성 된 파일을.
6. 용기 당 다섯 적혈구 최소 트랙과 동일한 크기의 세 개의 개개의 용기의 최소 분석.

XT 라인의 이미지를 사용하여 RBC 속도 6. 정량 분석​​ (방법 2)

1. 혈액 F를 시각화하기 위해 '라이브'를 클릭라이브 모드에서 낮은. 분석 용 특정 혈관을 선택한다. 수평 위치에 관심있는 용기를 설정합니다. 관심 용기가 설정되면 '라이브'모드를 중지.
2. 'XT'스캔 모드를 선택하고 라인 스캔 따라 선택된 선박의 중앙 루멘을 설정합니다. 설정 형식 폭 1024 X 512, 속도 = 8,000Hz, 라인 평균 = 32, '시작'과 XT 라인 이미지를 수집에 시간 = 512 클릭에서.
3. .lif 파일을 열고 관심있는 XT 라인 이미지를 열어 RBC 속도의 정량 분석​​을위한 줄무늬를 생성합니다. LAS-AF 소프트웨어에서, "실험"을 선택 .lif를 열고 이미지를 선택합니다. 참고 : 자동으로 kymograph을 엽니 다.
4. 이 kymograph에 (X 축 상 얻어진 D) 소정 거리를 이동하기 (어두운 반사 표시) 입자 연속 요구 (t, Y 축 상에 얻음) 시간을 측정한다. 도구 "선을 그립니다"하고 행진에 수평으로 선을 그릴을 선택합니다. 거리에 유의μm의 이미지 하단의 결과 탭 발생 시간 (초 단위).
5. kymograph에서 얻은 값을 사용하여 V = 거리 / 시간과 속도를 계산합니다.
6. XT 이미지 당 다섯 입자 줄무늬의 최소값과 동일한 크기의 세 개의 개개의 용기의 최소 정량화.

결과

간에서 정현파의 구체적인 건축 조직 시각이 기관 (도 1, 패널 B와 C, 녹색), 간세포 핵 라벨링 훽스트의 복강 내 주사의 autofluorescent 속성에 기초 할 수있다 (도 1B, 블루) 그리고 간 순환 시스템 (그림 1C, 적색)의 염색에 대한 형광 BSA의 정맥 주사. 직경 40-700 μm의 ² (D)에서 300 μm의 ² 이상 μm의 ^2, 대형 선박의 D 40 ~ 80 사이의 간은에 이르기?...

토론

마우스 간 생체 내에 현미경의 최근 발전은 생체 내에서 실시간으로 ^5,9,10 감염에 대한 생리적 반응의 조사에 대한 새로운 가능성을 엽니 다. 장기 혈액의 흐름은 종종 많은 질병에서 변경되는 중요한 생리적 파라미터이다. 그러나 생리 학적 감염성 조건 하에서 간 혈류의 상태를 제대로 탐구 영역 남아있다. 본 연구에서는 이전에 비장 및 종양 맥관 연구를위한 적응시켰다 IVM 기반 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
BSA-Alexa 647	lifetechnologies	A34785
Dextran-FITC 500 mol wt	SIGMA	46947
Ketamine	PanPharma	20434
Xylazine	Bayer	KP07KEU
Vetedine	Pharma Animal	6869029
Cyanoacrylate liquid	Cyanolit	5833300005
Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013	Molecular machines	50103
Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm	DiaPath	61061
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS-SP5
LAS-AF viewer	Leica software	Version 3.1.0 buid 8587