Génération de microparticules lymphocytaire et détection de leur effet pro-apoptotique sur les cellules épithéliales des voies aériennes

Résumé

Microparticules membranaires hangar cellulaires (PM) sont des vésicules biologiques actifs qui peuvent être isolés et leurs effets physiopathologiques étudiés dans différents modèles. Nous décrivons ici un procédé pour générer PM dérivées de lymphocytes T (PMT) et pour mettre en évidence leur effet pro-apoptotique sur les cellules epitheliales des voies respiratoires.

Résumé

L'intérêt pour les rôles biologiques des cellules vésicules membranaires dérivés dans la communication cellulaire a augmenté ces dernières années. Des microparticules (MP) sont un tel type de vésicules, de diamètre allant de 0,1 um à 1 um, et typiquement libéré de la membrane plasmique de cellules eucaryotes en cours de l'activation ou de l'apoptose. Nous décrivons ici la génération de microparticules de lymphocytes T dérivés (PMT) à partir de cellules T CEM apoptotiques stimulées par actinomycine D. PMT sont isolés par un processus de centrifugation différentielle en plusieurs étapes et caractérisé par cytométrie de flux. Ce protocole présente également un procédé de détection in situ de la mort cellulaire pour démontrer l'effet pro-apoptotique de PMT sur les cellules épithéliales bronchiques dérivés d'explants de souris primaires de tissus respiratoires bronchiques. Procédés décrits ici prévoient une procédure reproductible pour isoler des quantités abondantes de PMT à partir de lymphocytes apoptotiques in vitro. PMT dérivéde cette manière peut être utilisé pour évaluer les caractéristiques des différents modèles de maladies et de la pharmacologie et de tests de toxicologie. Étant donné que l'épithélium des voies aériennes offre une barrière de protection physique et fonctionnelle entre l'environnement externe et les tissus sous-jacents, l'utilisation d'explants de tissus bronchiques plutôt que des lignées de cellules epitheliales immortalisées fournit un modèle efficace pour les enquêtes qui nécessitent des tissus des voies respiratoires des voies.

Introduction

Microparticles (MPs) are biologically active submicron membrane vesicles released following cell activation or apoptosis. MPs are derived from both healthy and damaged cells and are implicated in many physiological and pathological processes.¹ MPs have been detected not only in human plasma, but also in inflammatory and apoptotic tissue. The biological utility of cell membrane–derived MPs has been demonstrated in various settings, including cell signalling models and as pharmacological tools.^2,3 We previously demonstrated that LMPs derived from T lymphocytes following actinomycin D stimulation (to induce apoptosis) suppress angiogenesis and inhibit endothelial cell survival and proliferation.^4,5 The antiangiogenic effects of LMPs may vary significantly depending on the stimuli used to activate T lymphocytes in vitro.⁶

The airway epithelium functions as a protective physical and functional barrier. Increased numbers of T lymphocytes in the airway can contribute to cell damage and airway inflammation.⁷ We have shown that LMPs induce apoptosis of human bronchial epithelial cells,⁸ which indicated LMPs may change barrier function of bronchial epithelium in vivo. Apoptotic cells can be identified using the TUNEL method, which detects in situ DNA fragmentation.

The overall goal of this protocol is to illustrate the in vitro production of LMPs from a T lymphocyte cell line, and to demonstrate their proapoptotic effect on airway epithelial cells. In situ cell death detection demonstrated that LMPs strongly induce airway bronchial epithelial cell death, suggesting that LMPs-mediated injury to the airway epithelium may impact barrier function of the damaged epithelium.

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Protocole

REMARQUE: Homme souris C57BL / 6 (ancienne 5-7 semaines) sont de Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Québec, Canada.) Et manipulés selon des protocoles approuvés par la Sainte-Justine Comité de protection des animaux CHU. Souris explants de tissus bronchiques constituent une bonne source de cellules épithéliales bronchiques primaires pour étudier les effets pro-apoptotiques de PMT sur les cellules épithéliales. Ce protocole décrit la génération in vitro de PMT, ainsi qu'un procédé de détection de l'apoptose des cellules épithéliales sur des explants de tissus bronchiques PMT-traités. Ce protocole se compose de trois sections.

1. PMT production et la caractérisation

NOTE: Pour éviter la contamination, veiller à ce que tous les matériaux utilisés dans cette expérience sont stériles ou autoclavés. Effectuez toutes les étapes à la température ambiante dans une enceinte de sécurité biologique dans des conditions stériles, sauf indication contraire.

1.1) Stimulation et Collection des députés⁹

1. Décongeler une aliquote de 10 millions de cellules T CEM C dans un bain d'eau à 37 °. Diluer à 10 ml préchauffé milieu hématopoïétique tels que X-VIVO, dans un tube stérile de 15 ml et centrifuger à 200 gx 5 min sans sérum. Aspirer les cellules surnageant et remettre en suspension dans 5 ml de milieu préchauffé.
2. des cellules de transfert dans un ballon de culture de tissu T75 (pour les cellules en suspension) à 15 ml de milieu hématopoïétique préchauffé tel que X-VIVO et incuber pendant 4 jours dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec 5% de CO _2.
3. Après 4 jours, transférer la totalité du milieu de culture et les cellules dans un flacon de culture de tissu T175 contenant 100 ml de milieu frais. Continuer l'incubation des cellules pendant environ 72 heures dans les mêmes conditions jusqu'à ce qu'ils aient atteint une densité de 2 millions de cellules / ml.
4. Cellules également réparti entre quatre flacons T175 contenant chacune 150 ml de milieu frais et continuer la culture de cellule jusqu'à ce que les cellules se sont développées (environ 48 heures d'incubation) à une densité de 2 millions / ml.
5. Rassembler les cellules provenant de chaque flacon par centrifugation à 200 xg pendant 5 min et remettre en suspension 300 x 10 ⁶ cellules dans un nouveau flacon T175 contenant 150 ml de milieu frais pour maintenir la densité de cellules de 2 millions / ml.
6. Ajouter actinomycine D (dissous dans du DMSO à 2 mg / ml) dans le milieu à une concentration finale de 0,5 ug / ml et incuber pendant 24 heures.
7. Transférer tout le milieu de culture dans 50 ml tubes coniques et centrifuger les cellules à 750 g pendant 5 min. Transférer le surnageant dans des tubes de 50 ml et centrifuger coniques à 1500 xg pendant 15 min pour éliminer les gros fragments de cellules.
8. Transférer le surnageant dans un flacon de 250 ml et par ultracentrifugation à 12 000 xg pendant 50 min. Jeter le surnageant et recueillir des pellets.
9. Pastilles de lavage PMT-PBS enrichi avec 40 ml stérile dans un tube de 50 ml par centrifugation à 12 000 xg pendant 50 min. Répéter deux fois cette étape.
10. Recueillir le dernier lavage surnageant; il sera utilisé en tant que contrôle du véhicule. Suspendre les pastilles dans une PMTml de PBS et de les transférer dans un microtube de 1,5 ml stérile. Aliquotes et stocker PMT isolés à -80 ° C (pour éviter de multiples cycles de libre-dégel).

1.2) Caractérisation des députés via Analyse FACS ⁴

1. Préparer deux échantillons de tampon annexine, une avec et l'autre sans _CaCl2: Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, plus ou moins 5 mM de _CaCl2.
2. Filtrer tampon de FACS et l'annexine fluide de gaine d'écoulement en utilisant un filtre de 0,22 um pour éliminer les particules.
3. Diluer 1 ul de LMP dans 44 ul de tampon d'annexine avec 5 mM de _CaCl2 dans un tube FACS. Préparer un autre tube avec 1 pl de PMT dans 44 pi de tampon annexine sans CaCl ₂ (contrôle négatif).
4. Ajouter 5 ul de AnnexinV-Cy5 dans chaque tube et bien mélanger. Incuber pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité. Arrêter la réaction en diluant le mélange avec 400 ul de liquide de gainage FACS d'écoulement dans chaque tube.
5. Ajouter 10 pi (200 000 perles) de 7 um comptage beasuspension ds comme étalon interne dans chaque tube pour obtenir une numération absolue.
6. Établir portes de taille relative (FSC-H, PMT E00, échelle logarithmique) et la granularité relative (SSC-H, PMT 325, échelle logarithmique) intrigue point sur le cytomètre en flux en utilisant des billes fluorescentes taille calibrée de 1 pm (porte 1) et compter perles porte à 7 pm (porte 2).
7. Analyser l'échantillon PMT sur FSC-H / SSC-H parcelle en utilisant les portes établies et FL-4 canaux pour annexine (PMT 765, échelle logarithmique) en points, en acquérant un signal jusqu'à 20 000 billes de comptage sont atteints dans la porte 2.
8. Déterminer les événements AnnexinV positifs de PMT dans un tampon annexine contenant _CaCl2, puis soustraire les événements de PMT dans un tampon de annexine sans CaCl ₂ (contrôle négatif).
9. Calculer le nombre absolu de députés sur la base de l'équation suivante:
   

1.3) Détermination de MP Protein Concentration (Bradford Assay)

1. 5 Préparer des dilutions en série d'un niveau de 1,25 à 20 ug / ml de protéine. Introduire à la pipette 800 ul de chaque solution étalon et de l'échantillon dans un tube à essai propre en double. Ajouter 200 ul de réactif de colorant de Bradford à chaque tube. Mélangez bien, puis incuber à température ambiante pendant 5 min.
2. Mesurer l'absorbance à 595 nm. Déterminer la concentration en protéine en utilisant le PMT de régression linéaire de la courbe standard.

2. explants de tissus bronchiques et traitement PMT

REMARQUE: Portez une attention particulière à l'environnement de travail stérile et aseptique préparer les solutions et moyen utilisés dans les expériences suivantes. Pour préparer la complète guérison moyen, ajouter 1 ml de guérison des tissus moyennes suppléments avec du sérum (décongelés sur de la glace) à 100 ml Tissue de guérison moyen et bien mélanger.

2.1) Préparation des explants de tissus bronchiques

1. Avant culture, rayer six zones de 1 cm ²chacune sur le bord de la surface de chaque boîte de culture tissulaire de 100 mm avec une lame de scalpel. Enrober chaque rayé 100 tissu mm boîte de culture avec 2 ml de la solution de revêtement de boîte de culture, et incuber le plat dans un incubateur à _CO2 humidifié O / N à 37 ° C. Vide aspirer la solution excédentaire et remplir la cuve avec 15 ml de laver des tissus moyen.
2. Euthanasier souris C57BL / 6 (5 à 7 semaines) par inhalation de CO ₂ selon des protocoles approuvés par le comité d'éthique de soins aux animaux.
3. Aseptique disséquer le tissu pulmonaire avec scalpel, Dumont super fine pince à épiler et des ciseaux chirurgicaux. Retirez délicatement parenchyme et les vaisseaux sanguins. Placez le tissu pulmonaire dans glacée tissus laver moyen pour le transport au laboratoire, le cas échéant.
4. Disséquer outre bronche immergé dans le lavage des tissus à moyen et séparer les bronches d'un diamètre de 1 à 2,5 mm à partir de tissus pulmonaires périphériques. Trancher les tissus bronchiques dans ~ 5 mm d'épaisseur anneaux bronchiques avec un scalpel.
5. Utilisez un mouvement d'écopage avec la pince de microdissecting courbes stériles pour ramasser les fragments bronchiques et placez-les sur les zones rayées de la vaisselle.
6. Retirez le laver de tissus moyen, et incuber les fragments à température ambiante pendant ~ 5 min pour leur permettre de respecter les plats.
7. Ajouter 10 ml de complète guérison moyenne à chaque plat et les placer dans une chambre de l'incubateur modulaire atmosphère contrôlée. Rincer la chambre de mélange de gaz O ₂ élevé (70% de O _2, 25% de N ₂ et 5% CO _2). Placez la chambre dans un incubateur orbital de paillasse et le secouer à 37 ° C. Secouez la chambre pendant 24 heures à 10 cycles par minute pour permettre le support de circuler de façon intermittente au cours des fragments.
8. Après 24 heures d'incubation, observer les explants de tissus sous un microscope optique à contraste de phase inversée. Sélectionnez explants bronchiques avec complète, le mouvement de poils fins et de l'épithélium bronchique animée pour le traitement PMT ultérieure.

2.2) Traitement PMT

1. Préparer un milieu de croissance complet comme suit: moyennes suppléments de croissance de dégel avec un inhibiteur de sérum de fibroblastes et sur la glace. Ajouter 1 ml de milieu de culture avec des suppléments de sérum et 200 ul d'inhibiteur de fibroblastes à 100 ml de milieu de croissance; bien mélanger. Chauffer le milieu de croissance complet à 37 ° C pendant 10 min avant utilisation.
2. Diluer PMT isolés dans un nouveau tube Eppendorf stérile avec PBS pour préparer un stock PMT à une concentration de 800 pg / ml.
3. Ajouter 0,5 ml de la croissance complète moyenne à chaque puits d'une plaque de culture de tissu à 12 puits.
4. Transférez les explants bronchiques sélectionnés avec la pince de microdissecting courbes du protocole précédent (section 2.1) à chaque puits de la plaque de culture de tissu.
5. Étiqueter la plaque de culture appropriée pour identifier PMT puits de traitement et des puits de contrôle. Ajouter 25 ul PMT bouillon dans chaque traitement PMT bien (pour une concentration finale de 40 pg / ml) et 25 véhicules de contrôle de pi (voir LMP s production) dans les puits de contrôle.
6. Poursuivre l'incubation dans une chambre de l'incubateur modulaire à atmosphère contrôlée à 37 ° C sous agitation douce.
7. Après 24 h, laver explants 3 fois avec du PBS et procéder à la (fixation du paraformaldéhyde 4% [PFA]) prochaine étape.

3. examen histopathologique

3.1) Préparer les solutions suivantes avant de procéder aux prochaines étapes

1. Préparer du tampon PBS 1x en mélangeant 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na ₂ HPO _4, 1,76 mM de KH ₂ PO ₄ à pH 7,4.
2. Pour préparer PFA 4%, dissoudre 20 g de PFA dans 400 ml d'eau, chauffé à 60 ° C sous agitation; ajouter quelques gouttes de NaOH 10 M pour effacer la solution. Ensuite, ajoutez tampon PBS 1x et ajuster le volume à 500 ml et le pH à 7,4. Filtre et aliquote; stocker à -20 ° C.
3. Préparer les réactifs de déshydratation ou après réhydratation; 100%, 90%, 70%, 50% d'éthanol et le xylene.

e_step "> 3.2) explantation fixation et de tissus Section Déparaffinage

1. Placer chaque explant dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml étiqueté avec 4% de PFA et incuber O / N à 4 ° C. Rincer les explants deux fois avec PBS 1x.
2. Déshydrater explants à travers une série d'alcool (70% d'éthanol: 3 fois 30 minutes chacun; 90% d'éthanol: 2 fois 30 minutes chacun; 100% d'éthanol: 3 fois 30 minutes chacun, puis xylène: 3 fois 20 min chacun). Effectuez toutes les étapes à la température ambiante dans une hotte.
3. Incruster des explants de tissu dans de la paraffine à 58 ° C dans un four. Préparer 5 um coupes de tissus épais en utilisant un microtome rotatif.
4. Flotter les sections C dans un bain d'eau de 56 °, puis monter les sections sur des lames histologiques marqués. Placer les lames dans le manuel racks de coloration et sèche à 65 ° C pendant 1 heure. Laisser les lames refroidir à température ambiante.
5. Tremper les racks à quatre plats de taches consécutifs contenant xylène pendant 10 min chacun pour enlever la paraffine. Tremper les racks d'une série de l'éthanol pour éliminer le xylène: 100%, puis 95%, efr 80%, puis 70%, puis 50% d'éthanol (5 min à chaque étape). Rincer les supports avec de l'eau du robinet pendant 5 min pour éliminer l'éthanol.

3.3) hématoxyline et de l'éosine (H & E) Coloration

1. Continuer à travailler avec les sections de tissus fixés; placez la grille dans un plat à coloration à l'hématoxyline de Mayer pendant 15 min. Rincez la grille avec de l'eau du robinet pour enlever hématoxyline pendant 20 min.
2. Placez-les dans de l'eau distillée pendant 30 sec.Place éthanol à 95% pendant 30 sec. Placer dans éosine Y plat solution de coloration pendant 1 min. Déshydrater par deux changements de 95% d'éthanol, éthanol à 100%, et le xylène pendant 2 minutes chacun.
3. Effectuez une vérification rapide sous un microscope pour se assurer que l'excès de l'éosine est retiré. Placez 2 à 3 gouttes de milieu de montage (Fisher SP15-100) sur chaque diapositive, puis couvrir avec un couvercle en verre.

3.4) In Situ mort cellulaire détection: TUNEL Assay

1. Avant de commencer, préparer une solution de travail de la proteinase K: 20 pg / ml dans10 mM de Tris / HCl, pH 7,4.
2. Répétez les étapes 1 à 5 de l'article 3.2 (fixation explantation et de tissus section déparaffinisation). Rincer les lames avec déminéralisée H ₂ O.
3. Plonger les lames avec 1x PBS pendant 10 min. Égoutter l'excès de PBS. Incuber les coupes de tissus pendant 30 minutes à température ambiante avec une solution de proteinase K de travail. Rincer les lames deux fois avec PBS 1x.
4. Effectuer l'essai TUNEL comme décrit dans le manuel d'utilisation du kit de détection de la mort cellulaire. Monter en utilisant un milieu de montage, et lamelle manuellement avec des lamelles de verre.
5. Analyser les échantillons sous un microscope optique. Utilisez Image Pro 4.5 pour analyser les cellules apoptotiques en couleur brune.

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Résultats

PMT ont été caractérisés avec de l'annexine V coloration ¹⁰ par la cellule activé par fluorescence (FACS) analyse et fermée en utilisant une um perles dans lequel 97% des députés (≤1 um) ont été annexine-V-Cy5 positive (figure 1A et 1B). Typiquement, environ 2,5 mg de PMT ont été obtenus à la suite de ce protocole. Explants de tissus bronchiques de souris C57BL / 6 ont été soumis à un traitement véhicule et PMT. L'analyse histopathologique des sections bronchiques r...

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Discussion

Les députés sont des médiateurs actifs de diaphonie intercellulaire et leur étude est prometteur dans de nombreux domaines de la science. ¹¹ Cette étude a présenté un protocole détaillé pour in vitro production à grande échelle de PMT issues d'une lignée de cellules T apoptotique. Ces députés expriment un large répertoire de molécules de lymphocytes et sont biologiquement impliqués dans la régulation de l'homéostasie cellulaire et tissulaire. Cependant, PMT provenant de dif...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
LMPs production and characterization
CEM T cells	ATCC	CCL-119
X-VIVO 15 medium	Cambrex, Walkersville	04-744Q
Flask T75	Sarstedt	83.1813.502
Flask T175	Sarstedt	83.1812.502
Actinomycin D	Sigma Chemical Co.	A9415-2mg
PBS	Lifetechnologies	14190-144
0.22 µm filter	Sarstedt	83.1826.001
Annexin-VCy5	BD Pharmagen	559933
FACS flow solution	BD Bio-sciences	342003
Fluorescent microbeads (1 µm)	Molecular Probes	T8880
Polysterene counting beads (7 µm)	Bangs laboratories	PS06N/6994
Polypropylene FACS tubes	Falcon	352058
1 ml pipet	Fisher	13-678-11B
5 ml pipet	Falcon	357543
25 ml pipet	Ultident	DL-357551
1.5 ml conical polypropylene micro tube	Sarstedt	72.690
15 ml conical polypropylene tube	Sarstedt	62.554.205
50 ml conical polypropylene tube	Sarstedt	62.547.205
50 ml high speed polypropylene copolymer tube	Nalgene	3119-0050
250 ml high speed polypropylene bottle	Beckman	356011
Protein assay (Bradford assay)	Bio-Rad Laboratories	500-0006
Protein assay standard II	Bio-Rad Laboratories	500-0007
Test tube 16 x 100	VWR	47729-576
Test tube 12 x 75	Ultident	170-14100005B
Cell incubator	Mandel	Heracell 150
Low speed centrifuge	IEC	Centra8R
High speed centrifuge	Beckman	Avanti J8
High speed rotor for 250ml bottle	Beckman	JLA16.250
High speed rotor for 50ml tube	Beckman	JA30.50
Fow cytometry	BD Bio-sciences	FACS Calibur
Spectrophotometer	Beckman	Series 600
Bronchial tissue explants and sections
C57BL/6 mice (5-7 weeks old)	Charles River Laboratories, Inc.
Mouse Airway PrimaCell™ System:	CHI Scientific, Inc.	2-82001
Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades	Becton Dickinson AcuteCare	371310	#10
Scalpel Handle	Fine Science Tools Inc.	10003-12	#7
phase-contrast inverted microscope	Olympus Optical CO., LTD.	CK2
high O2 gas mixture	VitalAire Canada Inc.
modular incubator chamber	Billups-Rothenberg Inc.	MIC-101
MaxQ 4000 incubated orbital shaker	Barnstead Lab-Line,	SHKA4000-7
12-well tissue culture plate	Becton Dickinson and Company	353043
Plastic tissue culture dishes (100 mm)	Sarstedt, Inc.	83.1802
Surgical scissors	Fine Science Tools Inc.	14060-09	Straight, sharp, 9cm longth
Half-curved Graefe forceps	Fine Science Tools Inc.	11052-10
humidified CO2 incubator	Mandel Scientific Company Inc.	SVH-51023421
Histopathological examination
formalin formaldehyde	Sigma-Aldrich, Inc.	HT5011
paraffin	Fisher scientific  International, Inc.	T555
ethyl alcohol	Merck KGaA, Darmstadt	EX0278-1
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich, Inc.	G6403
Cacodylate	Sigma-Aldrich, Inc.	31533
microscope slides	VWR Scientific Inc.	48300-025	25x75 mm
Xylene	Fisher scientific  International, Inc.	X5-4
Mayer's hematoxylin	Sigma-Aldrich, Inc.	MHS16	Funnel with filter paper
HCl	Fisher scientific  International, Inc.	A144s-500
eosin	Sigma-Aldrich, Inc.	HT110116	Funnel with filter paper
Permount™ Mounting Medium	Thermo Fisher Scientific Inc.	SP15-100
glass coverslip	surgipath medical industries, Inc.	84503	24×24 #1
TUNEL detection kit	In Situ Cell Death Detection, POD	11 684 817 910
oven	Despatch Industries Inc.	LEB-1-20
rotary Microtome	Leica Microsystems Inc.	RM2145
filter paper	Whatman International Ltd.	1003150	#3
Microscope	Nikon Imaging Japan Inc.	E800
staining dish complete	Wheaton Industries, Inc.	900200	including dish, rack, cover
1.5 ml eppendorf tube	Sarstedt Inc.	72.69	39x10 mm
Orbital and Reciprocating Water Bath	ExpotechUSA	ORS200
phosphate buffered saline	GIBCO	14190-144
fume hood	Nicram RD Service	3707E