기도 상피 세포에 림프 미세 입자 및 아폽토시스 효과의 검출 세대

요약

세포막 창 고 미립자 (의원) 절연 및 병태 생리 학적 효과는 다양한 모델에서 조사 할 수있는 활성 생물학적 소포입니다. 여기에서 우리는 T 림프구 (LMPs)에서 파생 된 의원을 생성하고기도 상피 세포에 자신의 아폽토시스 효과를 입증하는 방법을 설명합니다.

초록

세포 간 통신 세포막 유래 소체의 생물학적 역할에 대한 관심이 최근 증가하고있다. 미세 입자 (의원) 1 ㎛, 0.1 ㎛의 범위에서 직경이, 소체의 하나의 이러한 유형이며, 통상적으로 활성화 또는 사멸을 겪는 진핵 세포의 세포막에서 나타냈다. 여기에서 우리는 D. LMPs는 다단계 차동 원심 분리 과정을 통해 고립되고 유동 세포 계측법하여 특성화 티노 마이신 자극 세포 사멸 CEM T 세포에서 T 림프구에서 유래 미세 입자 (LMPs)의 생성을 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 마우스 호흡기 차 기관지 조직 이식편 유래의 기관지 상피 세포에서의 아폽토시스 LMPs 효과를 입증하기위한 인 시츄 세포 사멸 검출 방법을 제안한다. 여기에 설명 된 방법은 체외에서 세포 사멸 림프구에서 LMPs의 풍부한 수량을 분리하기위한 재현 과정을 제공합니다. LMPs 유도이와 같이 각종 질병 모델의 특성을 평가하는 데 사용되며, 약리학 및 독성학 테스트 할 수있다. 기도 상피는 외부 환경과 하부 조직 사이의 보호 물리적 및 기능적 장벽을 제공 감안할 기관지 조직 이식편보다는 불멸화 상피 세포주를 사용기도 관 조직을 요구 수사 효과적인 모델을 제공한다.

서문

Microparticles (MPs) are biologically active submicron membrane vesicles released following cell activation or apoptosis. MPs are derived from both healthy and damaged cells and are implicated in many physiological and pathological processes.¹ MPs have been detected not only in human plasma, but also in inflammatory and apoptotic tissue. The biological utility of cell membrane–derived MPs has been demonstrated in various settings, including cell signalling models and as pharmacological tools.^2,3 We previously demonstrated that LMPs derived from T lymphocytes following actinomycin D stimulation (to induce apoptosis) suppress angiogenesis and inhibit endothelial cell survival and proliferation.^4,5 The antiangiogenic effects of LMPs may vary significantly depending on the stimuli used to activate T lymphocytes in vitro.⁶

The airway epithelium functions as a protective physical and functional barrier. Increased numbers of T lymphocytes in the airway can contribute to cell damage and airway inflammation.⁷ We have shown that LMPs induce apoptosis of human bronchial epithelial cells,⁸ which indicated LMPs may change barrier function of bronchial epithelium in vivo. Apoptotic cells can be identified using the TUNEL method, which detects in situ DNA fragmentation.

The overall goal of this protocol is to illustrate the in vitro production of LMPs from a T lymphocyte cell line, and to demonstrate their proapoptotic effect on airway epithelial cells. In situ cell death detection demonstrated that LMPs strongly induce airway bronchial epithelial cell death, suggesting that LMPs-mediated injury to the airway epithelium may impact barrier function of the damaged epithelium.

프로토콜

참고 : 남성 C57BL / 6 마​​우스 (5-7주 이전)의 찰스 리버 연구소 인터내셔널 (. 세인트 - 상수, 퀘벡, 캐나다)에서하고 CHU 셍트 - 저스틴 동물 관리위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 조작 할 수 있습니다. 마우스 기관지 조직 절편은 상피 세포에 LMPs의 아폽토시스 효과를 조사하는 차 기관지 상피 세포의 좋은 소스를 제공합니다. 이 프로토콜은 LMPs의 시험 관내 생성뿐만 아니라 LMPs 처리 기관지 조직 이식편에 대한 상피 세포 자멸사를 검출하기위한 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 세 부분으로 구성되어 있습니다.

1. LMPs 생산 및 특성

참고 : 오염을 방지이 실험에 사용 된 모든 재료는 멸균 또는 멸균되어 있는지 확인하십시오. 달리 언급하지 않는 한, 무균 조건에서 생물 안전 캐비닛에 실온에서 모든 단계를 수행합니다.

1.1) 자극과 의원의 컬렉션⁹

1. 37 ° C의 수욕 천만 CEM T 세포의 분취 량을 해동. 10ml에 희석 예열 된 무 혈청 200 GX 5 분에서 15 ㎖의 멸균 튜브와 원심 분리기, 예컨대 X-VIVO 같은 조혈 매체. 예열 배지 5ml에 재현 탁하고 세포 상등액을 기음.
2. 15 ml의 예열 조혈 같은 X-VIVO와 같은 매체 5 % CO _2와 37 ° C에서 가습 배양기에서 4 일 동안 배양과 (서스펜션 세포) T75 조직 배양 플라스크에 넣고 세포를 전송합니다.
3. 사일 후, 100 ㎖의 새로운 배지를 함유하는 T175 조직 배양 플라스크에 모든 배양액과 세포를 옮긴다. 그들은 2 백만 세포 / ml의 밀도로 성장 될 때까지 동일한 조건에서 약 72 시간 동안 계속하여 배양 된 세포.
4. 균등 네 T175 플라스크 각각 포함 된 150 ml의 신선한 매체 세포가 200 만 / ml의 농도로 (약 48 시간 배양)를 재배 할 때까지 세포 배양을 계속 사이에 세포를 분리.
5. 5 분 동안 200 XG에서 원심 분리하여 각 플라스크로부터 세포를 수집하고, 2 백만 / ml의 세포 밀도를 유지하기 위하여, 150 ㎖의 새로운 배지를 함유하는 새로운 T175 플라스크에 300 × ¹⁰⁶ 세포를 재현 탁.
6. 0.5 ㎍ / ml의 최종 농도로 배지 (2 ㎎ / ㎖로 DMSO에 용해) 티노 마이신 D 첨가하고 24 시간 동안 배양한다.
7. 50 ML 원뿔 튜브에 모든 문화 매체를 전송하고 5 분 동안 750 XG에서 세포를 스핀 다운. 15 분 대 세포 파편을 제거하기 위해 1,500 XG에 50 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 뜨는을 전송합니다.
8. 50 분 동안 12,000 XG에 250 ml의 병 및 초 원심 분리기에 뜨는을 전송합니다. 뜨는을 취소하고 알약을 수집합니다.
9. 워시 50 분 동안 12,000 XG에서 원심 분리하여 50 ㎖ 튜브에 40ml의 무균 PBS로 펠릿 LMPs이 농후. 두 번이 단계를 반복합니다.
10. 마지막 세척 상층 액을 수집; 이는 비히클 대조군으로 사용한다. 1 LMPs 펠렛을 일시 중단㎖의 PBS는 1.5 ml의 멸균 마이크로 튜브로 전송할 수 있습니다. 분취 매장 절연 LMPs는 -80 ° C에서 (다중 자유 - 해동 사이클을 방지하기 위해).

FACS 분석 ^(4)를 통해 의원 1.2) 특성

1. _{염화칼슘이없이} 넥신 버퍼의 두 샘플 1과 다른 준비 : 헤 페스 10 mM의 NaCl을 140 mM의 플러스 마이너스 5 mM의 염화칼슘 _2.
2. 입자를 제거하기 위해 0.22 μm의 필터를 사용하여 아 넥신 FACS 완충액 시스 유동 유체 필터.
3. FACS 튜브에 5 mM의 염화칼슘 ₂ 넥신 버퍼의 44 μL에 LMPs 1 μl를 희석. 염화칼슘 ₂ (음성 대조군)없이 넥신 버퍼의 44 μL에 LMPs 1 μL와 다른 튜브를 준비합니다.
4. 각각의 튜브에 넥신 - Cy5에 5 μl를 넣고 잘 섞는다. 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 품어. 각 튜브에서 FACS 시스 유동 유체의 400 μL와 혼합하여 희석함으로써 반응을 정지.
5. 7 μm의 계수 BEA의 10 μL (20 구슬)를 추가합니다각 튜브에서 내부 표준으로서 DS 현탁액 절대 수를 얻었다.
6. 상대적 크기의 게이트 (FSC-H, PMT E00, 규모 로그인) 및 상대 단위 (SSC-H, PMT (325), 로그 스케일)의 크기 보정 형광 구슬을 사용하여 흐름 cytometer에 도트 플롯을 설정 1 ㎛ (게이트 1) 7 μm의 (문 2)에서 비즈 게이트를 계산.
7. 20,000 카운트 비즈 게이트 2에 도달 할 때까지 신호를 획득함으로써, 도트 플롯 (규모를 기록, PMT 765) 넥신에 대한 설립 게이트 및 FL-4 채널을 사용하여 FSC-H / SSC-H 플롯에 LMPs 샘플을 분석 할 수 있습니다.
8. _CaCl2를 포함 넥신 버퍼에 LMPs의 긍정적 인 넥신 이벤트를 결정하고 염화칼슘 ₂ (음성 대조군)없이 넥신 버퍼에 LMPs의 이벤트를 뺍니다.
9. 다음의 식에 기초 의원의 절대 수를 계산 :
   

MP P 1.3) 결정rotein 농도 (브래드 포드 분석)

1. 1.25 ~ 20 ㎍ / ml의에서 단백질 표준의 5 연속 희석을 준비합니다. 피펫 중복에 깨끗한 시험관에 각각의 표준 시료 용액 800 μL. 각각의 튜브에 브래드 포드 염색 시약 200 μl를 추가합니다. 믹스 그럼 5 분 동안 실온에서 품어.
2. 595 nm에서 흡광도를 측정한다. 표준 곡선의 선형 회귀를 이용 LMPs의 단백질 농도를 결정한다.

2. 기관지 조직 외식 및 LMPs 치료

참고 : 멸균 작업 환경에 특별한주의를 지불하고, 무균 실험을 다음에 사용되는 솔루션과 매체를 준비합니다. , 완전한 치유 미디어를 준비 100ml의 조직 치유 중간 (얼음 해동) 혈청과 조직 치유 중간 보충 교재의 1를 가하여 잘 혼합합니다.

기관지 조직 외식 2.1) 준비

1. 배양 전에 1cm ^2의 6 영역에 흠집메스 블레이드 각각 100mm 조직 배양 접시 표면의 가장자리에 각각. 코트는 각각 배양 접시에 코팅 용액 2 ㎖와 100mm 조직 배양 접시 긁힌, 37 ° C에서 / 가습 CO ₂ 인큐베이터 O에서 N을 접시를 품어. 진공 잉여 솔루션을 기음과 조직 세척 매체의 15 ml로 접시를 채운다.
2. 동물 관리 윤리위원회의 승인을 프로토콜에 따라 공동으로 ₂ 흡입 (5~7주 세) C57BL / 6 마우스를 안락사.
3. 무균는 메스, 뒤몽 초 고화질 트위터, 수술 가위로 폐 조직을 해부하다. 조심스럽게 실질 조직과 혈관을 제거합니다. 해당되는 경우, 실험실로 전송을 위해 얼음처럼 차가운 조직 세탁기 중간에 폐 조직을 놓습니다.
4. 또한 티슈 세척 매체에 잠긴 해부 기관지 폐 및 말초 조직으로부터 1~2.5 mm의 직경을 분리 기관지. 메스와 ~ 5mm 두께의 기관지 반지에 조각 기관지 조직.
5. 기관지 조각을 픽업하여 요리의 긁힌 부분에 그들을 배치 할 멸균 곡선 microdissecting의 집게로 떠 모션을 사용합니다.
6. 조직 세탁기 매체를 제거하고, 그들에게 요리를 준수 할 수 있도록 ~ 5 분 동안 실온에서 조각을 배양한다.
7. 각각의 요리에 완전 치유 중간의 10 ML을 추가 및 공기 조절 모듈 형 인큐베이터 실에 배치합니다. 높은 O ₂ 가스 혼합물 (70 % O _2, 25 % N _2와 5 % CO _2)와 챔버 플러시. 벤치 탑 궤도 인큐베이터에있는 챔버를 놓고 37 ℃에서 흔들어. 매체를 통해 단편 간헐적 흐르게 분당 10 사이클에서 24 시간 동안 흔들어 챔버.
8. 24 시간 배양 후, 도립 위상차 광학 현미경 하에서 조직 절편을 관찰한다. 이후 LMPs 치료 완료, 좋은 머리의 움직임과 활기찬 기관지 상피 세포와 기관지 외식을 선택합니다.

2.2) LMPs 치료

1. 다음과 같이 완전한 성장 매체를 준비 : 해동 성장 매체 보충제를 얼음에 혈청 및 섬유 아세포 억제제. 혈청 성장 배지 100 ㎖에 200 μL 억제제 섬유 아세포 성장 배지 보충제 1 ml의 추가; 잘 혼합. 사용하기 전에 10 분 동안 37 ° C에서 완전 성장 배지를 따뜻하게.
2. 800 ㎍ / ml의 농도로 LMPs 스톡을 제조 PBS로 새로운 멸균 에펜 도르프 튜브에 절연 LMPs 희석.
3. 12- 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 전체 성장 배지 0.5 ㎖의 추가.
4. 조직 배양 플레이트의 각 웰에 이전 프로토콜 (2.1)에서 곡선 microdissecting 집게로 선택한 기관지 외식을 전송합니다.
5. LMPs 처리 우물과 제어 우물을 식별하기 위해 적절하게 배양 플레이트 레이블. 25 μL 제어 차량 (40 ㎍ / ml의 최종 농도)도 각각 LMPs 처리에 25 μL LMPs 주식을 추가합니다 (LMP 대조군 웰의 생산).
6. 부드러운 흔들림와 37 ° C에서 공기 조절 모듈 형 인큐베이터 실에서 배양을 계속합니다.
7. 24 시간 후, PBS로 절편을 3 회 세척하고 다음 단계 (4 % 파라 포름 알데히드 [PFA] 고정)를 진행합니다.

3. 조직 병리학 적 검사

3.1) 다음 단계로 진행하기 전에 다음 솔루션을 준비

1. 137 mM의 NaCl을, 2.7 mM의 KCl을 10 mM의 나 ₂ HPO _4, 1.76 mM의 KH ₂ PO _4, 산도 7.4을 혼합하여 1X PBS 버퍼를 준비합니다.
2. 4 % PFA가 교반하면서 60 ℃에서 가열하고, 물 400 ㎖, PFA에서의 20g을 용해 제조하는 단계; 솔루션을 취소 10 M NaOH를 몇 방울을 추가합니다. 다음 1X PBS 버퍼를 추가하고 7.4에 500 ml의 부피와 산도를 조정합니다. 필터와 나누어지는; -20 ° C에서 저장합니다.
3. 다음 탈수 나 수분 보충 시약을 준비; 100 %, 90 %, 70 %, 50 % 에탄올, 크실렌.

e_step "> 3.2) 이식편을 고정하고 조직 섹션 탈 파라핀

1. 4 % PFA 1.5 ml로 표시 microcentrifuge 관의 각 절편을 넣고 4 ℃에서 O / N을 배양한다. 1X PBS로 두 번 외식을 씻어.
2. 알코올 일련 이식편 탈수 (70 % 에탄올 : 각 3 회 30 분간, 90 % 에탄올 : 각 2 회 30 분 100 % 에탄올을 3 회 30 분 각 후 크실렌 : 3 회 20 분 각). 흄 후드에서 실온에서 모든 단계를 수행합니다.
3. 오븐에서 58 ° C에서 파​​라핀 조직 절편을 임베드. 회전식 마이크로톰을 사용하여 5 μm의 두께 조직 섹션을 준비합니다.
4. 56 ° C의 물을 욕조에 섹션을 플로트 한 다음 표시된 조직 학적 슬라이드에 섹션을 탑재합니다. 1 시간 동안 65 ° C에서 수동 염색 랙 및 건조에 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드 실온에서 냉각시킵니다.
5. 파라핀을 제거하기 위해 10 분마다 자일 렌을 포함하는 4 연속 얼룩 요리 랙을 찍어. 셀만 후 100 %, 95 % : 크실렌을 제거하는 에탄올 시리즈 랙을 찍어다음, 80 %, 70 %,이어서 50 % 에탄올 (단계마다 5 분간) KO. 에탄올을 제거하는 5 분 동안 수돗물 랙을 씻어.

3.3) 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색

1. 고정 된 조직 섹션 작업을 계속; 15 분 동안 마이어의 헤 마톡 실린 가득 염색 접시에 선반을 두십시오. 20 분 동안 헤 마톡 실린을 제거하기 위해 수돗물로 랙을 씻어.
2. 30 초 95 % 에탄올 30 sec.Place 증류수에 놓습니다. 1 분 동안 에오신 Y 솔루션 염색 접시에 놓습니다. 2 분마다 95 % 에탄올, 100 % 에탄올, 크실렌이 변화를 통해 탈수.
3. 초과 에오신가 제거되었는지 확인하기 위해 현미경으로 빠른 검사를 수행합니다. 커버 유리 커버 한 후, 각각의 슬라이드에 장착 중간 (피셔 SP15-100)의 2 ~ 3 방울을 놓습니다.

3.4) 현장 세포 죽음 검출 : TUNEL 분석 실험

1. 시작하기 전에, 단백질 분해 효소 K 작업 용액을 제조 : 20 ㎍ / ㎖의에10 mM 트리스 / 염산, pH가 7.4.
2. 3.2 절 (이식편 고정 및 조직 섹션 탈 파라핀)의 5 단계 1을 반복합니다. 탈의 H ₂ O와 슬라이드를 씻어
3. 10 분 동안 1X PBS로 슬라이드를 담근다. 초과 PBS를 배출합니다. 프로 테이나 제 K 작업 용액으로 RT에서 30 분 동안 조직 섹션을 인큐베이션. 린스는 1X PBS로 두 번 슬라이드.
4. 세포 죽음 탐지 키트의 사용 설명서에 기재된 바와 같이 TUNEL 분석을 수행한다. 설치 매체를 이용하여 장착하고 커버 글라스 수동으로 커버 슬립.
5. 광학 현미경 샘플을 분석 할 수 있습니다. 갈색 색상의 사멸 세포를 분석하는 프로 이미지 4.5을 ​​사용합니다.

결과

LMPs 형광 활성화 셀 (FACS) 분석을 정렬 및 의원 (≤1 μm의)의 97 %가 넥신-V-Cy5에 긍정적 된 1 μm의 구슬 사용 정문에 의해 넥신 V 염색 ⁽¹⁰⁾ 특성화되었다 (그림 1A 및 1B). 일반적 LMPs 약 2.5 mg을이 프로토콜 다음 얻었다. C57BL 기관지 조직 이식편은 / 6 마​​우스는 비히클 및 LMPs 처리를 실시 하였다. 기관지 섹션의 조직 병리학 적 분석은 기관지 상피 세포의 구조적 무결성에 LMPs의 효...

토론

의원 간 크로스 토크의 활성 매개체 및 그들의 연구는 과학의 많은 분야에서 유망된다. ^(11)이 연구는 사멸의 T 세포주의 시험 관내 LMPs 대규모 생성을위한 상세한 프로토콜을 제시 하였다. 이러한 의원 림프구 분자의 큰 레퍼토리를 발현과 생물학적 세포 및 조직의 항상성 조절에 연루되어있다. 그러나, 서로 다른 소스에서 파생 된 LMPs 생물학적 다를 수 있습니다. ^4,9,12,13

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
LMPs production and characterization
CEM T cells	ATCC	CCL-119
X-VIVO 15 medium	Cambrex, Walkersville	04-744Q
Flask T75	Sarstedt	83.1813.502
Flask T175	Sarstedt	83.1812.502
Actinomycin D	Sigma Chemical Co.	A9415-2mg
PBS	Lifetechnologies	14190-144
0.22 µm filter	Sarstedt	83.1826.001
Annexin-VCy5	BD Pharmagen	559933
FACS flow solution	BD Bio-sciences	342003
Fluorescent microbeads (1 µm)	Molecular Probes	T8880
Polysterene counting beads (7 µm)	Bangs laboratories	PS06N/6994
Polypropylene FACS tubes	Falcon	352058
1 ml pipet	Fisher	13-678-11B
5 ml pipet	Falcon	357543
25 ml pipet	Ultident	DL-357551
1.5 ml conical polypropylene micro tube	Sarstedt	72.690
15 ml conical polypropylene tube	Sarstedt	62.554.205
50 ml conical polypropylene tube	Sarstedt	62.547.205
50 ml high speed polypropylene copolymer tube	Nalgene	3119-0050
250 ml high speed polypropylene bottle	Beckman	356011
Protein assay (Bradford assay)	Bio-Rad Laboratories	500-0006
Protein assay standard II	Bio-Rad Laboratories	500-0007
Test tube 16 x 100	VWR	47729-576
Test tube 12 x 75	Ultident	170-14100005B
Cell incubator	Mandel	Heracell 150
Low speed centrifuge	IEC	Centra8R
High speed centrifuge	Beckman	Avanti J8
High speed rotor for 250ml bottle	Beckman	JLA16.250
High speed rotor for 50ml tube	Beckman	JA30.50
Fow cytometry	BD Bio-sciences	FACS Calibur
Spectrophotometer	Beckman	Series 600
Bronchial tissue explants and sections
C57BL/6 mice (5-7 weeks old)	Charles River Laboratories, Inc.
Mouse Airway PrimaCell™ System:	CHI Scientific, Inc.	2-82001
Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades	Becton Dickinson AcuteCare	371310	#10
Scalpel Handle	Fine Science Tools Inc.	10003-12	#7
phase-contrast inverted microscope	Olympus Optical CO., LTD.	CK2
high O2 gas mixture	VitalAire Canada Inc.
modular incubator chamber	Billups-Rothenberg Inc.	MIC-101
MaxQ 4000 incubated orbital shaker	Barnstead Lab-Line,	SHKA4000-7
12-well tissue culture plate	Becton Dickinson and Company	353043
Plastic tissue culture dishes (100 mm)	Sarstedt, Inc.	83.1802
Surgical scissors	Fine Science Tools Inc.	14060-09	Straight, sharp, 9cm longth
Half-curved Graefe forceps	Fine Science Tools Inc.	11052-10
humidified CO2 incubator	Mandel Scientific Company Inc.	SVH-51023421
Histopathological examination
formalin formaldehyde	Sigma-Aldrich, Inc.	HT5011
paraffin	Fisher scientific  International, Inc.	T555
ethyl alcohol	Merck KGaA, Darmstadt	EX0278-1
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich, Inc.	G6403
Cacodylate	Sigma-Aldrich, Inc.	31533
microscope slides	VWR Scientific Inc.	48300-025	25x75 mm
Xylene	Fisher scientific  International, Inc.	X5-4
Mayer's hematoxylin	Sigma-Aldrich, Inc.	MHS16	Funnel with filter paper
HCl	Fisher scientific  International, Inc.	A144s-500
eosin	Sigma-Aldrich, Inc.	HT110116	Funnel with filter paper
Permount™ Mounting Medium	Thermo Fisher Scientific Inc.	SP15-100
glass coverslip	surgipath medical industries, Inc.	84503	24×24 #1
TUNEL detection kit	In Situ Cell Death Detection, POD	11 684 817 910
oven	Despatch Industries Inc.	LEB-1-20
rotary Microtome	Leica Microsystems Inc.	RM2145
filter paper	Whatman International Ltd.	1003150	#3
Microscope	Nikon Imaging Japan Inc.	E800
staining dish complete	Wheaton Industries, Inc.	900200	including dish, rack, cover
1.5 ml eppendorf tube	Sarstedt Inc.	72.69	39x10 mm
Orbital and Reciprocating Water Bath	ExpotechUSA	ORS200
phosphate buffered saline	GIBCO	14190-144
fume hood	Nicram RD Service	3707E