Generazione di linfocitica microparticelle e rilevamento del loro effetto pro-apoptotico su cellule delle vie aeree epiteliali

Riepilogo

Microparticelle di membrana-capannone cellule (MPS) sono vescicole biologici attivi che possono essere isolate e loro effetti fisiopatologici esaminato in vari modelli. Qui si descrive un metodo per la generazione di parlamentari provenienti dai linfociti T (LMPS) e per dimostrare il loro effetto pro-apoptotico sulle cellule epiteliali delle vie aeree.

Abstract

L'interesse per i ruoli biologici delle cellule vescicole membrana derivata nella comunicazione cellula-cellula è aumentato negli ultimi anni. Microparticelle (MPS) sono un tale tipo di vescicole, che vanno a diametro da 0,1 micron a 1 micron, e tipicamente capannone dalla membrana plasmatica delle cellule eucariotiche in fase di attivazione o apoptosi. Qui si descrive la generazione di linfociti T di derivazione microparticelle (LMPS) da apoptosi delle cellule T CEM stimolate con actinomicina D. LMPS sono isolati attraverso un processo di centrifugazione differenziale più gradi e caratterizzate con citometria a flusso. Questo protocollo presenta anche un metodo di rilevamento morte cellulare in situ per dimostrare l'effetto della proapoptotico LMPS sulle cellule epiteliali bronchiali derivate da topi primari espianti tissutali bronchiali respiratorie. Metodi qui descritti forniscono una procedura riproducibile per isolare quantità abbondanti di LMPS da linfociti apoptotici in vitro. LMPS derivatoin questo modo può essere utilizzato per valutare le caratteristiche dei vari modelli di malattia, e farmacologia e test tossicologici. Dato che l'epitelio delle vie aeree offre una barriera fisica e funzionale protettivo tra l'ambiente esterno e del tessuto sottostante, uso di espianti tissutali bronchiali piuttosto che linee cellulari epiteliali immortalizzate fornisce un modello efficace per le indagini richiedono tessuti delle vie aeree.

Introduzione

Microparticles (MPs) are biologically active submicron membrane vesicles released following cell activation or apoptosis. MPs are derived from both healthy and damaged cells and are implicated in many physiological and pathological processes.¹ MPs have been detected not only in human plasma, but also in inflammatory and apoptotic tissue. The biological utility of cell membrane–derived MPs has been demonstrated in various settings, including cell signalling models and as pharmacological tools.^2,3 We previously demonstrated that LMPs derived from T lymphocytes following actinomycin D stimulation (to induce apoptosis) suppress angiogenesis and inhibit endothelial cell survival and proliferation.^4,5 The antiangiogenic effects of LMPs may vary significantly depending on the stimuli used to activate T lymphocytes in vitro.⁶

The airway epithelium functions as a protective physical and functional barrier. Increased numbers of T lymphocytes in the airway can contribute to cell damage and airway inflammation.⁷ We have shown that LMPs induce apoptosis of human bronchial epithelial cells,⁸ which indicated LMPs may change barrier function of bronchial epithelium in vivo. Apoptotic cells can be identified using the TUNEL method, which detects in situ DNA fragmentation.

The overall goal of this protocol is to illustrate the in vitro production of LMPs from a T lymphocyte cell line, and to demonstrate their proapoptotic effect on airway epithelial cells. In situ cell death detection demonstrated that LMPs strongly induce airway bronchial epithelial cell death, suggesting that LMPs-mediated injury to the airway epithelium may impact barrier function of the damaged epithelium.

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Protocollo

NOTA: Maschio C57BL / 6 topi (5-7 settimane) sono da Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Canada.) E manipolati secondo protocolli approvati dalla Sainte-Justine Comitato Animal Care CHU. Espianti di tessuto bronchiale mouse forniscono una buona fonte di cellule epiteliali bronchiali primarie per lo studio degli effetti proapoptotici di LMPS sulle cellule epiteliali. Questo protocollo descrive la generazione in vitro di LMPS, nonché un metodo per la rilevazione di cellule epiteliali apoptotiche su espianti tissutali bronchiali LMPS trattati. Questo protocollo è costituito da 3 sezioni.

1. LMPS produzione e caratterizzazione

NOTA: Per prevenire la contaminazione, in modo che tutti i materiali usati in questo esperimento sono sterili o in autoclave. Eseguire tutti i passaggi a RT in una cappa di sicurezza biologica in condizioni sterili, se non diversamente indicato.

1.1) La stimolazione e Collezione dei deputati⁹

1. Scongelare una aliquota di 10 milioni di cellule T CEM in un bagno di 37 ° C dell'acqua. Diluire in 10 ml preriscaldata medio ematopoietiche come X-VIVO, in 15 ml provetta sterile e centrifugare a 200 gx 5 min senza siero. Aspirare le cellule surnatante e risospendere in 5 ml di media pre-riscaldato.
2. Trasferire le cellule in un pallone di coltura tissutale T75 (per cellule in sospensione) con 15 ml di media ematopoietiche pre-riscaldato come X-VIVO e incubare per 4 giorni in un incubatore umidificato a 37 ° C con 5% di CO _2.
3. Dopo 4 giorni, trasferire tutto il terreno di coltura e le cellule in un pallone di coltura tissutale T175 contenente 100 ml di mezzo fresco. Continuare incubando le cellule per circa 72 ore nelle stesse condizioni sono cresciuti fino ad una densità di 2 milioni di cellule / ml.
4. Uniformemente dividere le celle tra quattro beute T175 ciascuna contenente 150 ml di mezzo fresco e continuano coltura cellulare fino cellule sono cresciute (circa 48 ore di incubazione) ad una densità di 2 milioni / ml.
5. Raccogliere cellule da ciascuna beuta per centrifugazione a 200 xg per 5 min e risospendere 300 x 10 ⁶ cellule in un pallone nuovo T175 contenente 150 ml di mezzo fresco, per mantenere il 2 milioni / ml densità cellulare.
6. Aggiungere actinomicina D (disciolto in DMSO a 2 mg / ml) al mezzo ad una concentrazione finale di 0,5 mg / ml e incubare per 24 ore.
7. Trasferire tutto il terreno di coltura in 50 ml provette coniche e centrifugare le cellule a 750 xg per 5 min. Trasferire il surnatante in 50 ml provette coniche e centrifugare a 1500 xg per 15 minuti per rimuovere frammenti di cellule di grandi dimensioni.
8. Trasferire il surnatante in una bottiglia da 250 ml e ultracentrifuga a 12.000 g per 50 min. Eliminare il surnatante e raccogliere pellet.
9. Pellets Wash LMPS-arricchito con 40 ml di PBS sterile in un tubo da 50 ml per centrifugazione a 12.000 xg per 50 min. Ripetere questa operazione due volte.
10. Raccogliere l'ultima surnatante lavaggio; sarà usato come controllo del veicolo. Sospendere il pellet LMPS a 1ml di PBS e trasferire in un 1,5 ml provetta sterile. Aliquota e conservare isolati LMPS a -80 ° C (per evitare più cicli senza disgelo).

1.2) Caratterizzazione dei parlamentari su Analisi FACS ⁴

1. Preparare 2 campioni di tampone annexin, 1 con e altre senza CaCl _2: Hepes 10 mM, NaCl 140 mm, più o meno 5 mM CaCl _2.
2. Filtro tampone annessina e FACS liquido guaina flusso utilizzando un filtro 0,22 micron per rimuovere le particelle.
3. Diluire 1 ml di LMPS in 44 ml di tampone annexin con 5 mM CaCl ₂ in un tubo FACS. Preparare un altro tubo di 1 ml di LMPS in 44 ml di tampone annexin senza CaCl ₂ (controllo negativo).
4. Aggiungere 5 ml di annexinV-Cy5 in ciascuna provetta e mescolare bene. Incubare per 15 minuti a RT al buio. Arrestare la reazione diluendo la miscela con 400 ml di FACS liquido guaina flusso in ciascun tubo.
5. Aggiungere 10 ml (200.000 perle) di bea conteggio 7 micronsospensione ds come standard interno in ciascuna provetta per ottenere un conteggio assoluto.
6. Stabilire porte di dimensioni relative (FSC-H, PMT E00, log di scala) e relativo granularità (SSC-H, PMT 325, scala logaritmica) trama puntino sul citofluorimetro utilizzando perline fluorescenti dimensioni-calibrato di 1 micron (gate 1) e contando perline cancello 7 micron (gate 2).
7. Analizzare il campione LMPS on FSC-H / SSC-H plot utilizzando le porte consolidate e FL-4 canali per annexin (PMT 765, scala logaritmica) diagramma bidimensionale, con l'acquisizione di un segnale fino a 20.000 conteggio sfere sono raggiungibili in porta 2.
8. Determinare gli eventi annexinV positivi di LMPS in tampone annexin contenente CaCl _2, e quindi sottrarre gli eventi di LMPS nel buffer annexin senza CaCl ₂ (controllo negativo).
9. Calcolare il numero assoluto di MP basati sulla seguente equazione:
   

1.3) Determinazione della MP Protein Concentrazione (Bradford Assay)

1. Preparare 5 diluizioni seriali di standard proteine ​​1,25-20 ug / ml. Pipettare 800 ml di ogni soluzione standard e campione in una provetta pulita in duplice copia. Aggiungere 200 ml di Bradford reagente colorante per ogni provetta. Mescolare bene, poi incubare a temperatura ambiente per 5 min.
2. Misurare l'assorbanza a 595 nm. Determinare la concentrazione di proteine ​​della LMPS utilizzando la regressione lineare della curva standard.

2. espianti tessuto bronchiale e LMPS Trattamento

NOTA: Prestare particolare attenzione all'ambiente di lavoro sterile e asettico preparare le soluzioni ei media utilizzati in seguito esperimenti. Per preparare la completa guarigione medio, aggiungere 1 ml di tessuto di guarigione medio Supplementi con siero (scongelati su ghiaccio) a 100 ml Tissue guarigione medio e mescolare bene.

2.1) Preparazione di bronchiali espianti di tessuto

1. Prima di coltura, graffiare 6 aree di 1 cm ²ciascuno al bordo della superficie di ogni piatto di coltura tissutale 100 mm con una lama di bisturi. Cappotto ogni graffiato 100 millimetri di tessuto piatto cultura con 2 ml di soluzione di rivestimento piatto cultura, e incubare il piatto in un umidificata CO ₂ incubatore O / N a 37 ° C. Vacuum aspirare la soluzione surplus e riempire il piatto con 15 ml di tessuto di lavaggio medio.
2. Euthanize C57BL / 6 topi (5-7 settimane) da CO ₂ inalazione secondo protocolli approvati dal comitato etico per la cura degli animali.
3. Asetticamente sezionare tessuto polmonare con bisturi, Dumont super fine pinzetta, e forbici chirurgiche. Rimuovere con attenzione i vasi sanguigni e parenchima. Mettere tessuto polmonare in ghiaccio-freddo di lavaggio del tessuto medio per il trasporto al laboratorio, se applicabile.
4. Ulteriori sezionare bronchi sommerso nel lavaggio dei tessuti Medium e separare bronco con un diametro di 1 a 2,5 mm dal tessuto polmonare periferici. Slice tessuti bronchiali in anelli bronchiali ~ 5 millimetri di spessore con un bisturi.
5. Utilizzare un movimento scavare con le pinze sterili microdissecting curve per raccogliere i frammenti bronchiali e metterli sulle zone graffiate dei piatti.
6. Rimuovere il tessuto lavaggio medio, e incubare i frammenti a temperatura ambiente per ~ 5 minuti per consentire loro di aderire ai piatti.
7. Aggiungere 10 ml di completa guarigione medio per ogni piatto e metterli in atmosfera controllata camera dell'incubatore modulare. Lavare la camera ad alta O ₂ miscela di gas (70% O _2, 25% N ₂ e 5% CO _2,). Posizionare la camera in un incubatore orbitale da banco e scuoterla a 37 ° C. Agitare la camera per 24 ore a 10 cicli al minuto per consentire al mezzo di fluire intermittente per i frammenti.
8. Dopo 24 ore di incubazione, osservare le espianti di tessuto al microscopio ottico a contrasto di fase invertita. Selezionare espianti bronchiali con assoluta, il movimento capelli fini e vivace dell'epitelio bronchiale per il successivo trattamento LMPS.

2.2) LMPS Trattamento

1. Preparare il terreno di coltura completo come segue: media integratori crescita disgelo con siero e fibroblasti inibitore sul ghiaccio. Aggiungere 1 ml di supplementi di media crescita con siero e 200 inibitore fibroblasti ml a 100 ml di terreno di coltura; mescolare accuratamente. Riscaldare il terreno di coltura completo a 37 ° C per 10 minuti prima dell'uso.
2. Diluire LMPS isolato in una nuova provetta eppendorf sterile con PBS per preparare uno stock LMPS ad una concentrazione di 800 ug / ml.
3. Aggiungere 0,5 ml di mezzo completo Growth a ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale 12 pozzetti.
4. Trasferire gli espianti bronchiali selezionati con le pinze microdissecting curve dal protocollo precedente (punto 2.1) in ciascun pozzetto della piastra di coltura tissutale.
5. Etichettare la piastra di coltura appropriato per identificare LMPS pozzi di trattamento e pozzetti di controllo. Aggiungere 25 ml LMPS magazzino in ogni trattamento LMPS bene (per una concentrazione finale di 40 mg / ml) e 25 veicoli di controllo microlitri (vedi LMP produzione s) per i pozzetti di controllo.
6. Continuare l'incubazione in atmosfera controllata modulare camera di incubazione a 37 ° C agitando delicatamente.
7. Dopo 24 ore, lavare espianti 3 volte con PBS e procedere al (fissaggio 4% paraformaldeide [PFA]) passo successivo.

3. Esame istopatologico

3.1) Preparare i Solutions segue prima di procedere alle prossime tappe

1. Preparare tampone PBS 1x miscelando 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1.76 mM KH ₂ PO _4, pH 7.4.
2. Per preparare 4% PFA, sciogliere 20 g di PFA in 400 ml di acqua, riscaldata a 60 ° C sotto agitazione; aggiungere qualche goccia di 10 M NaOH per cancellare la soluzione. Successivamente aggiungere PBS 1x e regolare il volume a 500 ml e il pH a 7,4. Filtro e un'aliquota; conservare a -20 ° C.
3. Preparare i seguenti reagenti di disidratazione o di reidratazione; 100%, 90%, 70%, 50% etanolo e xilene.

e_step "> 3.2) Espianto Fixation e Sezioni di Tessuto Deparaffinizzazione

1. Mettete ogni espianto in una provetta etichettata con 1,5 ml di 4% PFA e incubare O / N a 4 ° C. Sciacquare gli espianti due volte con 1x PBS.
2. Disidratare espianti attraverso una serie di alcool (etanolo al 70%: 3 volte 30 minuti ciascuno; il 90% di etanolo: 2 volte 30 minuti ciascuno; 100% di etanolo: 3 volte 30 minuti ciascuno, quindi xilene: 3 volte 20 minuti ciascuno). Eseguire tutti i passaggi a RT in una cappa aspirante.
3. Imbed espianti tissutali in paraffina a 58 ° C in un forno. Preparare 5 micron sezioni di tessuto di spessore con un microtomo rotativo.
4. Galleggiante sezioni in un bagno di 56 ° C dell'acqua, e poi montare le sezioni su vetrini istologici etichettati. Porre i vetrini in rack di colorazione manuale e secca a 65 ° C per 1 ora. Lasciare raffreddare i vetrini a temperatura ambiente.
5. Immergere le rastrelliere in 4 piatti macchia consecutivi contenenti xilene per 10 minuti ciascuno per rimuovere la paraffina. Immergere le rastrelliere in una serie di etanolo per rimuovere xilene: 100%, quindi il 95%, then 80%, poi 70%, poi 50% di etanolo (5 min per ogni passo). Sciacquare le rastrelliere con acqua di rubinetto per 5 minuti per eliminare l'etanolo.

3.3) ematossilina e eosina (H & E) di colorazione

1. Continuare a lavorare con le sezioni di tessuto fissate; la cremagliera in un piatto di colorazione riempito con ematossilina di Mayer per 15 min. Sciacquare il rack con acqua di rubinetto per rimuovere Hematoxylin per 20 min.
2. Mettere in acqua distillata per 30 sec.Place in etanolo al 95% per 30 sec. Mettere in Eosina Y piatto soluzione colorante per 1 min. Disidratare attraverso 2 cambi di etanolo al 95%, 100% etanolo e xilene per 2 minuti ciascuna.
3. Eseguire un rapido controllo al microscopio per assicurare che l'eccesso eosina viene rimosso. Mettere 2 o 3 gocce di mezzo di montaggio (Fisher SP15-100) su ogni vetrino, quindi coprire con un vetro di copertura.

3.4) In Situ cella della morte di rilevazione: TUNEL Assay

1. Prima di iniziare, preparare proteinasi soluzione di lavoro K: 20 mg / ml aTris 10 mM / HCl, pH 7.4.
2. Ripetere i passaggi da 1 a 5 della Sezione 3.2 (fissazione Espianto e tessuti sezione deparaffinizzazione). Sciacquare i vetrini con deionizzata H ₂ O.
3. Immergere i vetrini con 1x PBS per 10 min. Scolare l'eccesso di PBS. Incubare sezioni di tessuto per 30 minuti a RT con soluzione di lavoro proteinasi K. Sciacquare scivola due volte con 1x PBS.
4. Eseguire il saggio TUNEL come descritto nel manuale di istruzioni del kit di rilevamento morte cellulare. Montare con mezzo di montaggio, e applicare il coprioggetto manualmente con vetrino.
5. Analizzare i campioni al microscopio ottico. Utilizzare Image Pro 4.5 per analizzare le cellule apoptotiche in colore marrone.

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Risultati

LMPS sono stati caratterizzati con annessina V colorazione ¹⁰ da cellule fluorescenza attivate (FACS) analisi e recintato con 1 micron perle in cui il 97% dei parlamentari (≤1 micron) erano annessina-V-Cy5 positivi (Figura 1A e 1B). In genere, circa 2,5 mg di LMPS stati ottenuti seguendo questo protocollo. Espianti tessuto bronchiale da topi C57BL / 6 sono stati sottoposti a trattamento veicolo e LMPS. Analisi istopatologica delle sezioni bronchiali rivelato l'effetto LMPS sulla integri...

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Discussione

Parlamentari sono mediatori attivi intercellulare diafonia e il loro studio è promettente in molte aree della scienza. ¹¹ Lo studio ha presentato un protocollo dettagliato per la generazione in vitro su larga scala di LMPS derivato da una linea di cellule T apoptotico. Questi parlamentari esprimono un vasto repertorio di molecole di linfociti e sono biologicamente implicati nella regolazione dell'omeostasi cellulare e tissutale. Tuttavia, LMPS provenienti da fonti diverse può essere biologicame...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
LMPs production and characterization
CEM T cells	ATCC	CCL-119
X-VIVO 15 medium	Cambrex, Walkersville	04-744Q
Flask T75	Sarstedt	83.1813.502
Flask T175	Sarstedt	83.1812.502
Actinomycin D	Sigma Chemical Co.	A9415-2mg
PBS	Lifetechnologies	14190-144
0.22 µm filter	Sarstedt	83.1826.001
Annexin-VCy5	BD Pharmagen	559933
FACS flow solution	BD Bio-sciences	342003
Fluorescent microbeads (1 µm)	Molecular Probes	T8880
Polysterene counting beads (7 µm)	Bangs laboratories	PS06N/6994
Polypropylene FACS tubes	Falcon	352058
1 ml pipet	Fisher	13-678-11B
5 ml pipet	Falcon	357543
25 ml pipet	Ultident	DL-357551
1.5 ml conical polypropylene micro tube	Sarstedt	72.690
15 ml conical polypropylene tube	Sarstedt	62.554.205
50 ml conical polypropylene tube	Sarstedt	62.547.205
50 ml high speed polypropylene copolymer tube	Nalgene	3119-0050
250 ml high speed polypropylene bottle	Beckman	356011
Protein assay (Bradford assay)	Bio-Rad Laboratories	500-0006
Protein assay standard II	Bio-Rad Laboratories	500-0007
Test tube 16 x 100	VWR	47729-576
Test tube 12 x 75	Ultident	170-14100005B
Cell incubator	Mandel	Heracell 150
Low speed centrifuge	IEC	Centra8R
High speed centrifuge	Beckman	Avanti J8
High speed rotor for 250ml bottle	Beckman	JLA16.250
High speed rotor for 50ml tube	Beckman	JA30.50
Fow cytometry	BD Bio-sciences	FACS Calibur
Spectrophotometer	Beckman	Series 600
Bronchial tissue explants and sections
C57BL/6 mice (5-7 weeks old)	Charles River Laboratories, Inc.
Mouse Airway PrimaCell™ System:	CHI Scientific, Inc.	2-82001
Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades	Becton Dickinson AcuteCare	371310	#10
Scalpel Handle	Fine Science Tools Inc.	10003-12	#7
phase-contrast inverted microscope	Olympus Optical CO., LTD.	CK2
high O2 gas mixture	VitalAire Canada Inc.
modular incubator chamber	Billups-Rothenberg Inc.	MIC-101
MaxQ 4000 incubated orbital shaker	Barnstead Lab-Line,	SHKA4000-7
12-well tissue culture plate	Becton Dickinson and Company	353043
Plastic tissue culture dishes (100 mm)	Sarstedt, Inc.	83.1802
Surgical scissors	Fine Science Tools Inc.	14060-09	Straight, sharp, 9cm longth
Half-curved Graefe forceps	Fine Science Tools Inc.	11052-10
humidified CO2 incubator	Mandel Scientific Company Inc.	SVH-51023421
Histopathological examination
formalin formaldehyde	Sigma-Aldrich, Inc.	HT5011
paraffin	Fisher scientific  International, Inc.	T555
ethyl alcohol	Merck KGaA, Darmstadt	EX0278-1
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich, Inc.	G6403
Cacodylate	Sigma-Aldrich, Inc.	31533
microscope slides	VWR Scientific Inc.	48300-025	25x75 mm
Xylene	Fisher scientific  International, Inc.	X5-4
Mayer's hematoxylin	Sigma-Aldrich, Inc.	MHS16	Funnel with filter paper
HCl	Fisher scientific  International, Inc.	A144s-500
eosin	Sigma-Aldrich, Inc.	HT110116	Funnel with filter paper
Permount™ Mounting Medium	Thermo Fisher Scientific Inc.	SP15-100
glass coverslip	surgipath medical industries, Inc.	84503	24×24 #1
TUNEL detection kit	In Situ Cell Death Detection, POD	11 684 817 910
oven	Despatch Industries Inc.	LEB-1-20
rotary Microtome	Leica Microsystems Inc.	RM2145
filter paper	Whatman International Ltd.	1003150	#3
Microscope	Nikon Imaging Japan Inc.	E800
staining dish complete	Wheaton Industries, Inc.	900200	including dish, rack, cover
1.5 ml eppendorf tube	Sarstedt Inc.	72.69	39x10 mm
Orbital and Reciprocating Water Bath	ExpotechUSA	ORS200
phosphate buffered saline	GIBCO	14190-144
fume hood	Nicram RD Service	3707E