Protocoles pour les essais la résistance aux herbicides robuste chez différentes espèces de mauvaises herbes

Résumé

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

Résumé

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

Introduction

Les herbicides sont la mesure de contrôle des mauvaises herbes les plus largement utilisés, ce qui représente jusqu'à 50% du marché de la protection mondiale des plantes ^1. Ils sont des outils relativement bon marché, éviter les pratiques de la culture des sols main-d'œuvre et de temps, et, finalement, aboutir à une production rentable, sûre et rentable alimentaire ^2. Cependant, la grande phénologique et la variabilité génétique présente chez de nombreuses espèces de mauvaises herbes, avec une sur-dépendance sur l'utilisation d'herbicides, se traduit souvent par la sélection des populations de mauvaises herbes résistantes aux herbicides. L'introduction d'herbicides sélectifs avec une cible métabolique très spécifique ^3-5 a considérablement augmenté le nombre de cas de résistance au fil des ans. À ce jour, 240 espèces de mauvaises herbes dicotylédones (140 et 100 monocotylédones) à travers le monde ont développé une résistance aux différents sites d'herbicides d'action (SoA) ^4. Ceci est une préoccupation majeure pour la gestion des mauvaises herbes et plus généralement pour la production agricole durable.

e_content "> La détection précoce de la résistance, basée sur des tests fiables, fréquemment exécutées dans une serre, est une étape clé pour gérer les mauvaises herbes résistantes aux herbicides. Différentes approches ont été développées selon les objectifs, le niveau de précision, le temps et les ressources disponibles nécessaires, comme ainsi que les espèces de mauvaises herbes considérées ^6-12. Toutefois, lorsque la confirmation du statut de la résistance d'un nouveau biotype des mauvaises herbes est nécessaire (par exemple, un groupe d'individus qui partagent plusieurs caractéristiques physiologiques, y compris la capacité de survivre un ou plusieurs herbicides appartenant à un groupe particulier est utilisé à une dose qui, normalement, les contrôler), un dosage biologique robuste de la plante entière doit être effectuée dans un environnement contrôlé ^{4, 11.}

Un biotype est rarement résistant à un seul herbicide. Chaque biotype est donc caractérisé par un profil de résistance certaine, à savoir, le nombre et le type de SoA des herbicides, il est résistant à, et par une résistance donnéeà chaque niveau ¹³ herbicide. La détermination précoce et fiable de la tendance de fond ou une résistance multiple ^{5, 14} est important pour la gestion de la résistance sur le terrain.

Il est à noter que la résistance aux herbicides n'a rien à voir avec la tolérance naturelle que certains présentent des espèces de mauvaises herbes à certains herbicides, par exemple, les espèces de dicotylédones vs herbicides ACCase inhibant, espèces monocotylédones vs 2,4-D, Equisetum arvense vs. glyphosate.

Cet article présente une approche robuste pour tester biotypes résistants aux herbicides putative échantillonnés dans des domaines où un mauvais contrôle par l'herbicide (s) avait été signalée. Variantes pertinentes aux protocoles standards en ce qui concerne les espèces de mauvaises herbes impliqués sont présentés. Les avantages par rapport à d'autres techniques / protocoles basés soit sur ​​des essais biologiques de la plante entière à l'aide de seulement une dose d'herbicide ^15, ou le traitement des graines dans des boîtes de Pétri ⁸ sont liés à la Reliab ultérieureilité et la possibilité de déduire le niveau de résistance en raison de l'inclusion de deux doses d'herbicides dans les expériences. Cependant, pour les tests de résistance de routine, les mêmes méthodes peuvent être appliquées à une seule dose d'herbicide, réduisant ainsi les coûts.

En plus de permettre la confirmation du statut de la résistance, l'information obtenue peut être utilisée à la fois pour optimiser les étapes de recherche suivants et / ou concevoir des stratégies de gestion de la résistance sonores.

Protocole

1. l'échantillonnage des semences et stockage

1. Surveiller les champs cultivés pour la performance de l'herbicide pauvres injustifiée, à savoir, pas en raison de conditions climatiques défavorables ou de traitements herbicides de faible qualité.
2. Prélever un échantillon de semences d'une espèce à la fois et attribuer un code unique. Les graines mûres sont généralement recueillies avant la récolte des cultures de plantes qui avaient survécu au traitement (s) de l'herbicide. Moniteur en temps opportun d'observer si les graines tombent par plante mère à maturité.
3. Remplir un formulaire pour chaque échantillon en indiquant le code unique attribué, nom de l'espèce, la date de collecte, coordonnées GPS, la municipalité, le nom de l'agriculteur, la taille du champ, le niveau d'infestation, la culture, l'herbicide (s) utilisés au cours de la saison et des documents historiques du champ .
4. Récupérer les graines à partir d'au moins 30 plantes choisies au hasard qui sont représentatifs de l'infestation de champ. Assurez-vous que l'échantillon de semence contient au moins 5000 graines matures. Pour un obligatoires outcrossing espèces de mauvaises herbes(Par exemple, Lolium spp. Ou Amaranthus spp.), De réduire le nombre de plantes à 10-15, en gardant le nombre total de graines autour de 5000 ^11.
5. Sous-échantillonner le champ si des taches de mauvaises herbes sont dispersés sur de vastes zones (plus d'un hectare) que les différents biotypes résistant aux herbicides sont sélectionnés.
6. graines de magasins dans des sacs en papier non scellées marquées avec le code unique attribué.
7. Laisser évaporer l'humidité pour, mais ne pas exposer les semences à une température élevée (par exemple, éviter de les laisser dans une voiture sous le soleil) ou à des fluctuations extrêmes de température pour éviter l'induction de dormance secondaire.
8. Clean (enlever les balles, les graines de coque, etc.) et de les stocker à température ambiante dans un endroit sec. Après avoir effectué les premiers tests de résistance, stocker les semences pour de longues périodes de temps dans une pièce sombre à 4 ° C, de préférence dans des sacs de plastique scellés sous vide. De cette manière, les graines de préserver leur viabilité pendant une période beaucoup plus longue.

2. La dormance des graines de rupture

NOTE: La dormance des graines fournit un mécanisme souple et efficace qui permet d'adapter les mauvaises herbes et de persister dans les agro-écosystèmes. Pour lever la dormance et de permettre la germination des graines, différents protocoles doivent être utilisés en fonction des espèces de mauvaises herbes, à savoir le type de dormance ^16.
Il existe trois principales façons d'éliminer la dormance:

1. Vernalisation
   NOTE: Pour obtenir la germination simultanée et la levée des semis, une période de vernalisation de semences allant de quelques jours à une semaine est nécessaire pour éliminer la dormance physiologique de nombreuses espèces:. Par exemple, Amaranthus retroflexus, Chenopodium album, Lolium spp, Avena fatua, Polygonum persicaria , Phalaris paradoxa ^17-19. Une période de jusqu'à 15 jours de plus est nécessaire pour Papaver rhoeas, Cyperus difformis et Ammania coccinea et jusqu'à 30 jours pour les Schoenoplectus mucronatus 20.
   1. Mettez un peu d'eau déminéralisée dans les plats en plastique. Coupez deux couches de papier filtre et les faire tremper dans l'eau, enlever tout excès. Placez les graines séchées à l'air sur le papier. Transférer les plats en plastique à un réfrigérateur à 4 ° C pour la période de temps requise.
2. Scarification
   NOTE: Certaines espèces de mauvaises herbes sont plus récalcitrants à la germination que d'autres en raison de la dormance mécanique, à savoir les caractéristiques du tégument, et nécessitent l'utilisation d'une scarification chimique utilisant de l'acide sulfurique à germer ^21.
   1. Préparer un bêcher avec de l'acide sulfurique concentré (95-98%). Préparez un bécher rempli d'eau. Mettez les graines dans une enveloppe de tissu non-tissé.
   2. Faire tremper par exemple, Echinochloa spp. Ou des graines de sorgho halepense pendant 20 min ou 5 min, respectivement, dans de l'acide sulfurique concentré.
   3. Prenez l'enveloppe sur le bécher en utilisant une paire de pinces et le mettre dans le bécher rempli d'eau. Ouvrez leenveloppe, mettre les graines dans une petite passoire et rincer abondamment sous l'eau courante.
   Variante: A. plantago-aquatica a besoin d'un protocole différent ^{22, 23}
   1. Faire tremper les graines pendant 2 min dans du chloroforme. Rincer les graines avec de l'eau déminéralisée et les sécher avec du papier absorbant. Tremper les graines dans de l'acide sulfurique à 80% pendant 5 min.
   2. Mettez les graines dans une petite passoire et les rincer sous l'eau courante.
3. Post-récolte maturation des graines
   NOTE: Graines d'autres espèces de mauvaises herbes ne germent pas du tout pendant quelques mois après l'échéance, quelle que soit la méthode utilisée pour lever la dormance.
   1. Stocker les graines pendant une période d'au moins 3-4 mois à température ambiante et une faible humidité et suivez les protocoles ci-dessus pour levée de dormance (par exemple, Oryza sativa var. Sylvatica ou P. rhoeas).

3. Germination

1. Placer les semences à germer dans plastic plats contenant 0,6% (m / v) de gélose à 0,1% de nitrate de potassium (KNO ₃₎ ajoutés:
   1. Préparer une solution de gélose à 0,6% + 0,1% de KNO _3, en utilisant de l'eau désionisée. Dissoudre la gélose dans un four à micro-ondes.
   2. Verser la solution d'agar dans des boîtes en plastique. Refroidir le substrat et ensuite mettre dans les graines.
   Variante: Le sol peut également être utilisé en tant que substrat dans des boîtes de plastique. Cette pratique est particulièrement efficace pour Echinochloa spp., S. halepense et Lolium spp.
2. Placer des plats en plastique dans une armoire de germination pendant environ une semaine dans des conditions de lumière et de température en fonction des conditions optimales pour chacune des espèces de mauvaises herbes. Pour la plupart des espèces d'hiver, la plage de température est 15/25 ° C nuit / jour et 12 h photopériode avec des tubes de néon fournissant une densité de photons photosynthétiques Flux (PPFD) de 15-30 pmol m ^-2 s ^-1. Pour de nombreuses espèces d'été, la plage de température est 15/30 ° C la nuit / jour.
   Variante: Some espèces, telles que S. halepense, besoin d'un traitement thermique. Par conséquent après la scarification, les graines de S. halepense sont soumis aux conditions suivantes: cycles de 4 heures à 45 ° C et 20 heures à 24 ° C pendant trois jours dans l'armoire de germination, puis trois jours dans des conditions normales.

4. Semis repiquage et la croissance

1. Transplant quinze à vingt jeunes plants dans des plateaux en plastique (325 x 265 x 95 mm) remplis d'un mélange standard de rempotage (60% loam limoneux, 15% de sable, 15% et 10% agriperlite tourbe - en volume).
   NOTE: Le repiquage, au lieu de l'ensemencement direct, permet un support uniforme des plantes au même stade de croissance à obtenir, ce qui est une condition préalable importante pour optimiser le rendement du traitement herbicide.
2. Identifier chaque plateau avec un code à barres, y compris toutes les informations pour l'identification unique: Code de la population, l'herbicide testé, répliquer nombre et numéro de plateau progressive <./ Li>
3. La place des plateaux dans une des plantes à effet de serre et de l'eau chauffée au besoin pour maintenir le substrat à ou près de la capacité au champ.
   REMARQUE: La température de croissance varie selon les espèces de mauvaises herbes. Souvent tests sont effectués au cours de l'automne / hiver / printemps, si léger est complété en utilisant des lampes de 400 W aux halogénures métalliques, qui fournissent une PPFD d'environ 150 pmol m ^-2 s ^-1 et une photopériode de 12 h ^{24, 19.} Espèces de mauvaises herbes d'été avec C ₄ cycle de photosynthèse nécessitent habituellement intensité lumineuse plus élevée et donc des tests sont effectués en fin de printemps-été ou l'intensité de la lumière complété est d'environ 400 pmol m ^-2 s ^-1 avec une photopériode de 14 h.
4. Utilisez un protocole différent pour certaines espèces de mauvaises herbes qui infestent le riz paddy, par exemple, A. plantago-aquatica, S. et C. mucronatus Difformis comme décrit dans ^22.
   1. Transplanter les plants dans des barquettes en polystyrène avec 24 cellules rondes (de 55 mm de diamètre, 64 mm de profondeur) filconduit avec 60% loam limoneux, 30% de sable et 10% de tourbe (en volume).
   2. Définissez les plateaux dans 12 cm contenants de plastique remplis d'eau profondes et fermé hermétiquement par des tiges en acier inoxydable vissés pour empêcher les flottante (figure 1).
   3. Maintenir le niveau d'eau dans les récipients à 1-2 cm en dessous du niveau de la surface du sol et ajouter 1,5 g de sulfate de cuivre pour chaque récipient (qui contient de 10 à 12 L d'eau) afin d'éviter la prolifération des algues.

5. traitements herbicides

1. Les traitements avec des herbicides de prélevée:
   1. Après environ trois jours dans l'armoire de germination tels que décrits dans la section 3, transplanter les graines en germination dans des bacs en plastique contenant le substrat décrit ci-dessus et couvrir avec une couche de sol (environ 1 cm). Ceci est une étape cruciale afin d'assurer que les semis ne sortiront pas en raison de l'effet de l'herbicide plutôt que d'une profondeur d'enfouissement excessive.
   2. Prenez le substrat au champ capaville en plaçant les plateaux, qui ont quelques trous dans le bas, sur les soucoupes remplis d'eau.
   3. Un jour après la transplantation, les bacs traiter avec l'herbicide de pré-émergence ^25.
   4. Gardez le substrat au niveau ou la capacité de champ proche par addition d'eau au besoin à la fois au-dessus et ci-dessous par capillarité de la soucoupe. Cette procédure favorise la permanence de l'herbicide à la profondeur appropriée (par exemple, où les graines en germination sont) d'une bonne efficacité du traitement.
2. Les traitements avec des herbicides de post-levée:
   1. Vaporiser les plantes quand elles atteignent le stade 2-3 feuilles (ie, le stade de croissance 12-13 de l'échelle de croissance BBCH Extended ^26).
   2. A partir du jour après le traitement, régler le système d'irrigation selon les besoins en eau des espèces de mauvaises herbes et de la saison (par exemple, pour Echinochloa spp., Il fournit de l'eau pendant 3 minutes 4 fois par jour, à intervalles réguliers, de 9 h à 9 h). L'eau est DIScontribué à l'aide d'un système d'irrigation par aspersion automatique.
      Variante: le glyphosate est appliqué à l'usine BBCH stade 14-21.
3. la préparation de l'herbicide et de la distribution.
   REMARQUE: Tous les herbicides (pré- et post-levée) sont appliquées en tant que formulations commerciales avec des tensioactifs à deux doses recommandées, la dose recommandée de champ (1x) et trois fois (3x).
   1. Si nécessaire, préparer la solution d'agent tensio-actif en vrac, selon les instructions de l'étiquette; la concentration finale est généralement exprimé comme un pourcentage du volume final (par exemple, 0,3%) ou que le volume à distribuer par unité de surface (par exemple, une L ha ^-1).
   2. Utiliser la solution d'agent tensio-actif en tant que solvant pour la solution herbicide (soluté) afin de maintenir la bonne concentration de l'ingrédient actif. Préparer la solution de l'herbicide le plus concentré premier (3x). Calculer la quantité de produit commercial à être dissous dans la solution d'agent tensio-actif (ou dans de l'eau désionisée si unagent tensio-actif est non nécessaire) en utilisant l'équation suivante:
      _herbe Dose = [(Dose _champ x Dose _max) x V _fin] / V _del
      Où: = dose Dose _d'herbes aux herbicides (ml), dose _champ = champ aux herbicides Dose (ml ha ^-1), Dose _max = dose maximale délivrée, V _nageoire = volume final de la solution (L), V _del = volume délivré par le banc pulvérisateur (L ha ^-1).
   3. Diluer (2: 1, v / v) de la solution herbicide 3x pour préparer le concentré moins une (1 x). Cette procédure réduit le risque de faire des erreurs lors de la pesée ou de pipetage des herbicides. concentration de la solution de l'herbicide est exprimée par le volume à distribuer par unité de surface (L ^{ha -1).}
   4. Lancer la séquence de traitement avec la dose d'herbicide inférieure (1x). De cette façon, il n'y a pas besoin de laver l'armoire de pulvérisation entre deux traitements avec le même herbicide.
   5. Distribuer la solutio herbiciden aide d'un pulvérisateur de précision banc délivrer 300 L ha ^-1 (± 1%), à une pression de 215 kPa, et une vitesse de 0,75 m sec ^-1, avec un boom équipé de trois ventilateurs plat (gamme étendue) des buses hydrauliques .
   6. Laver l'armoire de pulvérisation deux fois lorsque l'herbicide est modifié en utilisant l'eau de Javel à 1% (v / v), puis rincez.
      Variante: le glyphosate est appliqué avec un volume de pulvérisation de 200 L ha ^{-1 27.}
      REMARQUE: Une attention particulière doit être payée lorsque herbicides hautement biologiques, tels l'sulfométuron ou flazasulfuron sulfonylurées, sont utilisés. Dans ce dernier cas faire un lavage avec une solution d'eau de Javel et l'autre avec de l'ammoniac (2,5% v / v), suivi d'un rinçage avec de l'eau prudent.

6. Collecte et Analyse des données

1. Grâce à un lecteur de code à barres, qui identifie automatiquement chaque plateau, enregistrer le nombre de plantes qui ont survécu au traitement ainsi que la biomasse estimée Visuel (VEB). Les plantes sont culEssed comme étant morts si elles ne montrent pas de croissance active indépendamment de la couleur ou d'une autre apparence.
   1. Procéder à l'évaluation de trois ou quatre semaines après traitement (WAT) en fonction des herbicides testés (par exemple, pour trois WAT inhibiteurs ACCase et quatre WAT pour des inhibiteurs de l'ALS ou le glyphosate).
   2. Évaluer l'efficacité générale de traitement en incluant une population sensible (vérifiez S) dans toutes les expériences, à savoir, une population recueillie dans un site qui n'a jamais ou rarement traitées avec des herbicides.
   3. La survie des plantes Express comme pourcentage du nombre de plantes traitées, compté juste avant le traitement à l'herbicide, et de calculer l'erreur standard (SE) par valeur moyenne (valeur des deux répétitions signifie).
   4. Le VEB est obtenue par une comparaison visuelle de la biomasse végétale entre les traités et le contrôle de la même population ^{25, 28} non-traitées. Une note, allant de 10 pour les plantes ne sont pas affectées par l'herbicide (par rapport au chèque non-traitée) à 0 quandles plantes sont bien morts, est remis à chaque bac traité.
2. populations attribuent à quatre catégories basées sur les résultats obtenus à partir de traitements avec deux doses d'herbicides: S lorsque moins de 5% des plantes ont survécu à l'1x doses d'herbicide, SR où les survivants ont varié de 5% à 20% à 1x doses d'herbicides, R Lorsque plus 20% des plantes ont survécu aux 1x doses d'herbicides et RR où les survivants sont plus de 20% à la dose d'herbicide 1x et plus de 10% à la dose d'herbicide 3x ^17.

Résultats

Pour évaluer l'état de résistance d'une population résistante putative, il est fondamental d'inclure un chèque sensibles dans le test afin de vérifier l'efficacité de l'herbicide. Les résultats d'un test de dépistage effectués sur P. populations rhoeas, une mauvaise herbe qui infestent les champs de blé, sont rapportés dans la figure 2, où l'efficacité de quatre herbicides de post-levée sur un chèque sensibles (09-36) et d'une résistante...

Discussion

Plusieurs étapes dans les protocoles sont essentiels pour une évaluation réussie de la résistance aux herbicides dans une population: 1) les graines doivent être prélevés à maturité à partir de plantes qui avaient survécu au traitement (s) de l'herbicide. Maturation des graines sur la plante mère est cruciale pour éviter des difficultés dans la germination des graines plus tard; 2) la bonne conservation des semences est recommandé d'éviter la prolifération de moisissures qui pourraient empêcher...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paper bags	Celcar SAS
Plastic dishes	ISI plast S.p.A.	SO600	Transparent plastic
Sulfuric acid 95-98%	Sigma-Aldrich	320501
Non-woven fabric	Carretta Tessitura	Art.TNT17	Weight 17 g m-2
Chloroform >99.5%	Sigma-Aldrich	C2432
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Potassium nitrate >99.0%	Sigma-Aldrich	P8394
Plastic containers	Giganplast	1875/M	600 x 400 x 110 mm
Plastic trays	Piber plast	G1210A	325 x 265 x 95 mm
Polystyrene trays	Plastisavio	S24	537 x 328 x 72 mm, 24 round cells (6x4)
Copper sulfate	Sigma-Aldrich	451657
Agriperlite	Blu Agroingross sas	AGRI100
Peat	Blu Agroingross sas	TORBA250
Germination cabinet	KW	W87R
Nozzles	Teejet	XR11002-VK, TP11001-VH	The second type of nozzles are used only for glyphosate
Barcode generator	Toshiba TEC	SX4
Labels with barcode	Felga	TT20200	Stick-in labels with rounded corners
Barcode reader	Cipherlab	8300-L	Portable data terminal
Bench sprayer			Built in house
Herbicides included in the results:
Commercial product	Active ingredient	Company	Comments
Altorex	imazamox	BASF
Azimut	florasulam	Dow AgroSciences
Biopower		Bayer Crop Science	Surfact to be used with Hussar WG
Dash		BASF	Surfact to be used with Altorex
Granstar	tribenuron-methyl	Dupont
Gulliver	azimsulfuron	Dupont
Hussar WG	iodosulfuron	Bayer Crop Science
Nominee	bispyribac-Na	Bayer Crop Science
Roundup	glyphosate	Monsanto
Trend		Dupont	Surfact to be used with Granstar and Gulliver
Viper	penoxsulam	Dow AgroSciences
Weedone LV4	2,4-D	Isagro