Протоколы Прочная гербицидам тестирования в различных сорняков

Резюме

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

Аннотация

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

Введение

Гербициды наиболее широко используется борьба с сорняками мера, на которые приходится до 50% рынка защиты растений в мире ^1. Они относительно недорогие инструменты, избегать трудоемких и трудоемким почвы практики выращивания, и в конечном итоге привести к экономически эффективным, безопасным и выгодным пищевой продукции ^2. Тем не менее, большая фенологические и генетическая изменчивость присутствует во многих видов сорняков, вместе с чрезмерной зависимости от использования гербицидов, часто приводит к выбору устойчивых к гербициду населения сорняков. Введение селективных гербицидов с очень конкретной цели метаболического ^3-5 резко увеличилось количество случаев сопротивления на протяжении многих лет. На сегодняшний день, 240 видов сорняков (140 двудольных и однодольных 100) по всему миру развивались устойчивость к гербицидам разных сайтах действий (SOA) ^4. Это главная забота для борьбы с сорняками и более в общем для устойчивого производства сельскохозяйственных культур.

e_content "> Раннее обнаружение сопротивления на основе надежных тестов, часто выполняемых в теплице, является ключевым шагом в управлении устойчивые к гербицидам сорняков. Различные подходы были разработаны в соответствии с целями, необходимого уровня точности, времени и имеющихся ресурсов, а а также видов сорняков считается ^6-12. Тем не менее, когда подтверждение статуса сопротивления новой сорняками биотипу требуется (т.е. группа лиц, которые имеют несколько физиологических характеристик, в том числе способность к выживанию одного или более гербицидов, принадлежащие к Особую группу использовали в дозе, которые обычно контролируют их), прочный целое растение биоанализа должна быть выполнена в контролируемой среде ^{4, 11.}

Биотип редко устойчивы только к одному гербициду. Каждый биотипа поэтому характеризуется определенной схеме сопротивление, т.е., количество и тип SoA гербицидов Он устойчив к и от данного сопротивленияУровень каждой гербицида ^13. Ранний и надежное определение образцу креста или множественной резистентностью ^{5, 14} имеет важное значение для управления полевой устойчивости.

Стоит отметить, что сопротивление гербицида не имеет ничего общего с естественной толерантности, что некоторые виды сорняков экспонат к некоторым гербицидам, например, двудольных видов против АССаза ингибирующих гербицидов, видов однодольных против 2,4-D, полевого хвоща против глифосата.

Эта статья представляет собой жесткий подход для тестирования предполагаемый устойчивые к гербицидам биотипов, отобранных в тех областях, где были зарегистрированы плохой контроль по гербицида (ов). Соответствующие варианты в стандартных протоколов в отношении видов сорняков, участвующих представлены. Преимущества более альтернативных методов / протоколов на основе либо в целых растений биоанализа с использованием только одну дозу гербицида, ¹⁵ или обработки семян в чашках Петри ⁸ связаны с более высокой reliability и возможность выведения уровень сопротивления из-за включения двух гербицидов дозах в экспериментах. Тем не менее, для обычного тестирования сопротивления, те же методы могут быть применены только в одной дозе гербицида, таким образом уменьшая затраты.

А также позволяет подтверждение статуса сопротивления, полученная информация может быть использована для оптимизации и следующие шаги исследований и / или разработке эффективных стратегий управления стойкость.

протокол

1. Отбор проб и семян хранения

1. Монитор возделанные поля для необоснованного плохой работы гербицидов, то есть не из-за неблагоприятных климатических условий или низких гербицидов качества.
2. Сбор семян выборку из одного вида в то время, и назначить уникальный код. Зрелые семена, как правило, собранные до уборки урожая с растений, которые выжили лечения (ы) к гербицидам. Своевременное монитор для наблюдения, если семена пролил материнского растения, когда зрелый.
3. Заполните форму для каждого образца с указанием присвоенного уникальный код, название вида, даты сбора, координаты GPS, муниципалитет, имя фермера, размер поля, уровень заражения, культуры, гербицид (ы), используемых в течение сезона и исторических записей поля ,
4. Собирают семена от не менее 30 случайно выбранных растений, которые являются репрезентативными поле инвазии. Убедитесь, что образец семян содержит по меньшей мере 5000 зрелых семян. Для облигатных скрещивания видов сорняков(Например, Lolium SPP. Amaranthus или SPP.), Уменьшить количество растений до 10-15, сохраняя общее количество семян около 5000 ^11.
5. Суб-образец поле, если патчи сорняков разбросаны на больших площадях (более гектара) выбраны в качестве различных Гербицидустойчивые биотипы.
6. Семена Хранить в негерметичных бумажные мешки меченных уникальный код, присваиваемый.
7. Разрешить влаге испариться, но не подвергайте семена с высокой температурой (например, не оставлять их в машине под солнцем) или к экстремальным температурным колебаниям, чтобы избежать индукции вторичного покоя.
8. Чистый (удалить семена плевел, де-Халл, и т.д.) и сохранять их при комнатной температуре в сухом помещении. После проведения первых испытаний сопротивления, хранить семена в течение длительного периода времени в темной комнате при температуре 4 ° С, предпочтительно в вакуумной запечатанных полиэтиленовых пакетах. В этом случае семена сохраняют жизнеспособность в течение значительно более длительного времени.

2. Семенной состояния покоя

ПРИМЕЧАНИЕ: покоя семян обеспечивает гибкую и эффективную механизм, который позволяет адаптировать сорняки и сохраняются в агроэкосистемах. Чтобы разорвать покоя и позволяют прорастание семян, различные протоколы должны быть использованы в зависимости от видов сорняков, т.е. типа покоя ^16.
Есть три основных способа удаления покоя:

1. Яровизация
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения одновременное прорастание и появление всходов, в период посевной яровизации в пределах от нескольких дней до недели необходимо удалить физиологического покоя из многих видов: например,. Амарант запрокинутый, Марь альбомов, Lolium SPP, Овсюг, горца Persicaria , Фаларид рагайоха ^17-19. Длительный срок до 15 дней требуется для мак самосейка, Cyperus difformis и Ammania coccinea и до 30 дней для Schoenoplectus mucronatus 20.
   1. Положите несколько деионизированной воды в пластиковой посуды. Вырезать два слоя фильтровальной бумаги и замочить их в воде, снять излишки. Поместите воздушные сушат семена на бумаге. Передача пластиковой посуды в холодильнике при 4 ° С в течение требуемого периода времени.
2. Скарификация
   Примечание: Некоторые виды сорняков, более непокорных к прорастанию, чем другие из-за механического покоя, т.е. семян характеристик покрытия и необходимость использования химической скарификацией с использованием серной кислоты, чтобы прорасти ^21.
   1. Приготовьте стакан с концентрированной серной кислотой (95-98%). Подготовьте стакан, полный воды. Положите семена в конверт из нетканого материала.
   2. Замачивание например, Echinochloa SPP., Или сорго семена halepense в течение 20 мин или 5 мин, соответственно, в концентрированной серной кислоте.
   3. Возьмите конверт из стакана с помощью пинцета и положите его в стакан с водой. Открытьконверт, положить семена в небольшом дуршлаг и тщательно промойте их под проточной водой.
   Вариант: А. Plantago-адиаИса необходим другой протокол ^{22, 23}
   1. Замочите семена в течение 2 мин в хлороформе. Промыть семена деионизированной водой и высушите их с впитывающей бумагой. Замочить семена в 80% -ной серной кислоты в течение 5 мин.
   2. Положите семена в небольшом дуршлаг и тщательно промойте их под проточной водой.
3. Послеуборочная созревания семян
   ПРИМЕЧАНИЕ: Семена других видов сорняков не прорастают вообще в течение нескольких месяцев после наступления срока платежа, независимо от метода, используемого для нарушения покоя.
   1. Храните семена в течение, по крайней мере 3-4 месяцев при комнатной температуре и низкой влажности, а затем следуйте приведенным выше протоколы для состояния покоя (например, Oryza Sativa вар. Sylvatica или P. rhoeas).

3. прорастание семян

1. Место семена проращивают для в платик блюда, содержащие 0,6% (м / об) агар с 0,1% нитрата калия (KNO ₃₎ добавил:
   1. Приготовьте раствор агара 0,6% + 0,1% KNO ₃ деионизированной воды. Растворите агар в микроволновой печи.
   2. Налейте раствор агара в пластиковой посуды. Охладить субстрат, а затем положить в семенах.
   Вариант: почвы также может быть использован в качестве субстрата в пластиковых чашках. Эта практика особенно эффективна для Echinochloa SPP., С. halepense и Lolium SPP.
2. Поместите пластиковые блюда в шкафу прорастания около недели с условиями освещенности и температуры в зависимости от оптимальных условий для каждого вида сорняков. Для большинства зимних видов температурный диапазон 15/25 ° C ночь / день и 12 часов фотопериод с неоновыми трубками, обеспечивающими плотность фотосинтетического потока фотонов (PPFD) 15-30 мкмоль м ^-2 с ^-1. Для многих летних видов, температурный диапазон 15/30 ° C ночь / день.
   Вариант: Sекоторые виды, такие как S. halepense, должны тепловую обработку. Поэтому после скарификации, семена S. halepense подвергаются следующих условиях: циклы 4 ч при 45 ° С и 20 ч при 24 ° С в течение трех дней в прорастания кабинета, а затем три дня в нормальных условиях.

4. Рассада Пересадка и рост

1. Пересадка пятнадцати до двадцати саженцы в пластиковых лотках (325 х 265 х 95 мм), заполненной стандартной смеси заливки (60% пылевато-суглинистой почве, 15% песка, 15% agriperlite и 10% торфа - по объему).
   Примечание: Пересадка, вместо непосредственного посева, позволяет равномерное стояния растений на той же стадии роста, которые будут получены, что является важным условием для оптимизации производительности обработки гербицидом.
2. Определить каждый лоток со штрих-кодом, включая всю информацию для уникальной идентификации: код населения, гербицид испытывается, повторить номер и прогрессивного номер лотка <./ LI>
3. Место лотки в отапливаемых теплиц и водных растений, необходимых для поддержания подложки или вблизи потенциала поля.
   Примечание: температура роста варьирует в зависимости от вида сорняков. Часто испытания проводятся в осенне / зима / весна, так свет дополняется использованием 400 Вт металлогалогенные лампы, которые обеспечивают PPFD около 150 мкмоль м ^-2 с ^-1 и 12 ч фотопериода ^{24, 19.} Видов сорных Лето с С ₄ фотосинтеза цикл, как правило, требуют более высокую интенсивность света и, следовательно, испытания проводятся в конце весны-лета или дополнить интенсивность света составляет около 400 мкмоль м ^-2 с ^-1 с 14 ч фотопериода.
4. Используйте другой протокол для некоторых видов сорняков, паразитирующих рисовые, например, А. Plantago-адиаИса, С. mucronatus и С. difformis, как описано в ^22.
   1. Пересадка рассады в полистирола лотки с 24 круглыми клетками (диаметр 55 мм, 64 мм глубиной) FILпривело 60% пылевато-суглинистой почве, 30% песка и 10% торфа (по объему).
   2. Установите лотки в 12 см глубиной пластиковые контейнеры, заполненные водой и задранной на резьбовых стержней из нержавеющей стали, чтобы предотвратить их плавающей (рисунок 1).
   3. Поддержание уровня воды в контейнерах на 1-2 см ниже уровня поверхности почвы и добавить 1,5 г сульфата меди в каждом контейнере (который содержит 10-12 л воды), чтобы избежать увеличения количества водорослей.

5. гербицидов

1. Процедуры с предварительно гербицидов:
   1. После примерно трех дней в прорастания кабинета, как описано в разделе 3, пересадить прорастающие семена в пластиковых лотках, содержащих субстрат, описанный выше, и покрыть слоем почвы (около 1 см). Это очень важный шаг для того, чтобы гарантировать, что саженцы не будут возникать из-за эффекта гербицида, а не чрезмерного заглубления.
   2. Возьмите подложку поля Капагород путем размещения лотков, которые имеют несколько отверстий на дне, на тарелках, заполненных водой.
   3. Однажды после пересадки, лечить лотки с довсходовой гербицида ^25.
   4. Держите субстрат на или вблизи потенциала поля, добавляя воду по мере необходимости и сверху и снизу от капиллярного блюдце. Эта процедура способствует постоянство гербицида на нужную глубину (то есть, где прорастающие семена) для хорошей эффективности лечения.
2. Процедуры с послевсходовых гербицидов:
   1. Спрей растений, когда они достигают стадии 2-3 листьев (т.е. стадии роста 12-13 расширенного масштаба роста ВВСН ^26).
   2. Начиная со следующего дня после лечения, установить систему орошения соответствии с требованиями водных видов сорняков и сезона (например, для Echinochloa SPP. Это доставляет воду на 3 мин 4 раза в день, через равные промежутки времени с 9 утра до 9 вечера). Вода дисняются с помощью автоматической системы орошения дождеванием.
      Вариант: глифосат применяется на заводе стадии BBCH 14-21.
3. Подготовка и распространение гербицидов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все гербициды (пре- и пост-всходов) применяются в качестве коммерческих препаратах с рекомендованными поверхностно на две дозы, рекомендуется доза поле (1x) и в три раза, что (3x).
   1. При необходимости, подготовить раствор ПАВ в объеме в соответствии с инструкциями на этикетках; конечная концентрация обычно выражается в процентах от конечного объема (например, 0,3%) или в объеме, который будет распространен на единицу площади (например, 1 л га ^-1).
   2. Используйте раствор ПАВ в качестве растворителя для гербицида (растворенное вещество) раствора для того, чтобы сохранить правильную концентрацию активного ингредиента. Подготовка наиболее концентрированного раствора гербицида, первый (3x). Рассчитать количество коммерческий продукт должен быть растворен в растворе поверхностно-активного вещества (или в деионизованной воде, еслиПоверхностно-активное вещество не является необходимым), используя следующее уравнение:
      Доза _трава = [(доза _поле х доза _макс) х V _{плавник]} / _V-дель-
      Где: Доза _травы гербицид = доза (мл), доза доза _поле = гербицид поле (га ^-1 мл), доза _макс = максимальная доза доставлены, V _ребра = Окончательный объем раствора (L), V = объем _дель сделанному скамья опрыскиватель (L га ^-1).
   3. Развести (2: 1, об / об) гербицидным раствором 3 раза, чтобы подготовить менее концентрированную один (1x). Эта процедура уменьшает шанс сделать ошибки при взвешивании или пипетки гербициды. Раствор концентрации гербицида выражена как объем, который будет распространен на единицу площади (л га ^-1).
   4. Начало последовательность обработки с более низкой дозе гербицида (1x). Таким образом, нет необходимости промывать распыления шкаф между двумя группами лечения с тем же гербицида.
   5. Распределить гербицид SOLUTIOп использовании Precision Настольные распылитель поставляя 300 L га ^-1 (± 1%), при давлении 215 кПа и скорости 0,75 м с ^-1, с бумом оснащен тремя плоскими вентилятора (Extended Range) гидравлических насадок ,
   6. Промыть корпус распыления в два раза, когда гербицид изменить с помощью хлорной извести на 1% (об / об), а затем промыть.
      Вариант: глифосат применяется с объемом распыления 200 л га ^{-1 27.}
      ПРИМЕЧАНИЕ: Особое внимание должно быть уделено при высокой биологической гербициды, такие сульфометурон или флазасульфурон сульфонилмочевины используются. В последнем случае сделать одну промывание раствором хлорной и другой с аммиаком (2,5% об / об), с последующим тщательным ополаскиванием водой.

6. Сбор и анализ данных

1. Через считывания штрих-кода, который автоматически идентифицирует каждый лоток, запишите количество растений, которые пережили лечение, а также визуального Ориентировочная биомассы (ВЭБ). Растения задницуessed как мертвые, если они не показывают активный рост, независимо от цвета кожи или другой внешний вид.
   1. Сделать оценку три или четыре недели после лечения (WAT) в зависимости от гербицидов проверенных (например, три WAT ингибиторов АССазы и четыре WAT ингибиторов ALS или глифосата).
   2. Оценить общую эффективность лечения путем включения восприимчивого населения (проверьте S) во всех экспериментах, то есть население, собранную на сайте, который не был редко или обрабатывают гербицидами.
   3. Экспресс выживание растений в процентах от количества обработанных растений, подсчитывали непосредственно перед обработкой гербицидом, и вычислить стандартную ошибку (SE) за среднее значение (среднее значение из двух повторностей).
   4. ВЭБ получается через визуальное сравнение растительной биомассы между обработанных и не обработанных проверку того же населения ^{25, 28.} А счет, начиная с 10 для растений, не затронутых гербицида (по сравнению с не обработанной проверки) до 0 когдарастения явно мертв, дается каждого лотка лечение.
2. Приписывать населения к четырем категориям на основе результатов, полученных из процедур с двумя гербицидам дозах: S, когда менее чем 5% растений пережили 1x гербицид дозы, SR когда выжившие в диапазоне от 5% до 20% на 1х доз гербицидов, R, когда более чем 20% растений сохранились 1x дозы гербицидов и RR, когда оставшиеся в живых более 20% при гербицид дозы 1x и более 10% в дозе гербицида 3x ^17.

Результаты

Чтобы оценить состояние сопротивления предполагаемого стойкого населения, очень важно, чтобы включать в себя неустойчивого в анализе с целью проверки эффективности гербицида. Результаты скринингового теста, проведенные на P. населения rhoeas, сорняк засоряет поля пшеницы, сооб...

Обсуждение

Несколько шагов в протоколах имеют решающее значение для успешной оценки устойчивости к гербицидам в популяции: 1) семена должны быть собраны, когда зрелый из растений, которые выжили лечения (ы) к гербицидам. Созревание семян на материнском растении важно избегать трудностей в прораст...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paper bags	Celcar SAS
Plastic dishes	ISI plast S.p.A.	SO600	Transparent plastic
Sulfuric acid 95-98%	Sigma-Aldrich	320501
Non-woven fabric	Carretta Tessitura	Art.TNT17	Weight 17 g m-2
Chloroform >99.5%	Sigma-Aldrich	C2432
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Potassium nitrate >99.0%	Sigma-Aldrich	P8394
Plastic containers	Giganplast	1875/M	600 x 400 x 110 mm
Plastic trays	Piber plast	G1210A	325 x 265 x 95 mm
Polystyrene trays	Plastisavio	S24	537 x 328 x 72 mm, 24 round cells (6x4)
Copper sulfate	Sigma-Aldrich	451657
Agriperlite	Blu Agroingross sas	AGRI100
Peat	Blu Agroingross sas	TORBA250
Germination cabinet	KW	W87R
Nozzles	Teejet	XR11002-VK, TP11001-VH	The second type of nozzles are used only for glyphosate
Barcode generator	Toshiba TEC	SX4
Labels with barcode	Felga	TT20200	Stick-in labels with rounded corners
Barcode reader	Cipherlab	8300-L	Portable data terminal
Bench sprayer			Built in house
Herbicides included in the results:
Commercial product	Active ingredient	Company	Comments
Altorex	imazamox	BASF
Azimut	florasulam	Dow AgroSciences
Biopower		Bayer Crop Science	Surfact to be used with Hussar WG
Dash		BASF	Surfact to be used with Altorex
Granstar	tribenuron-methyl	Dupont
Gulliver	azimsulfuron	Dupont
Hussar WG	iodosulfuron	Bayer Crop Science
Nominee	bispyribac-Na	Bayer Crop Science
Roundup	glyphosate	Monsanto
Trend		Dupont	Surfact to be used with Granstar and Gulliver
Viper	penoxsulam	Dow AgroSciences
Weedone LV4	2,4-D	Isagro