Utilisation d'un multi-compartiment dynamique unique Enzyme Phantom pour les études de hyperpolarisé Agents de résonance magnétique

Résumé

A multi-compartment dynamic phantom is used to simulate some biology of interest for metabolic studies using hyperpolarized magnet resonance agents.

Résumé

Imagerie de substrats hyperpolarisés par résonance magnétique est très prometteur pour l'évaluation clinique des processus biochimiques critiques en temps réel. En raison des contraintes fondamentales imposées par l'état hyperpolarisé, les techniques d'imagerie et de reconstruction exotiques sont couramment utilisés. Un système pratique pour la caractérisation des méthodes d'imagerie dynamique, multi-spectrales est critique nécessaire. Un tel système doit reproductible récapituler la dynamique chimiques des tissus normaux et pathologiques. Le substrat le plus largement utilisé à ce jour est hyperpolarisé [1- ¹³ C] -pyruvate pour l' évaluation du métabolisme du cancer. Nous décrivons un système de fantôme à base d'enzyme qui intervient dans la conversion de pyruvate en lactate. La réaction est initiée par l'injection de l'agent hyperpolarisé en plusieurs chambres à l'intérieur du fantôme, dont chacune contient des concentrations de réactifs qui contrôlent la vitesse de réaction variables. Plusieurs compartiments sont nécessaires pour veiller à ce que imaséquences Ging capturer fidèlement l'hétérogénéité spatiale et métabolique des tissus. Ce système facilitera le développement et la validation des stratégies d'imagerie de pointe en fournissant des dynamiques chimiques qui ne sont pas disponibles à partir de fantômes classiques, ainsi que le contrôle et la reproductibilité qui est pas possible in vivo.

Introduction

L'impact clinique de l' imagerie par résonance magnétique hyperpolarisé (IRM) de ¹³ composés C-étiquetés dépend essentiellement de sa capacité à mesurer les taux de conversion chimique à travers le temps réel résonance magnétique spectroscopie et imagerie spectroscopique ^1-5. Au cours du développement de la séquence et de la vérification, la conversion chimique dynamique est généralement réalisée par l' intermédiaire in vivo ou in vitro dans des modèles ^6-9 qui offrent un contrôle limité et de reproductibilité. Pour le test robuste et assurance de la qualité, un système plus contrôlé qui préserve la conversion chimique endémique de cette mesure serait préférable. Nous décrivons une méthode pour réaliser cette conversion de façon reproductible en utilisant un fantôme enzymatique unique dynamique.

La plupart des études avec hyperpolarisés ¹³ agents C se concentrent sur ​​l' imagerie des substrats hyperpolarisés dans un environnement biologique fonctionnement. Ceci est le choix évident si l'objectif est d'étudier biologiqueal traite ou potentiel pour déterminer l'impact sur les soins cliniques. Cependant, si la caractérisation d' un certain algorithme de traitement du système de mesure ou de données est souhaitée, des modèles biologiques présentent de nombreux inconvénients tels que la variabilité spatiale et temporelle inhérente à ^10. Cependant, les spectres statiques conventionnels manquent de conversion chimique qui entraîne l'intérêt clinique primaire en IRM de substrats hyperpolarisés et ne peuvent pas être utilisés pour caractériser la détection des taux de conversion ou d' autres paramètres dynamiques ^11. L'utilisation d'un système enzymatique unique, nous pouvons fournir une conversion chimique contrôlable et reproductible, ce qui permet un examen rigoureux des stratégies dynamiques d'imagerie.

Ce système est dirigé vers les chercheurs qui développent des stratégies d'imagerie pour les substrats hyperpolarisés et souhaitent caractériser la performance pour la comparaison avec d'autres approches. Si les mesures statiques sont le point final désiré , puis statique ¹³ métabolite C-labled Phantoms will suffit ^11. À l'autre extrémité , si la caractérisation biologique plus complexe est critique pour le procédé (livraison, la densité cellulaire, etc.), des modèles biologiques réels seront nécessaires ^12-14. Ce système est idéal pour l'évaluation des stratégies d'imagerie qui visent à fournir une mesure quantitative du taux apparent de conversion chimique.

Protocole

NOTE: (Phantom Design) Deux 3 ml chambres ont été usinées sur Ultem et munis d'un tube de PEEK (1,5875 mm OD et 0,762 mm ID) pour l'injection et l'échappement. Les chambres ont été placées dans un tube de centrifugeuse de 50 ml remplie d'eau (figure 1). Pour éviter les vides de signaux créés par les bulles, les chambres et les lignes ont été pré remplies avec de l' eau déminéralisée (dH ₂ O).

1. Préparation de la solution

1. Préparer une solution de tampon L (81,3 mM de Tris pH 7,6, NaCl 203,3 mM). Peser 11,38 g Trizma préréglés cristaux pH 7,6 et 11,88 g de NaCl et dissoudre dans 1 L de dH ₂ O.
2. Préparer une solution à 50 mM de NADH. Peser 17,8 mg de sel dipotassique de β-nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) réduite et on dissout dans 280 pl de la solution tampon qui a été préparé dans la première étape.
3. Préparer 250 solution U / ml Enzyme. Peser 78,75 unités d'activité de lactate déshydrogénase (LDH) et dissoudre dans 315 pi de tampon de sTep un.
4. Préparer mélange d'acide pyruvique. Peser 21,4 mg Ox063 radical trityle et dissoudre dans 1,26 g (~ 1 ml) [1- ¹³ C] de l' acide pyruvique.
5. Préparer des milieux de dissolution (40 mM de Tris, pH 7,6, NaOH 40 mM, EDTA 0,27 mM et du NaCl 50). Peser 5,96 g de cristaux Trizma préprogrammées pH 7,6, 1,6 g de NaOH, de l' acide éthylènediaminetétracétique 0,1 g de sel disodique dihydraté (EDTA) et 2,9 g de NaCl et on dissout dans 1 litre dH ₂ O.
6. Préparer une solution de 1:10 gadotéridol (50 mM). Mélanger 1 pl de gadotéridol dans 9 ul de dH ₂ O. Préparation de 8 M ^[13 C] urée. Peser 1,465 5 ^[13 C] urée et dissoudre dans 3 ml dH ₂ O.

2. Préparation de hyperpolarisé pyruvate

1. Dans une coupelle d'échantillon pour un système de polarisation dynamique nucléaire (DNP), une pipette de 0,3 pi de la solution de gadotéridol et 13 mg (~ 10 pi) de la solution d'acide pyruvique.
2. Brièvement remuer ce mélange dans la coupelle d'échantillon avec la pointe de la pipette.
3. Insérez l'échantillon dans le système DNP.
   1. Veiller à la porte au système DNP est fermé. Commencez le processus d'insertion de l'échantillon en cliquant sur le bouton de l'échantillon d'insertion sur la console système DNP. Dans l'assistant d'échantillon sélectionnez échantillon normal et appuyez sur suivant.
   2. Garder la coupelle d'échantillon vertical placer délicatement la tige d'insertion sur la partie supérieure de la coupelle d'échantillon. Lorsque vous êtes invité, ouvrez le système DNP et insérer la coupe dans l'insert de température variable (VTI) en utilisant la tige d'insertion.
   3. Tirer sur le piston à l'extrémité de la tige d'insertion d'un échantillon pour libérer l'échantillon de l'indice de température variable. Retirer la tige d'insertion de l'échantillon à partir du système et cliquez sur le bouton suivant sur la console système DNP.
4. Initier la polarisation.
   1. Cliquez sur le bouton de polarisation de démarrage sur la console système DNP. Dans le RINMR type de logiciel .HYPERSENSENMR pour lancer un logiciel de surveillance de polarisation. Set construire configuration à 1 et appuyez sur Entrée. Cliquez ensuite sur la construction solide up.
   2. Définissez l'emplacement et le nom du fichier de sauvegarde. Sélectionnez le profil pour 13-C dans la liste onglet sur la console du système de DNP vers le bas et cliquez sur suivant. Cochez la case pour goûter pendant l'accumulation, régler l'heure de l'échantillon à 300 s et cliquez sur Terminer.
5. Mesurer 3,85 g (~ 4 ml) des milieux de dissolution soit en volume avec une seringue de 5 ml ou en poids en utilisant une échelle.

3. Préparation de l'enzyme Fantôme

1. Remplir un tube à centrifuger avec ~ 3 ml ^[13 C] une solution d'urée et le placer dans le tube de centrifugation de 50 ml. Remplir le tube de centrifugeuse de 50 ml avec dH ₂ O.
2. Pré-remplir les deux chambres de l' enzyme et les lignes avec dH ₂ O en injectant ~ 3 ml dH ₂ O dans les lignes d'injection du fantôme, en prenant soin de vider les bulles formées.
3. Placer le fantôme dans le centre de l'aimant avec un accès facile aux lignes d'injection. Assurez-vous qu'il ya un certain conteneur pour attraper le liquide qui va évacuer à t il ligne d'échappement.
4. Préparer le mélange d'enzymes de haute activité (mM NADH 17.14, 44.57 U / ml LDH). Mélanger ensemble la solution de NADH 240 ul, solution de LDH 125 ul et 335 ul de tampon et le maintenir dans une seringue de 3 ml qui peut être attaché à la ligne d'injection.
   REMARQUE: une fois combinée avec 500 pl de 40 mM de pyruvate à partir du système de DNP, le volume fantôme final de 1,2 ml avec des concentrations mM pyruvate 16,7 mM, du NADH 10 et 26 U / l de LDH dans une solution tamponnée au Tris avec un pH ~ 7.5.
5. Préparer le mélange activité enzymatique faible (17,14 mM de NADH 26,79 U / ml de LDH) Mélanger 240 solution de NADH ul, solution de LDH 75 ul et 385 ul de tampon et le maintenir dans une seringue de 3 ml séparé qui peut être fixé à la ligne d'injection.
   REMARQUE: une fois combinée avec 500 pl de 40 mM de pyruvate à partir du système DNP le volume fantôme final est de 1,2 ml avec des concentrations mM pyruvate 16,7 mM, du NADH 10 et 15.625 U / l de LDH dans une solution tamponnée au Tris avec un pH d'environ 7,5 .

jove_title "> 4. Exécutez Toute l'assurance qualité (AQ) et positionnement Scans

1. positionnement initial.
   1. Chargez une nouvelle analyse de positionnement FLASH en mode de fonctionnement ^[1 H] mode Volume TX / RX. Modifier mis en place des dimensions à 2: outil de contrôle Spectrometer -> Modifier GS -> Dimensions de configuration -> 2. Appuyez sur GSP sur le contrôle Spectrometer et déplacer fantôme jusqu'à ce que centré sur l'aimant. Appuyez sur STOP puis appuyez GOP sur le contrôle Spectrometer.
2. Numériser Pilot.
   1. Chargez une nouvelle analyse de positionnement de TriPiolt en mode de fonctionnement ^[1 H] mode Volume TX / RX. Position Slice: Scan Control -> Slice Tool-> déplacer les tranches (maintenez M sur une touche et faites glisser, sélectionnez la tranche de se déplacer avec le paquet tranche curseur).
   2. Wobble ¹ H Coil: Outil Spectromètre de configuration -> Acq -> Wobble. Tune and match ¹ H bobine derrière l'aimant et appuyez sur STOP. Tout en maintenant la presse touche Maj du feu de circulation sur la fenêtre de commande de balayage.

5. Configuration Radial Echo Planar Imaging Spectral balayage

1. Chargez une nouvelle radiale écho planar imagerie spectroscopique (radEPSI) scan en mode de fonctionnement ^[13 C] en mode Volume TX / RX. Position Slice: Slice outil sur le contrôle de numérisation et de déplacer les tranches (détiennent M sur une touche et faites glisser, sélectionnez la tranche de se déplacer avec le paquet tranche curseur).
2. Wobble ¹³ C Coil en cliquant sur ​​l' outil de contrôle Spectrometer -> Acq -> Wobble. Réglez le gain du récepteur pour 1000-2000 sur le Spectrometer.
3. Effectuer la vérification du système final. Selon la séquence, observer carbone 13 signal provenant de la chambre de l'urée dans un protocole de scout.
   NOTE: Cela garantit que le système est configuré correctement avant de commencer le processus de dissolution irréversible.

6. Run Dissolution

1. Lorsque le pyruvate a atteint> 90% de polarisation (~ 1 h), les solutions et les fantômes sont prêts, et le balayage est configuré cliquez sur le bouton run de dissolution sur le sy DNPtige console.
2. Lorsque vous êtes invité déplacer le bâton de dissolution dans sa position de fonctionnement et injecter milieu de dissolution. Fermez le système DNP et cliquez sur le bouton fini sur la console système DNP. Déplacer dissolution bâton en position de repos lorsque vous êtes invité, puis cliquez sur Terminer.
3. Lorsque le système DNP délivre le pyruvate hyperpolarisé (~ 2 min après le chauffage démarre) retire 500 pi de la solution de pyruvate dans chacune des seringues de solution concentration d'enzyme haute et basse. Lentement (~ 10 sec) injecter chaque seringue dans une ligne d'injection.
   NOTA: Le balayage aurait pu être lancé avant l'injection ou à tout moment jusqu'à après l'injection de 3 min en fonction du protocole d'analyse utilisé.

Traitement 7. Image

NOTE: Ce fantôme a été conçu pour être utilisé avec de nombreuses stratégies d'imagerie. Voir Figure 2, comme un exemple de la façon dont les images rad-EPSI ont été traitées à l' aide de Matlab.

1. Charger données brutes à partir du fichier fid. Reshape les données en fonction du nombre de projections, lisez les points, échos et compte des données stockées sous forme de paires réelles et imaginaires. Séparer les points d'écho pairs et impairs.
2. soit une transformation de Fourier les échos pairs ou impairs dont les dimensions le long d'écho. identifier visuellement les bandes de fréquences pour les pyruvate et lactate. Par souci de simplicité de la valeur absolue du spectre a été utilisé.
3. Séparer chaque bande de métabolite et transformée de Fourier le long de la direction de codage de fréquence pour obtenir des sinogrammes isolées pour chaque métabolite. radon Inverse transformer les sinogrammes séparés pour produire l'image de l'un lactate ou pyruvate.

Résultats

images 2D Slice sélectives ont été acquises à l'aide d'une séquence de snapshot radEPSI. images métabolites ont été reconstruits à l'aide rétroprojection filtrée. Les images des métabolites sont bien alignés avec les images de protons, comme on le voit sur ​​la figure 2. Ce signal de lactate de système hyperpolarisé ne peut être générée à partir de la conversion enzymatique de la pyruvate hyperpolarisé. Sur la figure 4,

Discussion

imagerie en temps réel des métabolites hyperpolarisés a de nombreux défis uniques pour la conception de la séquence, la validation et le contrôle qualité. La capacité de résoudre l'hétérogénéité spatio-temporelle et spectrale offre un potentiel clinique substantielle, mais exclut les méthodes d'assurance qualité et de validation associés à l'IRM conventionnelle. séquences d'imagerie complexes ou des algorithmes de reconstruction peuvent avoir des dépendances subtiles qui les rendent d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioSpect 7T	Bruker	BioSpec 70/30 USR	7 Tesla Pre-Clinical MRI Scanner
HyperSense	Oxford Instruments	Hypersense DNP Polarizer	Dynamic Nuclear Polarizer for MRI agents
1-13C-Pyrvic Acid	Sigma Aldrich	677175	Carbon 13 labled neat pyruvic acid
Trityl Radical	GE Healthcare	OX063	Free radical used in Dynamic Nuclear Polarization
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Ethylenediaminetetraacetic acid
LDH	Worthingthon	LS002755	Lactate Dehydrogenase from rabbit muscle
NADH	Sigma Aldrich	N4505	β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced dipotassium salt
Trizma	Sigma Aldrich	T7943	Trizma Pre-set crystals
NaCl	Sigma Aldrich	S7653