과분극 자기 공명 에이전트의 연구 다중 구획 동적 단일 효소 팬텀의 사용

요약

A multi-compartment dynamic phantom is used to simulate some biology of interest for metabolic studies using hyperpolarized magnet resonance agents.

초록

자기 공명에 의해 분극 기판의 영상은 실시간으로 중요한 생화학 적 과정의 평가를위한 훌륭한 임상 약속을 보여줍니다. 때문에 분극 상태에 의해 부과 된 근본적인 제약, 이국적인 이미징 및 재건 기술이 일반적으로 사용된다. 동적 멀티 스펙트럼 영상 방법의 특성에 대한 실제적인 시스템이 매우 필요하다. 이러한 시스템은 재현성 정상 및 병적 조직의 중요한 화학적 동역학 요점을 되풀이한다. 현재까지 가장 널리 사용되는 기판은 암 대사 평가 ^[1-13 C] -pyruvate 분극된다. 우리는 젖산을 피루브산의 전환을 매개하는 효소 기반 가상 시스템을 설명한다. 반응은 반응 속도를 조절 시약의 농도를 변화 각각 포함 팬텀 내의 다중 챔버 내로 과분극 제의 주입에 의해 초기화된다. 여러 구획이되도록하는 데 필요한 심상카 서열을 충실하게 조직의 공간 및 신진 대사 이질성을 캡처합니다. 이 시스템은 생체 내에서 할 수 없습니다 화학적 기존의 팬텀에서 사용할 수없는 역학뿐만 아니라 제어 및 재현성을 제공하여 고급 이미징 전략의 개발과 검증에 도움이됩니다.

서문

¹³ C - 표지 화합물의 과분극 자기 공명 영상 (MRI)의 임상 효과는 실시간 자기 공명 분광법과 분광 화상 ^1-5 화학 전환율을 측정 할 수있는 능력에 매우 의존한다. 서열 개발 및 검증 동안 동적 화성는 일반적으로 생체 내에서 또는 제한된 제어와 재현성을 제공하는 시험 관내 모델 ^6-9을 통해 달성된다. 강력한 시험 및 품질 보증이 측정 발병 화성을 보존 더 제어 시스템이 바람직 할 것이다. 우리는 단일 동적 효소 팬텀을 이용하여 재생 가능한 방식으로 상기 전환을 달성하는 방법을 설명합니다.

과분극 ⁽¹³⁾ C 에이전트와 대부분의 연구가 작동하는 생물학적 환경에서 분극 기판 이미징에 초점을 맞 춥니 다. 목표는 생물학을 공부하는 경우는 명백한 선택이다알은 처리 또는 임상 치료에 미치는 영향에 대한 가능성을 결정합니다. 일부 측정 시스템 또는 데이터 처리 알고리즘의 특성이 요구되는 경우, 생물학적 모델은 고유 한 공간 및 시간 변동 ^(10)로서 다수의 결점을 갖는다. 그러나, 종래의 정적 팬텀 과분극 기판 MRI에서 일차 임상 적 이익을 구동 화성이 부족하고, 전환율 또는 다른 동적 파라미터 ^(11)의 검출을 특성화하기 위해 사용될 수 없다. 우리가 동적 촬상 전략 엄격한 시험을 가능하게 제어하고 재현성 화성을 제공하는 단일 효소 시스템을 사용 가능.

이 시스템은 과분극 기판에 대한 이미지 전략을 개발 및 대체 방법에 대한 비교를 위해 성능을 특성화하고자하는 연구자에 관한 것이다. 정적 측정을 원하는 엔드 포인트 인 경우 그 다음 ¹³ C-labled 대사는 위스콘신 정적 팬텀¹¹ 충분할 것이다. 다른 쪽 끝에서 더 복잡한 생물학적 특성은 실제 생물학적 모델이 ^12-14 필요합니다 방법 (배달, 세포 밀도 등)에 매우 중요합니다. 이 시스템은 겉보기 화성 비율의 정량적 측정 값을 제공하는 것을 목표로 촬상 전략의 평가에 적합하다.

프로토콜

참고 : (팬텀 설계) 두 3 ㎖ 챔버 Ultem의에서 가공 및 사출 및 배기 용 PEEK 튜브 (1.5875 mm 외경과 0.762 mm의 ID)를 장착 하였다. 챔버 물 (그림 1) 가득 50 ML의 원심 분리 관에 넣었다. 거품에 의해 생성 된 신호 공극을 방지하기 위해, 챔버와 라인은 탈 이온수 (DH ₂ O) 사전 충전 하였다.

1. 솔루션 준비

1. 1 L의 완충액 (81.3 mM 트리스 pH가 7.6, 203.3 밀리미터의 NaCl)를 준비한다. 아웃 11.38 g 후, Trizma 사전 결정의 pH 7.6와 11.88 g의 NaCl을 달아 DH ₂ O 1 L에 용해
2. 50 mM의 NADH 솔루션을 준비합니다. β - 니코틴 아마이드 아데닌 다이 뉴클레오타이드 (NADH), 감소 된 칼륨 염 17.8 밀리그램을 달아 단계에서 제조 된 완충액 280 μL에 용해.
3. 250 U / ml의 효소 솔루션을 준비합니다. 락 테이트 탈수소 효소 (LDH)의 활성 78.75 단위를 계량 및 S로부터 315 ㎕의 버퍼에 녹여하나를 TEP.
4. 피루브산 믹스를 준비합니다. 21.4 mg의 Ox063 트리 틸 라디칼을 달아 (~ 1 ㎖) [1- ⁽¹³⁾ C] 피루브산 1.26 g에 용해.
5. 용해 미디어를 준비합니다 (40 mM 트리스의 pH 7.6, 40 mM의 수산화 나트륨, 0.27 mM의 EDTA, 50 mM의 염화나트륨). 후, Trizma 미리 결정 산도 7.6의 5.96 g, 수산화 나트륨 1.6 g, 0.1 g 에틸렌 디아민 테트라 아세트산이 나트륨 염에 탈수 (EDTA) 및 2.9 g의 NaCl을 달아 1 L의 DH ₂ O.에 용해
6. 1시 10분 gadoteridol 수용액 (50 mm)를 준비한다. DH ₂ O. 9 μL에 gadoteridol 1 μl를 혼합 8 M ^[13 C] 우레아의 제조. 1.465 (5) ^[13 C] 요소를 달아 3 ㎖ DH ₂ O.에 용해

과분극 피루브산 2. 준비

1. 동적 핵 분극 (DNP) 시스템 피펫 gadoteridol 용액 0.3 μL와 피루브산 용액을 13 mg의 (~ 10 μL)에 대한 샘플 컵.
2. 간단히 피펫 팁과 샘플 컵이 혼합물을 교반한다.
3. DNP 시스템에 샘플을 삽입합니다.
   1. DNP 시스템의 문을 확인하는 폐쇄된다. DNP 시스템 콘솔에 삽입 샘플 버튼을 클릭하여 샘플 삽입 프로세스를 시작합니다. 샘플 마법사에서 다음 정상 시료를 선택하고 Enter 키를 누릅니다.
   2. 샘플 컵을 유지하는 것은 수직 부드럽게 샘플 컵의 맨 위에 삽입 막대를 배치합니다. 메시지가 표시되면 DNP 시스템을 열고 삽입 막대를 사용하여 변수 온도 인서트 (VTI)로 컵을 삽입합니다.
   3. 가변 온도 인덱스 시료를 해제 검체 삽입로드의 단부에 상기 플런저 당겨. 시스템에서 샘플 삽입 막대를 제거하고 DNP 시스템 콘솔에서 다음 버튼을 클릭합니다.
4. 편광를 시작합니다.
   1. DNP 시스템 콘솔에 시작 편광 버튼을 클릭합니다. RINMR 소프트웨어 유형 .HYPERSENSENMR에서 소프트웨어를 모니터링 편광를 시작합니다. 1 구성을 구축하고 Enter 키를 누릅니다 설정합니다. 그리고 고체 빌드를 클릭 유피.
   2. 저장 파일의 위치와 이름을 설정합니다. DNP 시스템 콘솔에 탭 드롭 다운 13-C에 대한 프로파일을 선택하고 다음을 클릭합니다. 300 초에 축적하는 동안 설정 샘플 시간을 샘플링하고 마침을 클릭 상자를 선택합니다.
5. 3.85 g을 측정 (~ 4 ml)에 용해 매체 중 5 ML의 주사기와 부피 또는 규모를 사용하여 중량.

효소 팬텀 3. 준비

1. ~ 3 ㎖ ^[13 C] 우레아 용액과 microcentrifuge 관을 입력하고 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 넣습니다. DH ₂ O.로 50 ML의 원심 분리기 튜브를 입력
2. 형성하는 거품을 플러시 돌보는, 3 ㎖ DH 팬텀의 주입 라인에 ₂ O ~ 주입하여 두 효소 챔버와 DH ₂ O와 라인을 사전 입력합니다.
3. 사출 라인에 쉽게 접근 할 수있는 자석의 중심에 팬텀를 놓습니다. T로 밖으로 배출됩니다 액체를 잡기 위해 약간의 용기가 있는지 확인 배기 라인을 그.
4. 고 활성 효소 혼합물 (17.14 mM의 NADH, 44.57 U / ㎖의 LDH)를 준비합니다. 동시에 240 ㎕를 NADH 용액, 125 μL의 LDH 용액 및 335 ㎕의 완충액을 혼합하고 주입 라인에 부착 될 수있는 3 ㎖ 주사기 유지.
   참고 : DNP 시스템에서 40 mM의 피루브산의 500 μL와 결합되면, 최종 팬텀 볼륨 ~ 16.7 mM의 피루브산, 10 mM의 NADH, pH를 가진 트리스 완충 용액에 26 U / L의 LDH의 농도가 1.2 ml의 것입니다 7.5.
5. 낮은 활성 효소 혼합물 (17.14 mM의 NADH 26.79 U / ㎖의 LDH) 함께 240 ㎕의 NADH 솔루션, 75 μL의 LDH 용액 385 μL 버퍼를 혼합하고 주입 라인에 부착 할 수있는 별도의 3 ML의 주사기에 유지를 준비합니다.
   참고 : DNP 시스템에서 40 mM의 피루브산의 500 μL와 결합하면 최종 팬텀 볼륨 ~ 7.5 16.7 mM의 피루브산, 10 mM의 NADH의 농도가 1.2 ml의 pH를 가진 트리스 완충 용액에서 15.625 U / L의 LDH 될 것입니다 .

jove_title "> 4. 어떤 품질 보증 (QA) 및 위치 검사를 실행

1. 초기 위치.
   1. 동작 모드 ^[1 H] TX / RX 볼륨 모드에서 새 FLASH 위치 검색을로드합니다. 2 설정 크기를 변경합니다 분광계 관리 도구 -> 편집 GS -> 설정 치수 -> 2. 분광계 제어에 GSP와 자석의 중앙까지 팬텀 이동합니다. 분광계 제어에 다음을 눌러 STOP을 눌러 GOP.
2. 파일럿 스캔.
   1. 동작 모드 ^[1 H] TX / RX 볼륨 모드에서 새 TriPiolt 위치 검색을로드합니다. 위치 조각 : 스캔 제어 -> 슬라이스 도구 -가> 조각을 이동 (, 슬라이스 패키지 슬라이더 이동을 선택 슬라이스 M에게 키 클릭과 드래그를 개최).
   2. 워블 ¹ H 코일 : 분광계 관리 도구 -> ACQ -> 워블. 조정 및 자석 누릅니다 STOP 뒤에 경기 ¹ H 코일. 시프트 키를 눌러에게 주사 제어 창에서 신호등을 누른 상태.

5. 레이디 얼 에코 평면 스펙트럼 이미징 스캔 설정

1. 새로운 반경 에코 평면 분광 이미징로드 (radEPSI)의 동작 모드 ^[13 C] TX / RX 볼륨 모드로 스캔합니다. 위치 조각 : 스캔 제어에 조각 도구와 이동 조각 (; 슬라이스 패키지 슬라이더 이동을 선택 슬라이스 M에게 키 클릭과 드래그를 개최).
2. 분광계 관리 도구를 클릭하여 워블 ⁽¹³⁾ C 코일 -> ACQ -> 워블. 분광계에 1,000-2,000에 수신기 이득을 설정합니다.
3. 최종 시스템 검사를 수행합니다. 순서에 따라 스카우트 프로토콜의 요소 챔버에서 탄소 13 신호를 관찰합니다.
   참고 :이 시스템이 비가 역적 용해 프로세스를 시작하기 전에 제대로 설정되어 있는지 확인합니다.

6. 실행 해산

1. 피루 베이트는 (~ 1 시간), 솔루션과 팬텀 준비하고 스캔이 DNP 한건데에 실행 용해 버튼을 클릭하여 구성되어> 90 % 편광을 달성하면콘솔 줄기.
2. 시는 작동 위치에 용해 스틱을 이동하고 용해 미디어를 삽입하라는 메시지가. DNP 시스템을 닫고 DNP 시스템 콘솔에 완성 된 버튼을 클릭합니다. 다음 마침을 클릭하라는 메시지가 표시되면 위치를 쉬고 다시 용해 스틱을 이동합니다.
3. DNP 시스템은 과분극 피루브산을 전송할 때 (~ 가열 시작 후 2 분)이 각각 높고 낮은 효소 농도의 용액을 주사기로 피루 베이트 용액 500 μl를 철회. 천천히 (~ 10 초)이 주사 라인에 각각 주입 주사기.
   참고 : 스캔 전에 주입에 또는 언제든지 사용되는 검사 프로토콜에 따라 3 분 후 주입까지 시작되었을 수 있습니다.

7. 이미지 처리

참고 :이 팬텀 많은 이미지 전략을 사용하기 위해 설계되었습니다. 라드-EPSI 이미지가 matlab에를 사용하여 처리 된 방법의 예를 들어, 그림 2 참조하십시오.

1. 버팀대 파일에서 원시 데이터를로드합니다. Resha실수 부 및 허수 쌍으로 저장된 데이터 포인트 에코 및 계정 판독 돌기의 수와 일치하는 데이터 퍼가기. 짝수와 홀수 에코 포인트를 분리합니다.
2. 푸리에는 에코 차원에서 짝수 또는 홀수 에코를 변환. 시각 피루브산과 젖산의 주파수 대역을 식별합니다. 단순성을 위해 스펙트럼의 절대 값을 사용 하였다.
3. 각 대사 밴드를 분리하고 푸리에 각 대사 산물에 대한 격리 sinograms를 얻을 수있는 주파수 인코딩 방향을 따라 변환. 역 라돈은 락 테이트 또는 피루 베이트 하나의 이미지를 생성하기 위해 별도의 sinograms 변환.

결과

슬라이스 선택 2D 이미지 스냅 샷 radEPSI 시퀀스를 사용하여 획득 하였다. 대사 이미지는 다시 여과 투사를 사용하여 재구성 하였다. 도 2에 도시 된 바와 같이 대사 화상이 아니라, 양성자 이미지 정렬 하였다.이 시스템 과분극 락트산 신호에서만 분극 피루브산의 효소 적 전환으로부터 생성 될 수있다. LDH 높은 농도도 4 하부 챔버에서 강한 락트산 ...

토론

과분극 대사 산물의 실시간 영상 시퀀스 설계, 검증 및 품질 관리를위한 많은 고유 한 문제가있다. 시공간 스펙트럼 이질성을 해결하는 능력은 상당한 임상 잠재력을 제공하지만 기존의 MRI와 관련된 품질 보증 및 검증 방법을 배제한다. 복합 촬상 서열 또는 재구성 알고리즘들이 어려운 특징 또는 이미징 실험의 외측을 검증 렌더링 미묘한 종속성을 가질 수있다. 생물학적 얼룩이 다른 실질적인 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioSpect 7T	Bruker	BioSpec 70/30 USR	7 Tesla Pre-Clinical MRI Scanner
HyperSense	Oxford Instruments	Hypersense DNP Polarizer	Dynamic Nuclear Polarizer for MRI agents
1-13C-Pyrvic Acid	Sigma Aldrich	677175	Carbon 13 labled neat pyruvic acid
Trityl Radical	GE Healthcare	OX063	Free radical used in Dynamic Nuclear Polarization
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Ethylenediaminetetraacetic acid
LDH	Worthingthon	LS002755	Lactate Dehydrogenase from rabbit muscle
NADH	Sigma Aldrich	N4505	β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced dipotassium salt
Trizma	Sigma Aldrich	T7943	Trizma Pre-set crystals
NaCl	Sigma Aldrich	S7653