Die Verwendung eines Mehrfach Dynamische einzelner Enzym-Phantom für Studien von hyperpolarisiertem Magnetic Resonance Agents

Zusammenfassung

A multi-compartment dynamic phantom is used to simulate some biology of interest for metabolic studies using hyperpolarized magnet resonance agents.

Zusammenfassung

Imaging von hyperpolarisiertem Substrate durch magnetische Resonanz zeigt große klinische Versprechen für die Bewertung der kritischen biochemischen Prozesse in Echtzeit. Aufgrund grundlegenden Einschränkungen, die durch die hyperpolarisierten Zustand, exotische Bildgebung und Rekonstruktionstechniken häufig verwendet werden, auferlegt. Ein praktisches System für die Charakterisierung von dynamischen, multispektrale Bildgebungsverfahren ist dringend erforderlich. Ein solches System muss die entsprechenden chemischen Dynamik der normalen und pathologischen Gewebe reproduzierbar rekapitulieren. Das am häufigsten verwendete Substrat bisher ist hyperpolarisiertem [1- ¹³ C] -pyruvate zur Beurteilung des Krebsstoffwechsels. Wir beschreiben ein Enzym-basierte Phantomsystem, das die Umwandlung von Pyruvat zu Lactat vermittelt. Die Reaktion wird durch Injektion des hyperpolarisierten Mittel in mehrere Kammern innerhalb des Phantom eingeleitet enthält, von denen jede Konzentrationen von Reagenzien unterschiedlicher dass die Reaktionsgeschwindigkeit steuern. Mehrere Kompartimente sind notwendig, um sicherzustellen, dass imaGing Sequenzen, die die räumliche und metabolische Heterogenität der Gewebe treu zu erfassen. Dieses System wird die Entwicklung und Validierung von Advanced Imaging - Strategien helfen , die durch chemische dynamischen Entwicklungen, die sich von herkömmlichen Phantome nicht verfügbar sind, sowie die Kontrolle und Reproduzierbarkeit , die nicht möglich , in vivo ist.

Einleitung

Die klinischen Auswirkungen von hyperpolarisiertem Magnetresonanztomographie (MRI) von ¹³ C-markierten Verbindungen ist kritisch abhängig von der Fähigkeit chemischen Umwandlungsraten durch Echtzeit - Magnetresonanzspektroskopie und spektroskopische Bildgebung ^1-5 zu messen. Während der Sequenz Entwicklung und Verifizierung wird dynamische chemische Umwandlung im allgemeinen in vivo oder in vitro - Modellen erreicht durch ^6-9 , die begrenzte Kontrolle und Reproduzierbarkeit bietet. Für robuste Prüfung und Qualitätssicherung, eine kontrolliertere System, das die chemische Umwandlung endemisch dieser Messung bewahrt würde bevorzugt werden. Wir skizzieren eine Methode, um diese Umwandlung in reproduzierbarer Weise zu erreichen, ein dynamisches einzelnes Enzym Phantom verwendet wird.

Die meisten Studien mit hyperpolarisierten ¹³ C - Agenten konzentrieren sich auf die Abbildung hyperpolarisiertem Substrate in einer funktionierenden biologischen Umgebung. Dies ist die offensichtliche Wahl, wenn das Ziel biologische zu studierenal-Prozesse oder Potential auf klinische Versorgung für Auswirkungen bestimmen. Wenn Charakterisierung einiger Messsystem oder Datenverarbeitungsalgorithmus jedoch erwünscht ist, haben biologische Modelle zahlreiche Nachteile wie inhärente räumliche und zeitliche Variabilität ^10. Jedoch fehlt konventionellen statischen Phantome die chemische Umwandlung, die die primäre klinischem Interesse in MRI von hyperpolarisiertem Substrate antreibt, und nicht verwendet werden kann , ¹¹ Nachweis von Umrechnungskurse oder andere dynamische Parameter zu charakterisieren. Mit System ein einzelnes Enzym wir steuerbaren und reproduzierbaren chemischen Umwandlung, so dass strenge Prüfung der dynamischen Bildgebung Strategien zur Verfügung stellen kann.

Dieses System ist den Ermittlern gerichtet, die Imaging-Strategien für die hyperpolarisierten Substrate entwickeln und wünschen für den Vergleich mit alternativen Ansätzen Leistung zu charakterisieren. Wenn statische Messungen der gewünschte Endpunkt dann statisch ¹³ C-labled Metaboliten sind Phantome will ¹¹ genügen. Am anderen Ende , wenn komplexere biologische Charakterisierung ist entscheidend für das Verfahren (Lieferung, Zelldichte, etc.) die tatsächlichen biologischen Modelle ^12-14 benötigt werden. Dieses System ist für die Beurteilung der Abbildungsstrategien ideal, die ein quantitatives Maß der scheinbaren chemischen Umwandlungsraten zu liefern wollen.

Protokoll

HINWEIS: (Phantom Design) Zwei 3 ml Kammern wurden aus Ultem bearbeitet und mit PEEK-Schlauch (1,5875 mm Außendurchmesser und 0.762 mm ID) ausgestattet für Einspritzung und Abgas. Die Kammern wurden in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen mit Wasser (1) gefüllt war . Um die Signal Hohlräume geschaffen durch Blasen, die Kammern und die Linien wurden vorgefüllt mit VE - Wasser (dH ₂ O) zu vermeiden.

1. Herstellung der Lösung

1. Bereiten Sie 1 l Pufferlösung (81,3 mM Tris pH 7,6, 203,3 mM NaCl). Man wiegt 11,38 g Trizma voreingestellte Kristalle pH 7,6 und 11,88 g NaCl und lösen sich in 1 l dH ₂ O.
2. Bereiten Sie 50 mM NADH Lösung. Abwiegen 17,8 mg β-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NADH), reduzierte Dikaliumsalz und lösen sich in 280 & mgr; l der Pufferlösung, die man in Stufe hergestellt wurde.
3. Bereiten 250 U / ml Enzymlösung. Abwiegen 78.75 Aktivitätseinheiten von Laktat-Dehydrogenase (LDH) und lösen sich in 315 & mgr; l Puffer von step ein.
4. Bereiten Brenztraubensäure-Mix. Man wiegt 21,4 mg Ox063 Tritylrest und lösen sich in 1,26 g (~ 1 ml) [1- ¹³ C] Brenztraubensäure.
5. Bereiten Auflösungsmedien (40 mM Tris pH 7,6, 40 mM NaOH, 0,27 mM EDTA und 50 mM NaCl). Man wiegt 5,96 g Trizma voreingestellten Kristalle pH 7,6, 1,6 g NaOH, 0,1 g Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz - Dihydrat (EDTA) und 2,9 g NaCl und lösen sich in 1 l dH ₂ O.
6. Bereiten 01.10 Gadoteridol-Lösung (50 mM). Mix 1 & mgr; l von Gadoteridol in 9 & mgr; l dH ₂ O. Herstellung von 8 M ^[13 C] Harnstoff. Man wiegt 1,465 5 ^[13 C] Harnstoff und lösen sich in 3 ml dH ₂ O.

2. Herstellung von hyperpolarisiertem Pyruvate

1. In einem Probenbecher für eine dynamische Kernpolarisation (DNP) -System, Pipetten 0,3 ul der Gadoteridol-Lösung und 13 mg (~ 10 & mgr; l) der Brenztraubensäure-Lösung.
2. Kurz rühren diese Mischung in der Probenschale mit der Pipettenspitze.
3. Probe in die DNP-System ein.
   1. Achten Sie darauf, die Tür zu dem DNP-System ist geschlossen. Beginnen Sie den Einführungsprozess Probe durch den Einsatz Probe-Taste auf der DNP-System-Konsole klicken. Auf der Probe Assistenten auswählen normalen Probe und drücken Sie auf Weiter.
   2. die Probenschale halten vertikal die Einführungsstab über den oberen Teil der Probenschale sanft schalten. Wenn Sie gefragt werden, öffnen Sie das DNP-System und legen Sie die Schale in die variable Temperatureinsatz (VTI), um den Einführungsstab mit.
   3. Ziehen auf den Kolben am Ende des Probeneinführungsstab, die Probe in dem variablen Temperaturindex zu lösen. Entfernen Sie die Probe Einführungsstab aus dem System und klicken Sie auf den nächsten Knopf auf dem DNP-System-Konsole.
4. Starten Sie die Polarisation.
   1. Klicken Sie auf die Start-Polarisation-Taste auf der DNP-System-Konsole. In der RINMR Softwaretyp .HYPERSENSENMR zu starten Polarisation Software zu überwachen. Stellen aufbauen Konfiguration auf 1 und drücken Sie die Eingabetaste. Klicken Sie dann auf solide Bauweise uSeite
   2. Stellen Sie den Speicherort und den Namen der Datei zu speichern. Wählen Sie das Profil für 13-C in der Dropdown-Registerkarte auf der DNP Systemkonsole und klicken Sie auf Weiter. Überprüfen Sie die Box während des Aufbaus, stellen Probenzeit auf 300 Sekunden und klicken Sie auf Finish zu probieren.
5. Auszumessen 3,85 g (~ 4 ml) der Auflösungsmedien entweder durch Volumen mit einer 5 ml Spritze oder eine Gewichtsskala.

3. Herstellung der Enzyme Phantom

1. Füllen Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen mit ~ 3 ml ^[13 C] Harnstofflösung und legen Sie es in der 50 - ml - Zentrifugenröhrchen. Füllen Sie die 50 ml Zentrifugenröhrchen mit dH ₂ O.
2. Vorfüllen die beiden Enzymkammern und die Leitungen mit dH ₂ O von ~ 3 ml dH ₂ O in die Einspritzleitungen der Phantom - Injektion, wobei etwaige Blasen zu spülen gebildet.
3. Legen Sie das Phantom in der Mitte des Magneten mit einfachen Zugang zu den Einspritzleitungen. Stellen Sie sicher, dass es einige Behälter, die Flüssigkeit aufzufangen, wird vent auf t er Abgasleitung.
4. Bereiten Sie eine hohe Aktivität Enzymmischung (17,14 mM NADH, 44.57 U / ml LDH). Mischen Sie 240 ul NADH-Lösung, 125 ul LDH-Lösung und 335 & mgr; l Puffer und halten in einem 3-ml-Spritze, die mit der Einspritzleitung angebracht werden kann.
   HINWEIS: Nachdem mit den 500 ul 40 mM Pyruvat aus dem DNP-System kombiniert, das endgültige Phantomvolumen wird mit pH-Wert in einer trisgepufferte Lösung 1,2 ml mit Konzentrationen von 16,7 mM Pyruvat, 10 mM NADH und 26 U / l LDH sein ~ 7.5.
5. Bereiten Sie eine niedrige Aktivität Enzymmischung (17,14 mM NADH 26.79 U / ml LDH) Mischen Sie 240 ul NADH-Lösung, 75 & mgr; l LDH-Lösung und 385 & mgr; l Puffer und halten in einem separaten 3-ml-Spritze, die mit der Einspritzleitung angebracht werden kann.
   HINWEIS: Nachdem mit den 500 ul 40 mM Pyruvat aus dem DNP-System kombiniert wird die endgültige Phantomvolumen 1,2 ml mit Konzentrationen von 16,7 mM Pyruvat sein, 10 mM NADH und 15.625 U / L LDH in einer Tris-gepufferte Lösung mit pH ~ 7.5 .

jove_title "> 4. Führen Sie irgendwelche Qualitätssicherung (QS) und Positionierung Scans

1. Erste Positionierung.
   1. Legen Sie eine neue FLASH Positionierung Scan in der Betriebsart ^[1 H] TX / RX - Volume - Modus. Ändern einrichten Dimensionen zum 2: Spectrometer Control Tool -> Edit GS -> Setup Dimensions -> 2. Drücken Sie APS auf der Spektrometersteuerung und Phantom bewegen, bis in den Magneten zentriert. Drücken Sie STOP, dann drücken GOP auf der Spektrometersteuerung.
2. Pilot Scan.
   1. Legen Sie eine neue TriPiolt Positionierung Scan in der Betriebsart ^[1 H] TX / RX - Volume - Modus. Position Scheibe: Scan Control -> Scheibe Tool-> Scheiben bewegen (halten Sie M-Taste klicken und ziehen, wählen Sie Slice mit dem Slice-Paket Schieber bewegen).
   2. Wobble ¹ H Spule: Spectrometer Control Tool -> Acq -> Wobble. Tune and match ¹ H Spule hinter dem Magneten und drücken Sie STOP. Halten Sie die Shift-Taste drücken Sie die Ampel auf der Scan-Steuerungsfenster.

5. Radial Echo Planar Spectral Imaging Scanner-Setup

1. Legen Sie einen neuen Radial Echo - Planar - spektroskopischen Bildgebung (radEPSI) Scannen in der Betriebsart ^[13 C] TX / RX - Volume - Modus. Position Scheibe: Scheibe Tool auf dem Scan-Steuerung und bewegen Scheiben (halten Sie M-Taste klicken und ziehen, wählen Sie Slice mit dem Slice-Paket Schieber bewegen).
2. Wobble ¹³ C - Spule durch Spectrometer Control Tool klicken -> Acq -> Wobble. Stellen Sie die Empfängerverstärkung 1000-2000 auf dem Spektrometer.
3. Führen Sie die letzte Systemprüfung. In Abhängigkeit von der Sequenz, Kohlenstoff-13-Signal von dem Harnstoffkammer in Scout-Protokoll beobachten.
   HINWEIS: Dadurch wird sichergestellt, dass das System richtig eingerichtet ist, bevor die irreversible Auflösungsprozess beginnt.

6. Führen Auflösung

1. Wenn das Pyruvat erreicht> 90% Polarisation (~ 1 h), die Lösungen und Phantom sind bereit, und der Scan konfiguriert ist, die Lauf Auflösung Taste auf der DNP sy klickenStamm-Konsole.
2. Wenn Sie gefragt werden, die Auflösung Stick in seine Betriebsstellung bewegen und Lösungsmedien injizieren. Schließen Sie das DNP-System und klicken Sie auf die Schaltfläche Fertig auf dem DNP-System-Konsole. Bewegen Sie die Auflösung wieder aufkleben Position ruht dann auf Fertig stellen klicken.
3. Wenn das DNP-System das hyperpolarisierte Pyruvat liefert (~ 2 min nach dem Erhitzen beginnt) zurückzuziehen 500 ul der Pyruvat-Lösung in jedes der hohen und niedrigen Enzymkonzentration Lösung Spritzen. Langsam (~ 10 sec) injizieren jede Spritze in eine Einspritzleitung.
   HINWEIS: Scannen haben könnte vor der Injektion eingeleitet oder jederzeit bis zu 3 min Nacheinspritzung in Abhängigkeit von der Scan-Protokoll verwendet.

7. Bildverarbeitung

Hinweis: Dieses Phantom für die Verwendung mit vielen Imaging-Strategien entwickelt wurde. Siehe 2, als ein Beispiel dafür , wie die rad-EPSI Bilder wurden mit Matlab verarbeitet.

1. Legen Sie Rohdaten aus der fid-Datei. Reshape die Daten, die die Anzahl der Projektionen zu entsprechen, ausgelesen Punkte, Echos und Konto für so reale und imaginäre Paare gespeicherten Daten. Trennen Sie die geraden und ungeraden Echo Punkte.
2. Fourier-Transformation entweder die geraden oder ungeraden Echos entlang der Echo Dimensionen. Optisch identifizieren für die Pyruvat und Lactat die Frequenzbänder. Der Einfachheit halber wurde der Absolutwert des Spektrums verwendet.
3. Trennen Sie die Metabolit-Band und Fourier-Transformation entlang der Frequenzcodierrichtung isoliert Sinogramme für jeden Metaboliten zu erhalten. Inverse Radon die einzelnen Sinogrammen Transformationsbild von entweder Lactat oder Pyruvat zu erzeugen.

Ergebnisse

Scheibe selektive 2D-Bilder wurden mit einem Schnappschuss radEPSI Sequenz aufgenommen. Metabolit Bilder wurden mit gefilterten Rückprojektion rekonstruiert. Der Metabolit Bilder wurden auch mit Protonenbildern ausgerichtet, wie in 2 zu sehen ist . In diesem System Lactat Signal hyperpolarisiert kann nur aus der enzymatischen Umwandlung von hyperpolarisiertem Pyruvat erzeugt werden. In 4 ist die untere Kammer, wobei höhere LDH - Konzentration, hat eine...

Diskussion

Echtzeit-Bildgebung von hyperpolarisierten Metaboliten hat viele einzigartige Herausforderungen für die Sequenzdesign, Validierung und Qualitätskontrolle. Die Fähigkeit, räumlich-zeitlichen und spektralen Heterogenität zu lösen bietet erhebliche klinische Potenzial aber schließt Methoden QA und Validierung mit herkömmlichen MRI verbunden. Komplexe Bildgebungssequenzen oder Rekonstruktionsalgorithmen können subtile Abhängigkeiten haben, die sie schwierig machen, um außerhalb des Imaging-Experiments zu charakte...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioSpect 7T	Bruker	BioSpec 70/30 USR	7 Tesla Pre-Clinical MRI Scanner
HyperSense	Oxford Instruments	Hypersense DNP Polarizer	Dynamic Nuclear Polarizer for MRI agents
1-13C-Pyrvic Acid	Sigma Aldrich	677175	Carbon 13 labled neat pyruvic acid
Trityl Radical	GE Healthcare	OX063	Free radical used in Dynamic Nuclear Polarization
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Ethylenediaminetetraacetic acid
LDH	Worthingthon	LS002755	Lactate Dehydrogenase from rabbit muscle
NADH	Sigma Aldrich	N4505	β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced dipotassium salt
Trizma	Sigma Aldrich	T7943	Trizma Pre-set crystals
NaCl	Sigma Aldrich	S7653