Synthèse de thermogélifiant Poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtine Composites Sulfate avec Alginate Microparticules pour le génie tissulaire

Résumé

Un injectable échafaudage d'ingénierie tissulaire composé de poly (N-isopropylacrylamide) de sulfate -graft-chondroïtine (PNIPAAm-g-CS) contenant des microparticules d'alginate a été préparé. La force d'adhérence, des propriétés de gonflement et de biocompatibilité in vitro sont analysés dans cette étude. Les techniques de caractérisation développés ici peuvent être applicables à d'autres systèmes thermogélifiants.

Résumé

Biomatériaux injectables sont définis comme des matériaux implantables qui peuvent être introduites dans le corps à l'état liquide et se solidifient in situ. Ces matériaux offrent les avantages cliniques d'être implanté minimalement effractive et facilement former des solides de remplissage de l'espace dans les défauts de forme irrégulière. biomatériaux injectables ont été largement étudiés comme échafauds pour l'ingénierie tissulaire. Cependant, pour la réparation de certaines zones de support de charge dans le corps, tel que le disque intervertébral, échafauds doivent posséder des propriétés adhésives. Cela permettrait de minimiser le risque de dislocation pendant le mouvement et assurer un contact intime avec le tissu environnant, assurant la transmission adéquate des forces. Ici, nous décrivons la préparation et la caractérisation d'un échafaudage composé thermiquement poly sensibles (N-isopropylacrylamide) sulfate -graft-chondroïtine (PNIPAAm-g-CS) et des microparticules d'alginate. Le copolymère PNIPAAm-g-CS forme une solution visqueuse dans l'eau à température ambiante, dans laquelle alginatparticules e sont suspendues pour améliorer l'adhérence. Au-dessus de la température de solution critique inférieure (LCST), environ 30 ° C, le copolymère se forme un gel solide autour des microparticules. Nous avons adapté les procédures biomatériaux de caractérisation standard pour tenir compte de la transition de phase réversible de PNIPAAm-g-CS. Les résultats indiquent que l'incorporation d'/ ml de particules d'alginate de 50 ou 75 mg à 5% (p / v) les solutions PNIPAAm-g-CS quadrupler la force d'adhérence à la traction-PNIPAAm GCS seul (p <0,05). L'incorporation de microparticules d'alginate augmente également de manière significative la capacité de gonflement de PNIPAAm-g-CS (p <0,05), permettant de maintenir un gel de remplissage d'espace à l'intérieur des défauts tissulaires. Enfin, les résultats de la toxicologie in vitro kit de dosage dans le 2,3-bis (2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl) -2H-tétrazolium-5-carboxanilide (XTT) et dosage de la viabilité Vivant / Mort indiquent que le l'adhésif est capable de supporter la survie et la prolifération des encapsulé de rein embryonnaire humain (HEK) 293 caunes sur 5 jours.

Introduction

Biomatériaux injectables sont ceux qui peuvent être commodément administré dans le corps sous forme liquide et se solidifie in situ. De tels matériaux ont été largement appliquée dans la médecine régénératrice, où ils sont utilisés pour délivrer des cellules encapsulées au niveau du site affecté ^1-4 et agir comme une matrice extracellulaire provisoire en trois dimensions pour les cellules ^5. Pour le patient, les biomatériaux injectables sont avantageux parce que les procédures chirurgicales pour l'implantation sont peu invasive et la phase solide peut remplir de forme irrégulière défauts des tissus, ce qui élimine la nécessité pour les implants de taille personnalisée.

Injectabilité peut être réalisée par une variété de mécanismes. Les facteurs externes, comme le pH, ont été étudiés comme un déclencheur pour la formation de gels qui encapsulent les cellules et molécules bioactives ^6-8. Cependant, le pH peut ne pas être le déclencheur le plus pratique à utiliser dans tous les environnements physiologiques. Une autre alterna traditionnelletive pour atteindre injectabilité utilise polymérisation in situ chimique ou réticulation dans. Un groupe a développé un système rédox soluble dans l'eau constitué de persulfate d'ammonium et de N, N, N -tétraméthyléthylènediamine ', N' et l'a utilisé pour faire réagir macromères composé de polyéthylène glycol et de poly (propylène) glycol ^9,10. Zan et al. ¹¹ réseaux chitosane d'alcool polyvinylique injectables développés réticulés avec le glutaraldéhyde. Dans ces systèmes, la cytotoxicité des composés réactifs doit être envisagée, en particulier pour des applications impliquant l'encapsulation cellulaire. En outre, la polymérisation exothermique pourrait produire des températures suffisamment élevées pour compromettre les tissus environnants, ce qui a été rapporté pour l' os polymère ciments ^12,13.

Encore d'autres systèmes polymères injectables ont été mises au point qui présentent un changement de liquide à l'état solide avec la température comme le déclencheur. Connu sous le nom de systèmes thermogélifiants, ce sont aqueonous solutions de polymères qui ne nécessitent pas de stimulation chimique, des monomères réticulants, ou pour obtenir la formation in situ ^14. Au contraire, une transition de phase se produisant habituellement proche de la température physiologique induit la formation d'un réseau tridimensionnel réticulé physiquement. Poloxamères tels que Pluronic F127 sont parmi les polymères les plus étudiés pour thermogélifiant délivrance de médicaments ^15-17 et cellulaire encapsulation ^18,19. Toutefois, il est bien admis que ces gels manquent de stabilité dans des conditions physiologiques. Des études ont démontré une stabilité accrue à l' aide d' allongement de chaîne ²⁰ ou réticulants chimiques ^21,22. Néanmoins, l'utilisation de ces réactifs peut limiter le potentiel des matériaux pour l'encapsulation des cellules.

Poly (N-isopropylacrylamide) est un polymère thermogélifiant synthétique qui a reçu beaucoup d' attention dans l' ingénierie tissulaire et la délivrance des médicaments ^14. des solutions aqueuses de poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) présentent une température de solution critique inférieure (LCST), se produisant typiquement autour de 32-34 ° C ^23,24. En dessous de la LCST, l'eau hydrate les chaînes PNIPAAm. Au- dessus de la température de transition, le polymère devient hydrophobe, ce qui entraîne une séparation de phase dramatique ^25-27 et la formation d'un gel solide sans l'utilisation de monomères réticulants ou toxiques. Cependant, les homopolymères PNIPAAm présentent des propriétés élastiques pauvres et détiennent peu d' eau à la température physiologique en raison de l' hydrophobie ^28. Dans ce travail, nous avons choisi d'intégrer de manière covalente le sulfate de chondroïtine dans le réseau PNIPAAm, qui offre le potentiel de dégradabilité enzymatique ^29, l' activité anti-inflammatoire ^30,31, et l' eau a augmenté et l' absorption des nutriments ^32. les copolymères PNIPAAm avec CS ont été préparés dans notre laboratoire par polymérisation du monomère NIPAAm en présence de méthacrylate fonctionnalisé CS pour former un copolymère greffé (PNIPAAm-g-CS). Because de la densité de réticulation faible du copolymère, PNIPAAm-g-CS forme une solution visqueuse dans l' eau à la température ambiante et un gel élastique à la température physiologique , en raison de la LCST ^29. Les solutions de polymère deviennent coulante à nouveau lors du refroidissement au-dessous de la LCST du fait de la réversibilité de la transition.

Nous avons démontré que PNIPAAm-g-CS est susceptible de fonctionner comme un échafaudage d'ingénierie tissulaire, en raison des propriétés mécaniques qui peuvent être adaptées, la dégradabilité et la cytocompatibilité avec des cellules de rein embryonnaire humain (HEK) 293 ²⁹ cellules. Cependant, dans certaines zones de support de charge, tels que le disque intervertébral, le tissu des échafaudages d'ingénierie doivent avoir la capacité de former une interface sensible avec le tissu environnant de disque afin d' éliminer le risque de luxation ^33. Cette interface est également nécessaire pour la transmission adéquate de la force à travers l'interface entre l'implant et le tissu ^33. Dans notre travail, nous avons suspendu unlginate microparticules dans des solutions aqueuses de PNIPAAm-g-CS et a constaté que les microparticules se localise gélification, qui assurent l' adhérence avec le tissu ³⁴ environnant. Dans cet article, nous présentons les étapes de préparation du thermogélifiant, polymère adhésif. Des techniques standard pour la caractérisation de biomatériaux, d'imagerie cellulaire, et des essais de viabilité ont été adaptées pour tenir compte de la sensibilité à la température du polymère et la réversibilité de la transition de phase. Le polymère injectable décrit dans le présent document a une large potentiel pour des applications de distribution de médicaments et de l'ingénierie tissulaire en dehors de ceux décrits dans le présent document. En outre, les méthodes de caractérisation décrites ici peuvent être applicables à d'autres systèmes thermogélifiants.

Protocole

1. Poly (N-isopropylacrylamide) -g-chondroïtine Sulfate Synthèse

1. Avant la synthèse de l'hydrogel bioadhésive, purifier le N-isopropylacrylamide (NIPAAm) un monomère méthacrylate et du sulfate de chondroïtine (CS).
   1. Peser au moins 10 g de NIPAAm et dissoudre le monomère dans 400 ml de n-hexane à 60 ° C. Incorporer le récipient périodiquement jusqu'à dissolution complète. On recristallise la solution dans un congélateur à -20 ° C pendant 24 heures.
   2. Éliminer le monomère a cristallisé dans le filtre et le récipient vide, le n-hexane en utilisant un entonnoir Büchner. Placer le monomère dans une étuve sous vide à température ambiante pendant 24 h pour éliminer tout reste du n-hexane. Stocker le monomère dans un congélateur C -20 ° pour une utilisation ultérieure (voir l'étape 1.2).
   3. Peser et dissoudre 2,0 g de sulfate de chondroïtine dans 8,0 ml d'eau déminéralisée. Chauffer doucement la solution à 60 ° C.
   4. Ajuster le pH de la solution à 10 à l'aide d'environ 10 à 40 ul de 50% (poids / poids) de NaOH.
   5. Ajouter 0.298 ml d'anhydride méthacrylique (MA). Reflux pendant 24 heures, tout en agitant à 60 ° C.
   6. Verser 400 ml de solution d'acétone dans un bocal et réfrigérer O / N dans un -20 ° C congélateur.
   7. Après 24 heures se sont écoulées, versez lentement la solution complète méthacrylé CS (Mcs) dans 400 ml d'acétone froide, tout en agitant avec un barreau d'agitation magnétique.
   8. Retirez le Mcs de l'acétone et placer le précipité dans un four à vide. Effectuez cette étape rapidement pour maintenir un état intact et cohérent pour MCs. Permettre à l'acétone résiduelle pour évaporer sous vide pendant au moins 24 heures.
2. Co-dissoudre 10 g de purifié NIPAAm et 2.209 g de MCs dans 232 ml d'eau déminéralisée.
3. Purger la solution d'oxygène en utilisant de l'azote gazeux inerte. Maintenir un débit de gaz vigoureux, encore faible pour empêcher la solution de bouillonnant pendant 15 min.
4. Poursuivre la purge de la solution avec de l'azote gazeux et d'ajouter 0,976 ml d'une tetramethyletéthylènediamine (TEMED).
5. Ensuite, amorcer la réaction de polymérisation en mélangeant 97,6 mg de persulfate d'ammonium (APS).
6. Mélanger la solution pendant environ 20 secondes et sceller rapidement la solution pour empêcher l'air de pénétrer dans le vaisseau. Laisser la solution polymériser sous une lumière fluorescente pendant 24 heures.
7. Après 24 heures, placer le récipient de réaction dans un four à 37 °. Permettre à l'hydrogel à la transition à partir d'un liquide à un état de gel. Immerger l'hydrogel polymérisé dans 1 x tampon phosphate salin (PBS) pendant un total de 7 jours pour permettre la diffusion du monomère qui n'a pas réagi hors de l'hydrogel.
8. En utilisant une paire de ciseaux, couper l'hydrogel en plusieurs petits morceaux, pas plus de 5 cm de diamètre. Pour éviter que l'hydrogel de la transition d'un état de gel à un liquide, dés le polymère dans la solution à 37 ° C PBS. Transférer les parties en 50 tubes coniques ml.
9. Préparer des échantillons pour la lyophilisation en enveloppant les sommets desles tubes avec Kimwipes et des bandes de caoutchouc. Congeler les tubes à -70 ° C pendant 1 à 2 heures.
10. Placer les tubes coniques sur le lyophilisateur pour éliminer toute l'eau de l'hydrogel. Avant utilisation, le lyophilisateur a besoin pour atteindre une température et une pression d'environ -40 ° C et 0,04 mbar, respectivement. Un minimum de 7 jours est requis pour le séchage complet.
11. Moudre le lyophilisé polymère en une fine poudre et stocker dans un réfrigérateur à 4 ° C pour une utilisation ultérieure (voir étape 3.1).

2. Calcium-alginate réticulé microparticules Synthèse

1. Préparer une 2% (p / v) de solution d'alginate en dissolvant 400 mg dans 20 ml d'eau déminéralisée. Chauffer la solution à environ 60 ° C pour faciliter la dissolution.
2. Préparer une 2% (p / v) d'une solution de chlorure de calcium par addition de 400 mg à 20 ml d'eau déminéralisée.
3. Créer une huile dans le mélange d'eau en combinant 100 ml d'huile de canola, 1,0 ml de Tween 20, et 20 mlde 2% (p / v) d'alginate. Émulsifier le mélange pendant 10 minutes avec un homogénéisateur à 15 000 tours par minute. En outre, mélanger avec une barre d'agitation magnétique à 200 tours par minute ou 2000 tours par minute pour créer de grandes ou petites microparticules, respectivement.
4. Aspirer le 2% (p / v) d'une solution de chlorure de calcium à l'aide d'une seringue avec un embout 18 G de l'aiguille. Ajouter lentement le chlorure de calcium goutte à goutte dans l'émulsion.
5. Une fois que les 20 ml de chlorure de calcium ont été épuisés, les microparticules permettent au sein de l'émulsion pour réticuler pendant 10 minutes.
6. À répartir uniformément le mélange de microparticules dans coiffés tubes de 50 ml et centrifuger conique à une force de 1400 x g pendant 2 min pour éliminer la couche initiale de l'huile de canola.
7. Consécutivement lavage, vortex et centrifuger les microparticules avec de l'isopropanol un total de trois fois à 1400 g pendant 2 min pour éliminer toute l'huile de canola résiduelle. Jeter le surnageant de l'isopropanol après chaque étape de centrifugation et laver avec de l'isopropanol frais.
8. Une fois que la oil a été supprimé, répétez la procédure de lavage trois fois supplémentaires avec de l'eau déminéralisée pour éliminer toute l'isopropanol résiduel. Jeter le surnageant désionisée d'eau après chaque étape de centrifugation et laver avec de l'eau désionisée fraîche. Retirer environ 100 mg de microparticules humides et stocker dans un flacon. Les microparticules humides seront utilisés pour mesurer le diamètre moyen du lot par microscopie optique.
   1. En utilisant la microscopie optique, disperser un petit échantillon de microparticules humides dans de l'eau déminéralisée sur une lame de microscope. En fonction de la taille des microparticules, utilisez un objectif 10X ou 20X, et ajuster l'ouverture numérique jusqu'à ce que les particules entrent en focus. Assurez-vous que le microscope est calibré pour l'objectif correct et régler la luminosité de la source de lumière selon les besoins. Utilisez un outil en ligne pour mesurer le diamètre le plus long de 50 microparticules d'alginate aléatoire et obtenir une taille moyenne pour le lot.
9. Préparer les microparticules pour lyophilisation by les enveloppant avec Kimwipes et les fixer avec des bandes de caoutchouc. Congeler les microparticules à -70 ° C pendant 1 heure.
10. Placer les microparticules sur le lyophilisateur, et laisser l'échantillon à sécher pendant au moins 24 heures. Broyer le gel des microparticules séchées dans une poudre fine en utilisant un mortier et un pilon et stocker dans un réfrigérateur à 4 ° C pour une utilisation ultérieure (voir l'étape 3.3).

3. Préparation des colles

1. En utilisant la poudre de polymère lyophilisé, créer une 5% (p / v) d'une solution PNIPAAm-g-CS en dissolvant 50 mg de poudre d'hydrogel dans 1 ml de 1 x PBS.
2. Mélanger la solution en utilisant un vortex et froid dans un réfrigérateur à 4 ° C pendant 24 heures.
3. Une fois que la formation d'une solution visqueuse, de créer un composite homogène par addition de 25 ou 50 mg de microparticules lyophilisées d'alginate à la solution d'hydrogel et vortexer. Stocker le composite dans un réfrigérateur à 4 ° C pour une utilisation ultérieure (voir étapes 4.3 et 4.8).

4. bioadhésif MechEssais de traction anical

1. Avant d'effectuer des essais de traction, extraire le substrat de cartilage d'une oreille porcine.
   1. Décongeler oreille porcine dans une ambiance chaleureuse de 0,9% (p / v) une solution de NaCl; cela aidera à desserrer le tissu.
   2. L'utilisation d'un scalpel, d'isoler et de la section hors d'une zone plate, rectangulaire en coupant verticalement si la couche épidermique, tissu sous-cutané, et le cartilage. Évitez de couper les arêtes courbes de l'oreille porcine.
   3. On sépare la couche épidermique de la peau du cartilage en coupe parallèle à travers le tissu sous-cutané. Le cartilage est un tissu blanc et dur qui se trouve sous la peau de porc.
   4. racler soigneusement le tissu sous-cutané qui est attaché au cartilage avec le côté du scalpel. Éviter de couper dans le tissu du cartilage avec la lame de scalpel.
   5. Veiller à ce que d'un seul côté du cartilage est exposé et à plat pendant les essais de traction. Si nécessaire, aplatir le cartilage en coupant la peau inégale sur la face inférieure.
   6. Couper le tissu cartilagineux en plusieurs morceaux ayant des dimensions de 1 cm x 1 cm. Stocker le tissu du cartilage dans des tubes coniques remplis de 0,9% (p / v) d'une solution de NaCl dans un congélateur à -20 ° C.
2. Préparer 2,0 L de 0,9% (p / v) d'une solution de NaCl. Préchauffer la solution saline à 37 ° C. La température de cette solution doit être maintenue tout au long des essais.
3. Décongeler le cartilage congelé. Gardez à la fois le cartilage de porc et les échantillons d'hydrogel dans un récipient en polystyrène avec des packs de glace.
4. Fixez la jauge de force sur le bras du banc d'essai. Placer une plaque sur le dessus de la cage de force et de régler la température à 50 ° C.
5. Apposer un 1 cm x 1 cm morceau de cartilage au bloc d'acier inoxydable avec la colle cyanoacrylate et une paire de pinces. Coller une pièce supplémentaire de cartilage au cylindre Delrin et attacher le cylindre à la jauge de force. Il est très important que les deux surfaces de cartilage face de l'autre et le contact de l'hydrogel.
6. Endroitle bain d'eau en plexiglas sur le dessus de la plaque chauffante et insérez le bloc d'acier inoxydable avec le substrat de cartilage à l'intérieur du bain.
7. Abaisser le bras du banc d'essai et d'aligner les deux substrats de cartilage avec un autre. Levez le bras et laisser assez de place pour appliquer l'hydrogel.
8. Avec une pipette à déplacement positif, verser 200 pl de l'hydrogel bioadhésive à la pièce inférieure du cartilage.
9. Abaisser le bras de la position de force à 1 mm / min jusqu'à ce que les contacts d'hydrogel de la pièce supérieure du cartilage et exerce une force de précharge de 0,001 N.
10. Verser la solution saline C à 37 ° dans le bain jusqu'à ce que le volume atteint le niveau d'eau désigné. Vérifiez la température de la solution avec un thermocouple.
11. Permettre à l'hydrogel à définir pour un total de 5 minutes. Une fois que le gel est solidifié, lever le bras à une vitesse de 2 mm / min. Le test est terminé une fois que le bioadhésif se détache du substrat du cartilage ou quand une baisse significative de la force se produit,signalisation échec.
12. Recueillir les données enregistrées et lever le bras du banc d'essai. Retirer le cylindre Delrin de la jauge de force. Versez la solution saline dans son récipient précédent et réchauffer à 37 ° C.
13. Calculer les contraintes en soustrayant la force exercée par le polymère à partir de la force de flottabilité d'un «vide», l'attachement Delrin sans cartilage ou d'adhésif, soulevé à la même vitesse, et en divisant par la zone de liaison.

5. Etude Gonflement de PNIPAAm-g-CS avec Alginate Microparticules

1. Préparer des flacons en verre propres et les étiqueter de manière appropriée avec un point de temps, le type d'échantillon, et le numéro de l'échantillon. Les adhésifs peuvent également être créés, comme décrit précédemment. Préparer un total de cinq échantillons (n ​​= 5) pour chaque type d'échantillon par point de temps.
2. Pré-peser tous les flacons de verre et d'enregistrer leur masse initiale à la température ambiante.
3. En utilisant une seringue, verser environ 0,4 ml de l'échantillon d'adhésif préparée dans chacun des cinq flacons.Répétez cette étape pour chaque type d'échantillon dans tous les points de temps testés.
4. Peser et enregistrer la masse de chaque flacon avec l'adhésif type d'échantillon à température ambiante.
5. Préchauffer un incubateur orbital et 1 L de solution 1 x PBS à 37 ° C.
6. Organiser tous les flacons sur une grille et insérez la grille dans l'incubateur. Laisser les adhésifs passage d'un liquide à un gel pendant environ 5 à 10 min.
7. Ajouter 5,0 ml de PBS 1x à chaque flacon. Soyez sûr d'ajouter soigneusement la solution PBS le long du côté du flacon pour empêcher le disque d'hydrogel de se séparer.
8. Coiffer chaque flacon pour empêcher l'évaporation de la solution PBS et on maintient la température interne de l'incubateur à 37 ° C. Chaque jeu de disques d'hydrogel devra rester immergée dans du PBS pendant une durée de temps déterminée.
9. Une fois un point de temps de 7 jours a été atteint, décapsuler l'ensemble des flacons et retirer la solution PBS de chaque flacon. Peser chaque flacon avec l'échantillon d'adhésif à nouveau à température ambiante.

6. Qualitative Viabilité cellulaire en utilisant un test en direct / Dead

1. Avant d'effectuer le test en direct / Dead avec PNIPAAm-g-CS, croître de rein embryonnaire humain 293 cellules (HEK-293) à 80% de confluence.
   1. Le dégel rapide HEK-293 suspension de cellules congelées en plaçant le tube cryogénique dans un bain d'eau à 37 ° C, puis centrifuger les cellules à 400 xg à 4 ° C pendant 5 min dans un tube conique de 15 ml.
   2. Pour rendre le milieu de croissance de cellules de passage, se combinent à haute teneur en glucose (4,5 g / L) Dulbecco milieu de Eagle modifié (DMEM) avec du sérum inactivé à la chaleur de fœtus bovin (FBS) à une concentration finale de 20% et la solution de pénicilline-streptomycine 100X ( pen-strep) à une concentration finale de 100 UI / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine. Pour tous les autres passages, passer à DMEM avec 10% de FBS et 1x stylo-streptocoque.
   3. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de milieu de croissance et transférer la suspension dans une boîte de 100 mm de diamètre de pétri. uniformément distribute les cellules en inclinant légèrement le plat avant en arrière et de gauche à droite à quelques reprises chaque direction.
   4. La culture des cellules dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec 5% de CO _2. Si nécessaire, changer le milieu tous les deux jours.
   5. Lorsque les cellules atteignent 80% de confluence, reproduire la culture en plusieurs plats. Retirer le milieu de la plaque.
   6. Ajouter 1 ml de trypsine à 0,5% à la plaque. Laisser les plaques à incuber à 37 ° C pendant 10 min. Vérifiez si les cellules se détachent de la surface en remuant doucement la plaque.
   7. Pour séparer la culture 01:10, ajouter 9 ml de milieu de croissance normal (DMEM avec 10% de FBS) dans les cellules trypsinisées et mélanger doucement en inclinant la coupelle.
   8. Distribuer 1 ml de la suspension cellulaire diluée dans chaque nouveau plat et ajouter 9 ml de milieu de croissance. Mélanger doucement en inclinant le plat.
   9. La culture des cellules dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec 5% de CO _2. Si nécessaire, changez le moyen jamaisy deux jours jusqu'à ce que les cellules atteignent 80% de confluence.
2. Retirez le support de deux boîtes de culture cultivées à 80% de confluence.
3. Ajouter 1 ml de trypsine à 0,5% à chaque plaque. Laisser les plaques à incuber à 37 ° C pendant 10 min. Vérifiez si les cellules se détachent de la surface en remuant doucement la plaque.
4. Laver les cellules HEK-293 sur la plaque avec 3 ml de milieu de croissance à deux reprises et ajouter à la fois des suspensions à la même tube de 15 ml conique.
5. Centrifuger le tube de 15 ml conique pendant 10 min à 400 xg à 4 ° C.
6. Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 3 ml de milieu par pipetage vers le haut et vers le bas.
7. Pipette 10 ul de la suspension cellulaire dans un hémocytomètre et effectuer un comptage des cellules pour déterminer la densité cellulaire. Augmenter le volume du milieu de suspension si la concentration cellulaire initiale est trop élevée, et inversement, diminuer le volume si la concentration est trop faible, afin de préserver une cible concentration de 1 x 10 ⁶ cellules / ml. Centrifuger les cellules HEK-293 à 400 g et remise en suspension du culot cellulaire dans le volume corrigé des supports en conséquence.
8. vortex doucement la suspension cellulaire et répartir uniformément le mélange de cellules dans quatre tubes de 15 ml coniques séparés pour les conditions d'essai suivantes: monocouche de contrôle positif, contrôle négatif tué dans PNIPAAm-g-CS en utilisant 70% (v / v) méthanol, HEK-293 des cellules encapsulées dans PNIPAAm-g-CS et de cellules HEK-293 encapsulées dans PNIPAAm-g-CS avec des microparticules d'alginate.
9. Créer des monocouches de contrôle positif par pipetage multiple 300 volumes ul du mélange de cellules dans une plaque de 24 puits pour générer 4-6 échantillons répétés.
10. Retirez le support des tubes coniques relatives au contrôle tué, PNIPAAm-g-CS et PNIPAAm-g-CS avec des microparticules d'alginate.
    1. Centrifuger les tubes coniques pendant 5 minutes à 400 xg et retirer le surnageant.
    2. Maintenir la même concentration de cellules par remise en suspension du caunes dans le même volume de PNIPAAm-g-CS que les médias enlevés. Pipeter la cellule mélange de polymère de haut en bas à l'aide d'une pipette sérologique jusqu'à homogénéité.
       1. Si l'ensemencement avec des microparticules d'alginate, transférer la suspension PNIPAAm-g-CS-cellules (obtenu comme décrit pour 6.10.2) dans une boîte de culture de 35 mm et d'introduire les particules dans le mélange. Pipeter le mélange de cellules de haut en bas à l'aide d'une pipette sérologique jusqu'à homogénéité.
    3. À l'aide de la pipette sérologique, distribuer plusieurs 300 ul du mélange de cellules de polymère dans chacun des puits de contrôle tués, PNIPAAm-g-CS, et PNIPAAm-g-CS avec des microparticules d'alginate pour générer 4 - 6 réplicats.
11. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 10 à 15 minutes et laisser la PNIPAAm-g-CS passage d'un liquide à un gel (le polymère forme un disque blanc opaque).
12. Placez une lame chaude dans la hotte et régler la température à 37 ° C. Utilisez la lame chaude pour maintenir la plaque bientempérature et pipette 600 ul de milieu préchauffées dans chaque puits. Pour empêcher davantage la transition du polymère à l'état liquide, placez une lampe avec une ampoule fluorescente au-dessus du plat à réchauffer l'air au-dessus.
13. Incuber les cellules pendant 5 jours à 37 ° C avec 5% de CO _2.
14. Au bout de cinq jours se sont écoulés, préparer le mélange mort Live / de colorant en utilisant homodimère éthidium (de EthD-1) et calcéine AM. Ces deux substances sont sensibles à la lumière et préparé le jour de l'utilisation.
    1. Décongeler AM calcéine et EthD-1 à partir du kit à température ambiante.
    2. Ajouter 5 ml de stérile 1x PBS à un tube conique et l'envelopper dans une feuille d'aluminium.
    3. Ajouter 6,67 ul de 2 mM EthD-1 au tube conique. Vortex à fond le mélange de solution.
    4. Ensuite, ajoutez 2,5 pi de 4 mM calcéine AM au tube conique. Vortex soigneusement le mélange.
15. Retirez le support des puits de la monocouche (contrôle positif), PNIPAAm-g-CS et PNIPAAm-g-CS with microparticules d'alginate. Laver tous les puits à fond, mais doucement, avec du PBS et enlever le PBS.
16. Laisser les disques d'hydrogel contenant des microparticules d'alginate pour liquéfier à la température ambiante et ajouter 2 ml de citrate de sodium 50 mM à chaque puits.
17. Retirez le support des puits de cellules tuées (contrôle négatif). Permettre aux disques d'hydrogel pour liquéfier à la température ambiante et ajouter 300 ul de 70% (v / v) de methanol à chaque puits.
18. Incuber la plaque pendant 45 minutes à 37 ° C.
19. Retirer le citrate de sodium et des solutions de méthanol à partir d'une pipette dans les puits et chacune des suspensions d'hydrogel dans des microtubes individuels. Centrifuger les tubes à 2000 g pendant 10 minutes pour séparer les cellules de la suspension d'hydrogel.
20. enlever soigneusement la suspension par pipetage de la solution du tube conique et en laissant le culot cellulaire. Remettre en suspension le culot dans 300 pl de PBS et transférer dans la plaque de puits d'origine.
21. Ajouter 300 ul de til en direct / Dead colorant mélange à chacun des puits. Enveloppez la plaque bien dans du papier d'aluminium et laisser incuber pendant 45 minutes sur une bascule à la température ambiante.
22. Image tous les échantillons sous un microscope inversé à fluorescence avec un objectif 10X. Les cellules vivantes et des cellules tuées affiche une fluorescence verte et rouge, respectivement.

7. Quantitative Viabilité cellulaire en utilisant un test XTT

1. Cultiver des cellules HEK-293 à 80% de confluence. Retirez le support de croissance à partir de deux boîtes de culture.
2. Ajouter 1 ml de trypsine à 0,5% à chaque plaque. Laisser les plaques à incuber à 37 ° C pendant 10 min. Vérifiez si les cellules se détachent de la surface en remuant doucement la plaque.
3. Laver les cellules HEK-293 sur la plaque avec 3 ml de milieu deux fois et ajouter à la fois des suspensions à la même tube de 15 ml conique.
4. Centrifuger le tube de 15 ml conique pendant 10 min à 400 xg à 4 ° C.
5. Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 3 ml de milieuxpar pipetage vers le haut et vers le bas.
6. Pipette 10 ul de la suspension cellulaire dans un hémocytomètre et effectuer un comptage des cellules pour déterminer la densité cellulaire. Comme décrit précédemment, conserver une concentration cible de 1 x 10 ⁶ cellules / ml. Centrifuger les cellules HEK-293 à 400 g et remise en suspension du culot cellulaire dans le volume corrigé des supports en conséquence.
7. vortex doucement la suspension cellulaire et répartir uniformément le mélange de cellules dans quatre tubes de 15 ml coniques séparés pour les conditions d'essai suivantes: monocouche de contrôle positif, contrôle négatif tué dans PNIPAAm-g-CS en utilisant 70% (v / v) méthanol, HEK-293 des cellules encapsulées dans PNIPAAm-g-CS et de cellules HEK-293 encapsulées dans PNIPAAm-g-CS avec des microparticules d'alginate.
8. Créer des monocouches de contrôle positif par pipetage 300 ul du mélange de cellules dans une plaque de 24 puits pour générer 4 - 6 échantillons répétés.
9. Retirez le support des tubes coniques relatives au contrôle tué, PNIPAAm-g-CS et PNIPAAm-g-CS avec des microparticules d'alginate.
   1. Centrifuger les tubes coniques pendant 5 minutes à 400 g et retirer le surnageant.
   2. Maintenir la même concentration de cellules en remettant en suspension les cellules dans le même volume de PNIPAAm-g-CS en tant que support retiré. Pipeter le mélange de cellules de haut en bas à l'aide d'une pipette sérologique jusqu'à homogénéité.
      1. Si l'ensemencement avec des microparticules d'alginate, transférer la suspension PNIPAAm-g-CS-cellule dans une boîte de culture de 35 mm et d'introduire les particules dans le mélange. Pipeter le mélange de cellules de haut en bas à l'aide d'une pipette sérologique jusqu'à homogénéité.
   3. À l'aide de la pipette sérologique, verser 300 pl du mélange de cellules de polymère dans chacun des puits de contrôle tués, PNIPAAm-g-CS, et PNIPAAm-g-CS avec des microparticules d'alginate pour générer 4 - 6 réplicats.
10. Une fois que tous les échantillons contenant des cellules ont été ajoutées à la plaque de 24 puits, distribuer plusieurs 300 volumes ul de PNIPAAm-g-CS et PNIPAAm-g-CS avec des microparticules d'alginate sans cellules dans des puits adjacents pour générer 4 - 6 échantillons répétés.
11. Incuber la plaque à 24 puits à 37 ° C pendant 10 à 15 minutes et laisser la PNIPAAm-g-CS passage d'un liquide à un gel (le polymère forme un disque blanc opaque).
12. Placez une lame chaude dans la hotte et régler la température à 37 ° C. Utilisez la lame chaude pour maintenir ainsi la température de la plaque et pipette 600 pl de DMEM clair préchauffé dans chaque puits. Pour empêcher davantage la transition du polymère à l'état liquide, placez une lampe avec une ampoule fluorescente au-dessus du plat à réchauffer l'air au-dessus.
13. Incuber les cellules pendant 5 jours à 37 ° C sous 5% de CO _2.
14. Au bout de cinq jours se sont écoulés, de préparer le 2,3-bis (2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl) -2H-tétrazolium-5-carboxanilide (XTT) du réactif du fabricant. Le réactif XTT est sensible à la lumière et préparé le jour de l'utilisation.
    1. Retirez la bouteille ambre contientment la poudre XTT du réfrigérateur. En utilisant une seringue et une aiguille stériles, injecter 5 ml de DMEM clair (pas de rouge de phénol) à travers le septum en caoutchouc dans la bouteille ambre.
    2. Chauffer le réactif à 56 ° C dans un bain d'eau pendant 10 minutes ou jusqu'à dissolution.
    3. diluer le réactif XTT à 20% (v / v) dans un tube conique de 15 ml enveloppé dans une feuille d'aluminium. Aliquoter le réactif XTT en excès dans des tubes de microcentrifugation et les placer dans le -20 ° C congélateur pour le stockage à long terme.
15. Retirez le support des puits de cellules tuées (contrôle négatif) et ajouter 300 pi de 70% (v / v) méthanol à chaque puits. Incuber pendant 45 min à 37 ° C et à éliminer le méthanol des puits.
16. Retirez le support des puits restants de la monocouche (contrôle positif), PNIPAAm-g-CS et PNIPAAm-g-CS avec des microparticules d'alginate. Laver tous les puits à fond, mais doucement, avec du PBS, puis retirez le PBS.
17. Ajouter 300 ul de 20% XTT réactif à chacun des puits. Enveloppez la plaque de 24 puits dans du papier d'aluminium et laisser incuber pendant 24 heures sur une bascule à la température ambiante.
18. Après 24 h, ajouter 200 pl de citrate de sodium 50 mM à tous les puits et mettre en incubation sur le basculeur pendant une heure supplémentaire.
19. Transférer toutes les suspensions de polymères à microtubes et centrifuger à 2000 g pendant 10 min à température ambiante.
20. Le transfert de 200 ul du surnageant de chaque microtube sur une plaque à 96 puits. En utilisant un lecteur de plaque de microtitration, d'obtenir des lectures d'absorbance spécifique à 450 nm lectures d'absorbance et non spécifique à 690 nm.

Résultats

Un co-polymère greffé thermiquement sensible a été synthétisé avec succès , et caractérisé par sa résistance à bioadhésif, des propriétés de gonflement, et cytocompatibilité vitro. Nous avons choisi d'étudier l'alginate en raison de ses propriétés muco bien établies. des microparticules d'alginate, avec un diamètre moyen de 59,7 ± 14,9 um, ont été mélangés avec 5% (p / v) PNIPAAm-g-CS à des concentrations de 25, 50 et 75 mg / ml. Ces concent...

Discussion

Il y a plusieurs étapes critiques dans la synthèse du composite hydrogel microparticule et d'évaluer sa force adhésive, gonflement capacité, et la biocompatibilité cellulaire. polymérisation radicalaire d'PNIPAAm-g-CS nécessite méthacrylation réussie du sulfate de chondroïtine, la dissolution complète des composants monomères et les conditions de réaction exempt d'oxygène. Le rapport du monomère au NIPAAm méthacrylé chondroïtine sulfate dans le mélange réactionnel a été choisi parce qu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized	Acros Organics	2210-25-5	Refrigerate and remove stabilier with hexane
Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea)	Sigma-Aldrich	39455-18-0	Refrigerate
Hexanes	Fisher Scientific	H302-4	Store in a flammable cabinet
50% (w/w) sodium hydroxide	Fisher Scientific	SS254-1	Caustic in nature
Methacrylic anhydride	Sigma-Aldrich	276685	Strong fumes; use in a fume hood
Acetone	Fisher Scientific	A18-4	Chill in a refrigerator prior to use
Nitrogen Gas	Praxair	7727-37-9	Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas)
Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure	Acros Organics	110-18-9
Ammonium persulfate	Sigma Aldrich	A3678	Hygroscopic and degrades in the presence of water
Phosphate buffered saline tablets	Fisher Scientific	BP2944	Keep dry
Alginic acid, sodium salt	Acros Organics	177775000	Use heat to aid in dissolving
Calcium chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79
Canola oil	Local store		Obtain from a local store
Tween 20	Sigma-Aldrich	93773
70% (v/v) Isopropoanol	Fisher Scientific	A416-4
Porcine ears	Haine's Pork Shop		Obtain from a local butcher
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-3
Human embryonic kidney 293 cells	ATCC	ATCC CRL-1573	Store in liquid nitrogen for long-term use
DMEM: 1x, high glucose, no pyruvate	Life Technologies	11965126	Refrigerate
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082-147	Refrigerate
Penn Strep: 10,000 U/ml	Life Technologies	15140-122	Refrigerate
Trypsin-EDTA: 0.5%, 10x	Life Technologies	15400-054	Refrigerate
Methanol	VWR	AAA44571-K7
Live/Dead Cell viability kit	Life Technologies	L3224	Light sensitive, keep frozen
XTT cell viability kit	Sigma Aldrich	TOX2-1KT	Light sensitive, keep frozen
Clear DMEM: 1x, high glucose, no phenol	Life Technologies	21063-029	Refrigerate
Dulbecco's PBS: 1x	Life Technologies	14190136	Refrigerate
Sodium citrate	EMD	SX0445-1
Positive displacement pipette	BrandTech Scientific, INC	2702904	Dispenses 100 - 500 µl and comes with attachable tips
No 3. Stainless Steel scalpel handle	Sigma Aldrich	S2896
Miltex sterile surgical blades	Fisher Scientific	12-460-440	Size 10
Power gem homogenizer	Fisher Scientific	08-451-660	Model # 125
Porcelain mortar and pestle	Sigma Aldrich	Z247464	Holds 50 ml
FreeZone 1 L benchtop freeze dry system	Labconco	7740020	Freeze samples prior to use
Oil sealed rotary vane pump	Edwards	A65301906	Model # RV5
Incubating orbital shaker	VWR	12620-946	Model # 980153
Benchtop refrigerated centrifuge	Forma Scientific, INC		Model # 5682
Heated ovens	VWR		Model # 1235PC
2 N force gauge	Shimpo	FGV-0.5XY	Model # FGV-0.5XY
E-force test stand	Shimpo	FGS-200PV	Model # FGS-200PV
Tissue culture swinging bucket centrifuge	Beckman Coulter	366830	Model #6S-6KR
Tissue culture microcentrifuge	Eppendorf		Model #5415C
Hemacytometer set	Hausser Scientific	3720	Requires replacement cover glass slips
Slide warmer	Lab Scientific	XH-2022	Model # XH-2002
Portable heating lamp	Underwriters Laboratories		Helps to maintain polymer temperature at 37 °C
Inverted fluorescent microscope	Zeiss		Model Axiovert 25 CFL
Heated water bath	VWR		Model # 1235PC
Rocking platform	VWR		Series 100
Multiskan FC microtiter plate reader	Thermo Scientific		Type 357
Cell culture incubator	VWR		Model # 2350T
Purifier class II biosafety cabinet	Labconco		Delta Series