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Resumo

Um andaime engenharia de tecidos injectáveis ​​compostas de poli (N-isopropilacrilamida), sulfato de condroitina--graft (PNIPAAm-g-CS) molecular contendo micropartículas de alginato foi preparada. A força de aderência, propriedades e inchaço na biocompatibilidade in vitro são analisadas neste estudo. As técnicas de caracterização desenvolvidos aqui podem ser aplicados a outros sistemas termogelificantes.

Resumo

Biomateriais injectáveis são definidos como materiais implantáveis que podem ser introduzidos no corpo como um líquido e solidificar in situ. Tais materiais oferecem as vantagens clínicas de serem implantados minimamente invasiva e facilmente formando sólidos de preenchimento de espaço em defeitos de forma irregular. biomateriais injetáveis ​​têm sido amplamente investigados como suportes para engenharia de tecidos. No entanto, para a reparação de determinadas zonas de suporte de carga no corpo, tais como o disco intervertebral, andaimes devem possuir propriedades adesivas. Isto vai minimizar o risco de deslocamento durante o movimento e assegurar o contacto íntimo com o tecido circundante, fornecendo a transmissão adequada das forças. Aqui, descrevemos a preparação e caracterização de um andaime composto por termicamente sensíveis poli (N-isopropilacrilamida) sulfato de condroitina -graft-(PNIPAAm-g-CS) e micropartículas de alginato. O copolímero de PNIPAAm-g-CS forma uma solução viscosa em água à TA, em que alginate as partículas são suspensas para aumentar a adesão. Acima da temperatura crítica inferior de solução (TCIS), cerca de 30 ° C, o copolímero forma um gel sólido em volta das micropartículas. Temos adaptado biomateriais procedimentos normalizados de caracterização para tomar em consideração a transição de fase reversível de PNIPAAm-g-CS. Os resultados indicam que a incorporação de 50 ou 75 mg / ml de partículas de alginato em 5% (w / v) de soluções PNIPAAm-g-CS quadruplicar a resistência à tracção adesiva de PNIPAAm-GCS sozinhos (p <0,05). A incorporação de micropartículas de alginato também aumenta significativamente a capacidade de inchamento de PNIPAAm-g-CS (p <0,05), ajudando a manter um gel de enchimento dentro do espaço de defeitos de tecidos. Finalmente, os resultados do ensaio in vitro kit de toxicologia, 2,3-bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -2H-tetrazólio-5-carboxanilida (XTT) e ensaio de viabilidade vivo / morto indicam que o adesivo é capaz de suportar a sobrevivência e proliferação de encapsulado de rim embrionário humano (HEK) 293 Cells mais de 5 dias.

Introdução

Biomateriais injectáveis são aqueles que podem ser convenientemente entregues para o corpo como um líquido e solidificar in situ. Tais materiais têm sido extensivamente aplicado na medicina regenerativa, em que eles são utilizados para entregar células encapsuladas para o local afectado 1-4 e actuam como uma matriz extracelular temporária tridimensional para as células 5. Para o paciente, biomateriais injectáveis ​​são vantajosos porque os procedimentos cirúrgicos para implante são minimamente invasiva e a fase sólida pode preencher defeitos de forma irregular dos tecidos, eliminando a necessidade de implantes de tamanho personalizado.

Injectabilidade pode ser conseguido através de uma variedade de mecanismos. Os factores externos, como pH, têm sido investigadas como um gatilho para a formação de geles que encapsulam as células e moléculas bioactivas 6-8. No entanto, o pH não pode ser o gatilho mais conveniente para utilizar em todos os ambientes fisiológicos. Outra alterna tradicionaltiva para atingir injectabilidade está usando polimerização in situ química ou reticulação. Um grupo desenvolvido um sistema redox solúvel em água composto por persulfato de amónio e N, N, N-tetrametiletilenodiamina, N ', e é utilizado para a reacção de macrómeros compostas de polietileno glicol e poli (propileno) glicol 9,10. Zan et al. 11 redes quitosano injectáveis de álcool polivinílico reticulado com glutaraldeído desenvolvidos. Em tais sistemas, a citotoxicidade dos componentes reactivos deve ser considerada, especialmente para aplicações que envolvem o encapsulamento celular. Além disso, a polimerização exotérmica pode produzir temperaturas elevadas o suficiente para comprometer o tecido circundante, o que tem sido relatado para o osso polimérico cimentos 12,13.

Ainda outros sistemas de polímeros injectáveis ​​têm sido desenvolvidos que exibem uma mudança do estado líquido para estado sólido com a temperatura como o gatilho. Conhecido como sistemas termogelificantes, estes são aqueonos soluções de polímero que não requerem estímulo químico, monómeros ou agentes de ligação cruzada para conseguir a formação in situ 14. Em vez disso, uma transição de fase que ocorre geralmente próxima da temperatura fisiológica induz a formação de uma rede tridimensional fisicamente reticulado. Poloxâmeros como Pluronic F127 estão entre os polímeros mais estudados para termogelificantes entrega da droga 15-17 e células encapsulamento 18,19. No entanto, é bem aceite que estes geles não possuem a estabilidade em condições fisiológicas. Estudos têm demonstrado o aumento da estabilidade usando extensores de cadeia ou agentes de reticulação químicos 20 21,22. No entanto, a utilização destes reagentes pode limitar o potencial dos materiais de encapsulamento de células.

Poli (N-isopropilacrilamida) é um polímero sintético termogelificantes que tem recebido uma atenção significativa em engenharia de tecidos e entrega de droga 14. As soluções aquosas de poli (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) exibem uma temperatura crítica inferior de solução (TCIS), tipicamente ocorrendo em torno de 32-34 ° C 23,24. Abaixo da TCIS, água hidrata cadeias de PNIPAAm. Acima da temperatura de transição, o polímero torna-se hidrofóbico, resultando numa separação de fases dramática 25-27 e formação de um gel sólido, sem o uso de monómeros ou agentes de reticulação tóxicos. No entanto, homopolímeros de PNIPAAm exibem pobres propriedades elásticas e mantenha pouco de água à temperatura fisiológica devido à hidrofobicidade 28. Neste trabalho, nós optar por incorporar sulfato de condroitina covalente na rede PNIPAAm, que oferece o potencial para degradabilidade enzimática 29, a actividade anti-inflamatória 30,31, e aumento da água e absorção de nutrientes 32. copolímeros de PNIPAAm com CS foram preparados no nosso laboratório por polimerização do monómero NIPAAm na presença de CS-metacrilato funcionalizado para formar copolímero enxertado (PNIPAAm-g-CS). BecAUtilize de baixa densidade de reticulação do copolímero, PNIPAAm-g-CS forma uma solução viscosa em água à TA, e um gel elástico à temperatura fisiológica devido à TCIS 29. As soluções de polímero se tornar fluido novamente após o arrefecimento abaixo da TCIS, devido à reversibilidade da transição.

Nós demonstramos que PNIPAAm-g-CS tem o potencial para funcionar como uma estrutura de engenharia de tecidos, devido às propriedades mecânicas que podem ser adaptados, degradabilidade e citocompatibilidade com rim embrionário humano (HEK) 293 células 29. No entanto, em determinadas áreas de suporte de carga, tais como o disco intervertebral, andaimes de engenharia de tecidos devem possuir a capacidade de formar uma interface substancial com o tecido envolvente do disco para eliminar o risco de deslocamento 33. Esta interface é também necessário para uma adequada transmissão de força em toda a interface entre o implante e o tecido 33. Em nosso trabalho, temos que suspendeu amicropartículas lginate em soluções aquosas de PNIPAAm-g-CS e descobriram que a gelificação localiza as micropartículas, que proporcionam a adesão com o tecido circundante 34. Neste artigo, vamos delinear os passos para a preparação do termogelificantes, polímero adesivo. As técnicas convencionais para a caracterização de biomateriais, imagens de células, e os ensaios de viabilidade foram adaptados para ter em conta a sensibilidade à temperatura do polímero e a reversibilidade da transição de fase. O polímero injetável descrito neste trabalho tem grande potencial para aplicações de entrega de medicamentos e engenharia de tecidos fora dos descritos neste documento. Além disso, os métodos de caracterização descritos aqui podem ser aplicados a outros sistemas termogelificantes.

Protocolo

1. O poli (N-isopropilacrilamida) -g-sulfato de condroitina Síntese

  1. Antes da síntese do hidrogel bioadesivo, purificar N-isopropilacrilamida (NIPAAm) e monómero de metacrilato de sulfato de condroitina (CS).
    1. Pesar, pelo menos, 10 g de NIPAAm e dissolve-se o monómero em 400 ml de n-hexano a 60 ° C. Agita-se o recipiente periodicamente até à dissolução completa. Recristaliza-se a solução num congelador a -20 ° C durante 24 h.
    2. Remover o monómero cristalizado a partir de o filtro e recipiente de vácuo o n-hexano, utilizando um funil de Buchner. Colocar o monómero numa estufa de vácuo à temperatura ambiente durante 24 horas para remover qualquer remanescente n-hexano. Armazenar o monômero em um C congelador -20 ° para uso posterior (veja o passo 1.2).
    3. Pesar e dissolver 2,0 g de sulfato de condroitina em 8,0 ml de água desionizada. Aquecer lentamente a solução a 60 ° C.
    4. Ajustar o pH da solução a 10 utilizando cerca de 10 a 40 ul de 50% (w / w) de NaOH.
    5. Adicionar 0,298 ml de anidrido metacrílico (MA). Aquecer a refluxo durante 24 horas, enquanto se agitava a 60 ° C.
    6. Despeje 400 ml de solução de acetona em uma jarra e calafrio O / N em um C congelador -20 °.
    7. Após 24 h ter decorrido, lentamente verter a solução inteira CS metacrilado (MCS) em 400 ml de acetona fria, enquanto se agitava com uma barra de agitação magnética.
    8. Remover o MCS a partir da acetona e colocar o precipitado em um forno de vácuo. Execute esta etapa rapidamente para manter um estado intacto e coesa para MCS. Permitir que a acetona residual para evaporar sob vácuo durante pelo menos 24 h.
  2. Co-dissolver 10 g de NIPAAm purificado e 2,209 g de MCS em 232 ml de água desionizada.
  3. Purgar a solução de oxigênio usando gás nitrogênio inerte. Manter uma taxa de fluxo de gás vigorosa, ainda baixo para evitar que a solução borbulhando durante 15 minutos.
  4. Continuar purgar a solução com gás de azoto e adicionar 0,976 ml de tetramethylethylenediamine (TEMED).
  5. Em seguida, iniciar a reacção de polimerização por mistura de 97,6 mg de persulfato de amónio (APS).
  6. Misture a solução durante aproximadamente 20 segundos e rapidamente selar a solução para evitar qualquer entrada de ar no recipiente. Permitir que a solução para polimerizar sob luz fluorescente durante 24 horas.
  7. Depois de 24 horas, colocar o recipiente da reacção em um forno de 37 ° C. Permitir que o hidrogel para a transição do estado líquido para um estado semelhante a gel. Submergir o hidrogel polimerizado em 1X solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante um total de 7 dias para permitir a difusão do monómero que não reagiu para fora do hidrogel.
  8. Usando uma tesoura, cortar o hidrogel em vários pedaços pequenos, não superiores a 5 cm de diâmetro. Para evitar que o hidrogel de transição de um estado semelhante a gel a um líquido, dados do polímero dentro da solução a 37 ° C de PBS. Transferir as porções 50 em tubos cónicos ml.
  9. Prepare as amostras para liofilização envolvendo os topos deos tubos com Kimwipes e elásticos. Congelar os tubos a -70 ° C durante 1 a 2 horas.
  10. Colocar os tubos cónicos no secador por congelação para remover toda a água a partir do hidrogel. Antes da operação, o secador por congelação necessita para alcançar uma temperatura e pressão de aproximadamente -40 ° C e 0,04 mbar, respectivamente. É necessário um mínimo de 7 dias para a secagem completa.
  11. Moer o liofilizado polímero em um pó fino e armazenar em um C geladeira a 4 ° para uso posterior (veja o passo 3.1).

2. O cálcio-alginato reticulado Micropartículas Síntese

  1. Prepara-se uma a 2% (w / v) de solução de alginato por dissolução de 400 mg em 20 ml de água desionizada. Aquece-se a solução para cerca de 60 ° C para facilitar a dissolução.
  2. Prepara-se uma a 2% (w / v) de solução de cloreto de cálcio por adição de 400 mg a 20 ml de água desionizada.
  3. Criar um óleo na mistura de água através da combinação de 100 ml de óleo de canola, 1,0 ml de Tween 20, e 20 mlde 2% (w / v) de alginato. Emulsionar-se a mistura durante 10 minutos com um homogeneizador a 15000 rpm. Além disso, misturar com uma barra de agitação magnética a 200 rpm ou 2.000 rpm para criar micropartículas grandes ou pequenas, respectivamente.
  4. Aspirar a 2% (w / v) de solução de cloreto de cálcio usando uma seringa com uma agulha 18 G ponta. Adiciona-se lentamente o cloreto de cálcio, gota a gota na emulsão.
  5. Uma vez que os 20 ml de cloreto de cálcio terem sido esgotados, permitir que as micropartículas no interior da emulsão para reticular durante 10 min.
  6. Distribuir uniformemente o lote de micropartículas cobertas em tubos de 50 ml e cónicos de centrifugação a uma força de 1400 xg durante 2 minutos para remover a camada inicial de óleo de canola.
  7. Consecutivamente lavagem, vortex, centrifugação e as micropartículas com isopropanol num total de três vezes a 1400 g durante 2 min para remover todo o óleo de canola residual. Descartar o sobrenadante isopropanol depois de cada passo de centrifugação e lava-se com isopropanol recente.
  8. Uma vez que o oiL foi removido, repetir o procedimento de lavagem mais três vezes com água desionizada para remover qualquer isopropanol residual. Descartar o sobrenadante água desionizada após cada passo de centrifugação e lava-se com água desionizada fresca. Retirar cerca de 100 mg de micropartículas molhadas e armazenar em um frasco. As micropartículas molhado será usado para medir o diâmetro médio do lote por microscopia de luz.
    1. Utilizando microscopia de luz, dispersar uma pequena amostra de micropartículas molhado em água desionizada numa lâmina de microscópio. Dependendo do tamanho das micropartículas, utilizar uma objectiva 10X ou 20X, e ajustar a abertura numérica até que as partículas entram em foco. Certifique-se de que o microscópio está calibrado para o objectivo correcto e ajustar a luminosidade da fonte de luz, conforme necessário. Usar uma ferramenta de linha para medir o diâmetro mais longo de 50 micropartículas de alginato aleatória e obter um tamanho médio para o lote.
  9. Preparar as micropartículas para liofilização by envolvendo-os com Kimwipes e prendendo-os com faixas de borracha. Congelar as micropartículas a -70 ° C durante 1 h.
  10. Coloque as micropartículas no liofilizador e permitir que a amostra secar durante pelo menos 24 h. Moer o congelamento micropartículas secas em um pó fino usando um almofariz e pilão e armazenar em um C geladeira a 4 ° para uso posterior (veja o passo 3.3).

3. Preparação dos adesivos

  1. Utilizando o pó de polímero secas por congelação, criar a 5% (w / v) de solução PNIPAAm-g-CS por dissolução de 50 mg de pó de hidrogel em 1 ml de PBS 1x.
  2. Misture a solução utilizando um vortex e frio num frigorífico a 4 ° C durante 24 h.
  3. Uma vez que as formas de soluções viscosas, criar uma composição homogénea através da adição de 25 ou 50 mg de liofilizado de micropartículas de alginato para a solução de hidrogel e vortex. Armazenar o compósito num frigorífico a 4 ° C para uso posterior (ver passos 4.3 e 4.8).

4. Bio-aderentes MechEnsaios de tração anical

  1. Antes de realizar ensaios de tração, extrair substrato cartilagem de uma orelha do suíno.
    1. Descongelar um ouvido suína em um ambiente aconchegante 0,9% (w / v) de NaCl; isso vai ajudar a soltar o tecido.
    2. Utilizando um bisturi, e isolar a secção fora, numa área plana rectangular, cortando verticalmente no entanto a camada epidérmica, tecido subcutâneo e cartilagem. Evitar cortar as cristas curvas da orelha porcino.
    3. Separa-se a camada epidérmica da pele a partir da cartilagem, cortando paralelo através do tecido subcutâneo. A cartilagem é um tecido duro, branco encontrado debaixo da pele de porco.
    4. Cuidadosamente raspar o tecido subcutâneo que está ligado à cartilagem, com o lado do bisturi. Evitar o corte no tecido da cartilagem com a lâmina de bisturi.
    5. Certifique-se de que apenas um dos lados da cartilagem está exposta e plana durante o ensaio de tracção. Se necessário, achatar a cartilagem cortando a pele irregular no lado de baixo.
    6. Cortar o tecido de cartilagem em vários pedaços com dimensões de 1 cm x 1 cm. Armazenar o tecido de cartilagem em tubos cónicos cheios com 0,9% (w / v) de solução de NaCl em um congelador a -20 ° C.
  2. Prepare 2,0 L de 0,9% (w / v) de solução de NaCl. Pré-aquecer a solução salina a 37 ° C. A temperatura desta solução terá de ser mantida durante todo o teste.
  3. Descongele a cartilagem congelado. Manter tanto a cartilagem suína e as amostras de hidrogel em um recipiente de isopor com pacotes de gelo.
  4. Anexar o medidor de força ao braço do suporte de teste. Coloque uma placa de aquecimento na parte superior do suporte de força e ajustar a temperatura a 50 ° C.
  5. Apor de 1 cm x 1 centímetro pedaço de cartilagem para o bloco de aço inoxidável com cola de cianoacrilato e um par de pinças. Cole uma peça adicional de cartilagem para o cilindro de Delrin e anexar o cilindro para o medidor de força. É muito importante que ambas as superfícies de cartilagem enfrentam-se e contactar o hidrogel.
  6. Lugaro banho de água Plexiglas em cima do prato quente e inserir o bloco de aço inoxidável com o substrato de cartilagem no interior do banho.
  7. Abaixe o braço da coluna de teste e alinhar ambos os substratos de cartilagem um com o outro. Levante o braço e deixar espaço suficiente para aplicar o hidrogel.
  8. Com uma pipeta de deslocamento positivo, dispensar 200 ul do hidrogel bioadesivo para a parte inferior da cartilagem.
  9. Abaixe o braço do suporte vigor a 1 mm / min até que os contatos de hidrogel a peça superior da cartilagem e exerce uma força de pré-carga de 0,001 N.
  10. Verter a solução salina 37 ° C no banho até que o volume atinja o nível de água designada. Verificar a temperatura da solução com um termopar.
  11. Permitir que o hidrogel a ser definido para um total de 5 minutos. Uma vez o gel solidificado, elevar o braço, a uma velocidade de 2 mm / min. O teste é concluído bioadesivo uma vez que o substrato se separa do da cartilagem ou quando uma queda significativa na força ocorre,sinalização falha.
  12. Recolher os dados gravados e levante o braço do suporte de teste. Remover o cilindro Delrin do medidor de força. Verter a solução salina em seu recipiente anterior e aquecer a 37 ° C.
  13. Calcular as tensões subtraindo-se a força exercida pelo polímero a partir da força de flutuação de um, o acessório Delrin "em branco" sem cartilagem ou adesivo, levantada na mesma taxa, e dividindo-se pela área de ligação.

5. Estudo Inchaço da PNIPAAm-g-CS com alginato micropartículas

  1. Prepare frascos de vidro limpo e rotulá-los de forma adequada com um ponto de tempo, tipo de amostra e número da amostra. Os adesivos também podem ser criadas, como descrito anteriormente. Preparar um total de cinco amostras (n = 5) para cada tipo de amostra por ponto de tempo.
  2. Pré-pesar todos os frascos de vidro e registar a sua massa inicial a RT.
  3. Usando uma seringa, dispensar aproximadamente 0,4 ml da amostra de adesivo preparada em cada um dos cinco frascos.Repita este passo para cada tipo de amostra em todos os pontos de tempo testados.
  4. Pesar e registar a massa de cada tubo de ensaio com o tipo de amostra de adesivo à TA.
  5. Pré-aquecer uma incubadora orbital e 1 L de solução de 1x PBS a 37 ° C.
  6. Organizar todos os frascos em um rack e inserir o rack na incubadora. Permitir que os adesivos para fazer a transição do estado líquido para um gel para cerca de 5 a 10 min.
  7. Adicionar 5,0 ml de 1x PBS a cada frasco. Certifique-se de adicionar cuidadosamente a solução PBS ao longo do lado do frasco para evitar que o disco de hidrogel de quebrar.
  8. Tapar cada frasco para evitar a evaporação da solução de PBS e manter a temperatura interna da incubadora a 37 ° C. Cada conjunto de discos de hidrogel terá de permanecer submersa em PBS durante um período de tempo designado.
  9. Uma vez que um ponto de tempo de sete dias foi atingido, uncap o conjunto de tubos de ensaio e remover a solução de PBS de cada frasco. Pesar cada frasco com a amostra de adesivo novamente à TA.

6. Viabilidade celular qualitativa utilizando um ensaio Live / Morto

  1. Antes de realizar o ensaio vivo / morto com PNIPAAm-g-CS, crescem de rim embrionário humano (células 293 HEK-293) até 80% de confluência.
    1. Breve e descongelamento da suspensão de células HEK-293 congelada, colocando o frasco de congelação num banho de água a 37 ° C, depois centrifugar as células a 400 xg a 4 ° C durante 5 min num tubo de 15 ml.
    2. Para fazer com que o meio de crescimento celular primeira passagem, combinar em elevado teor de glucose (4,5 g / L) de Dulbecco meio de Eagle modificado (DMEM) com soro inactivado por calor fetal de bovino (FBS) a uma concentração final de 20% e a solução de penicilina-estreptomicina a 100x ( pen-strep) a uma concentração final de 100 UI / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina. Para todas as outras passagens, mudar para DMEM com 10% de FBS e 1x pen-strep.
    3. Ressuspender o sedimento celular em 10 ml de meio de crescimento e transferir a suspensão para um prato de 100 milímetros de diâmetro de petri. uniformemente distribute as células inclinando levemente a frente prato para trás e esquerda para a direita algumas vezes cada sentido.
    4. Cultura das células numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO 2. Se for necessário, alterar o meio de dois em dois dias.
    5. Quando as células atingem a confluência de 80%, a cultura replicar em pratos múltiplos. Remover o meio a partir da placa.
    6. Adicionar 1 ml de 0,5% de tripsina para a placa. Permitir que as placas a incubar a 37 ° C durante 10 min. Verifique para ver se as células separar da superfície rodando suavemente a placa.
    7. Para dividir a cultura 1:10, adicionar 9 ml de meio de crescimento normal (DMEM com FBS a 10%) para as células tratadas com tripsina e misturar suavemente, inclinando o prato.
    8. Pipetar 1 mL da suspensão diluída de células em cada novo prato e adicionar 9 ml de meio de crescimento. Misture suavemente, inclinando o prato.
    9. Cultura das células numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO 2. Se necessário, altere o meio cada vezY dois dias até as células atingem a confluência de 80%.
  2. Remova a mídia a partir de duas placas de cultura cultivados a 80% de confluência.
  3. Adicionar 1 ml de 0,5% de tripsina a cada placa. Permitir que as placas a incubar a 37 ° C durante 10 min. Verifique para ver se as células separar da superfície rodando suavemente a placa.
  4. Lavam-se as células HEK-293 sobre a placa com 3 ml de meio de crescimento e duas vezes adicionar ambas as suspensões para o mesmo tubo de 15 ml.
  5. Centrifuga-se o tubo de 15 ml durante 10 minutos a 400 xg, a 4 ° C.
  6. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 3 ml de meio por pipetagem para cima e para baixo.
  7. Pipetar 10 ul da suspensão de células em um hemocitómetro e executar uma contagem de células para determinar a densidade celular. Aumentar o volume de suspensão de forma, se a concentração de células inicial é demasiado elevada, e por outro lado diminuir o volume, se a concentração for demasiado baixa, a fim de preservar uma concent alvoração de 1 x 10 6 células / ml. Centrifugar as células HEK-293 a 400 xg e ressuspender o pellet celular no volume corrigido dos meios de comunicação em conformidade.
  8. Suavemente vortex a suspensão de células e distribuir uniformemente a mistura de células em quatro tubos de 15 ml cónicas distintas para as seguintes condições de ensaio: monocamada de controlo positivo, de controlo morto negativo em PNIPAAm-g-CS utilizando 70% (v / v) de metanol, HEK-293 células encapsuladas em PNIPAAm-g-CS, e células HEK-293 encapsulados no PNIPAAm-g-CS com micropartículas de alginato.
  9. Criar monocamadas de controlo positivo por pipetagem múltipla 300 volumes ul da mistura de células para uma placa de 24 poços para gerar 4-6 amostras replicadas.
  10. Remova a mídia dos tubos cônicos referentes ao controle de mortos, PNIPAAm-g-CS, e PNIPAAm-g-CS com micropartículas de alginato.
    1. Centrifugar os tubos cónicos durante 5 minutos a 400 x g e eliminar o sobrenadante.
    2. Manter a mesma concentração de células por ressuspensão do cells no mesmo volume de PNIPAAm-g-CS como a mídia removida. Pipeta a mistura de células de polímero cima e para baixo com uma pipeta sorológica até à homogeneidade.
      1. Se a sementeira com micropartículas de alginato, transferir a suspensão de células-CS PNIPAAm g (obtida tal como descrito para o 6.10.2) para um prato de cultura de 35 mm e introduzir as partículas na mistura. Pipeta a mistura célula para cima e para baixo com uma pipeta sorológica até à homogeneidade.
    3. Utilizando a pipeta serológica, dispensar múltiplos 300 ul da mistura de polímero de células em cada um dos alvéolos para controlo morto, PNIPAAm-g-CS, e PNIPAAm-g-CS com micropartículas de alginato para gerar 4 - 6 amostras em replicado.
  11. Incubar a placa a 37 ° C durante 10 a 15 min e permitir que o PNIPAAm-g-CS para a transição de líquido para gel (o polímero forma um disco opaco, branco).
  12. Posicionar uma lâmina mais quente na capa e ajustar a temperatura para 37 ° C. Utilizar a corrediça mais quente para manter a placa bemtemperatura e pipeta de 600 uL de meio de pré-aquecido a cada poço. Para evitar ainda mais a transição do polímero para um estado líquido, posicionar uma lâmpada fluorescente com uma lâmpada acima do prato para aquecer o ar acima dela.
  13. Incubam-se as células durante 5 dias a 37 ° C com 5% de CO 2.
  14. Depois de decorridos cinco dias, preparar a mistura de corante Live / Morto usando homodímero de etídio (EthD-1) e calceína AM. Ambas as substâncias são sensíveis à luz e preparada no dia de uso.
    1. Descongelar o AM de calceína e EthD-1 a partir do kit de RT.
    2. Adicionar 5 ml de estéril 1x PBS para um tubo cônico e envolvê-la em papel alumínio.
    3. Adicionar 6,67 mL de EthD-1 2 ​​mM ao tubo cónico. Vortex da mistura solução completamente.
    4. Em seguida, adicione 2,5 mL de calceína AM 4 mM ao tubo cônico. Vortex a mistura minuciosamente.
  15. Remova a mídia dos poços da monocamada (controle positivo), PNIPAAm-g-CS, e PNIPAAm-g-CS with micropartículas de alginato. Lave todos os poços cuidadosamente, mas suavemente, com PBS e remover o PBS.
  16. Permita que os discos de hidrogel contendo micropartículas de alginato para liquefazer à TA e adicionar 2 ml de citrato de sódio 50 mM a cada um dos poços.
  17. Remova a mídia dos poços de células mortas (controle negativo). Permita que os discos de hidrogel para liquefazer à TA e adicionar 300 ul de 70% (v / v) de metanol a cada cavidade.
  18. Incubar a placa durante 45 minutos a 37 ° C.
  19. Remover o citrato de sódio e soluções de metanol a partir dos poços e pipeta de cada uma das suspensões de hidrogel em tubos de microcentrífuga individuais. Centrifugar os tubos a 2000 x g durante 10 minutos para separar as células a partir da suspensão de hidrogel.
  20. Cuidadosamente remover a suspensão pipetando a solução a partir do tubo cónico e deixando para trás o sedimento celular. Ressuspender o sedimento em 300 ul de PBS e transferir para a placa de poço original.
  21. Adicione 300 ml de tele Live / mistura de corante Morto para cada um dos poços. Enrole a placa bem em folha de alumínio e incubar durante 45 min num agitador à temperatura ambiente.
  22. Imagem todas as amostras sob um microscópio de fluorescência invertido com uma objetiva de 10X. As células vivas e células mortas irá apresentar uma fluorescência verde e vermelho, respectivamente.

7. A viabilidade celular utilizando um ensaio quantitativo de XTT

  1. Crescer as células HEK-293 a 80% de confluência. Remover o meio de crescimento a partir de duas placas de cultura.
  2. Adicionar 1 ml de 0,5% de tripsina a cada placa. Permitir que as placas a incubar a 37 ° C durante 10 min. Verifique para ver se as células separar da superfície rodando suavemente a placa.
  3. Lavam-se as células HEK-293 sobre a placa com 3 ml de meio duas vezes e adicionar ambas as suspensões para o mesmo tubo de 15 ml.
  4. Centrifuga-se o tubo de 15 ml durante 10 minutos a 400 xg, a 4 ° C.
  5. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 3 ml de meiospipetando cima e para baixo.
  6. Pipetar 10 ul da suspensão de células em um hemocitómetro e executar uma contagem de células para determinar a densidade celular. Como descrito anteriormente, preservar uma concentração alvo de 1 x 10 6 células / ml. Centrifugar as células HEK-293 a 400 xg e ressuspender o pellet celular no volume corrigido dos meios de comunicação em conformidade.
  7. Suavemente vortex a suspensão de células e distribuir uniformemente a mistura de células em quatro tubos de 15 ml cónicas distintas para as seguintes condições de ensaio: monocamada de controlo positivo, de controlo morto negativo em PNIPAAm-g-CS utilizando 70% (v / v) de metanol, HEK-293 células encapsuladas em PNIPAAm-g-CS, e células HEK-293 encapsulados no PNIPAAm-g-CS com micropartículas de alginato.
  8. Criar monocamadas de controlo positivo por pipetagem de 300 ul da mistura de células para uma placa de 24 poços para gerar 4 - 6 amostras em replicado.
  9. Remova a mídia dos tubos cônicos referentes ao controle de mortos, PNIPAAm-g-CS, e PNIPAAm-g-CS com micropartículas de alginato.
    1. Centrifugar os tubos cónicos durante 5 min a 400 x g e eliminar o sobrenadante.
    2. Manter a mesma concentração de células por ressuspensão das células no mesmo volume de PNIPAAm-g-CS como os meios de comunicação removido. Pipeta a mistura célula para cima e para baixo com uma pipeta sorológica até à homogeneidade.
      1. Se a sementeira com micropartículas de alginato, transferir a suspensão de células-CS PNIPAAm g num prato de cultura de 35 mm e introduzir as partículas na mistura. Pipeta a mistura célula para cima e para baixo com uma pipeta sorológica até à homogeneidade.
    3. Utilizando a pipeta serológica, dispensar 300 ul da mistura de polímero de células em cada um dos alvéolos para controlo morto, PNIPAAm-g-CS, e PNIPAAm-g-CS com micropartículas de alginato para gerar 4 - 6 amostras em replicado.
  10. Depois de todas as amostras contendo as células foram adicionados à placa de 24 poços, dispensar múltiplos volumes de 300 ul de PNIPAAm-g-CS e PNIPAAm-g-CS com micropartículas de alginato sem células em poços adjacentes para gerar 4 - 6 amostras idênticas.
  11. Incubar a placa de 24 poços a 37 ° C durante 10 a 15 min e permitir que o PNIPAAm-g-CS para a transição de líquido para gel (o polímero forma um disco opaco, branco).
  12. Posicionar uma lâmina mais quente na capa e ajustar a temperatura para 37 ° C. Utilizar a corrediça mais quente para manter assim a temperatura da placa de pipeta e 600 ul de DMEM clara pré-aquecido a cada poço. Para evitar ainda mais a transição do polímero para um estado líquido, posicionar uma lâmpada fluorescente com uma lâmpada acima do prato para aquecer o ar acima dela.
  13. Incubam-se as células durante 5 dias a 37 ° C em 5% de CO 2.
  14. Depois de decorridos cinco dias, preparar o 2,3-bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -2H-tetrazólio-5-carboxanilida reagente (XTT) a partir do fabricante. O reagente XTT é sensível à luz e preparado no dia da utilização.
    1. Retirar a garrafa âmbar contêmção do pó de XTT a partir do frigorífico. Usando uma seringa e uma agulha estéril, injectar 5 ml de DMEM claro (sem vermelho de fenol), através do septo de borracha para a garrafa âmbar.
    2. Aquecer o reagente a 56 ° C num banho de água durante 10 minutos ou até se dissolver.
    3. Diluir o reagente XTT a 20% (v / v) num tubo cónico de 15 ml envolvido em folha de alumínio. Alíquota o excesso de reagente XTT em tubos de microcentrífuga e colocá-los no congelador a -20 ° C para armazenamento a longo prazo.
  15. Remover os meios de comunicação a partir de poços com células mortas (controlo negativo) e adicionar 300 ul de 70% (v / v) de metanol a cada cavidade. Incubar durante 45 min a 37 ° C e remover o metanol a partir dos poços.
  16. Remova a mídia dos poços restantes da monocamada (controle positivo), PNIPAAm-g-CS, e PNIPAAm-g-CS com micropartículas de alginato. Lave todos os poços completamente, mas com cuidado, com PBS e em seguida, remover o PBS.
  17. Adicionar 300 ul da 20% de reagente XTT a cada um dos poços. Envolva a placa de 24 poços com folha de alumínio e incuba-se durante 24 horas num agitador à temperatura ambiente.
  18. Após 24 horas, adicionar 200 ul de citrato de sódio 50 mM a todos os poços e incubar no agitador durante uma hora adicional.
  19. Transfira a totalidade do suspensões de polímero para tubos de microcentrifugação e centrifugar a 2000 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
  20. Transferir 200 ul do sobrenadante de cada tubo de microcentrífuga para uma placa de 96 poços. Utilizando um leitor de placa de microtitulação, obter as leituras de absorvância específicas a 450 nm de absorvância leituras e não específicas a 690 nm.

Resultados

Um co-polímero enxertado de resposta térmica foi sintetizado com sucesso e caracterizado pela sua força bioadesiva, propriedades de intumescimento, e em citocompatibilidade vitro. Nós escolhemos para investigar alginato devido às suas propriedades mucoadesivas bem estabelecidos. As micropartículas de alginato, com um diâmetro médio de 59,7 ± 14,9 uM, foram misturados com 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS, em concentrações de 25, 50, e 75 mg / ml. Estas concentrações ...

Discussão

Há vários passos críticos em sintetizar o composto hidrogel-micropartículas e avaliar a sua força adesiva, inchaço capacidade e biocompatibilidade celular. polimerização de radical livre de PNIPAAm-g-CS requer metacrila��o bem sucedida de sulfato de condroitina, a dissolução completa dos componentes de monómero, e das condições de reacção sem oxigénio. A razão de monómero para NIPAAm sulfato de condroitina metacrilado na mistura de reacção foi escolhida porque foi demonstrado, no nosso trab...

Divulgações

Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de reconhecer com gratidão a ajuda do Dr. Jennifer Kadlowec no desenvolvimento do protocolo de ensaio de tração adesivo.

Pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Artrite e doenças osteomusculares e de pele e do Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número 1R15 AR 063920-01. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilizedAcros Organics2210-25-5Refrigerate and remove stabilier with hexane
Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea)Sigma-Aldrich39455-18-0Refrigerate
HexanesFisher ScientificH302-4Store in a flammable cabinet
50% (w/w) sodium hydroxideFisher ScientificSS254-1Caustic in nature
Methacrylic anhydrideSigma-Aldrich276685Strong fumes; use in a fume hood
AcetoneFisher ScientificA18-4Chill in a refrigerator prior to use
Nitrogen GasPraxair7727-37-9Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas)
Tetramethylethylenediamine, 99% extra pureAcros Organics110-18-9
Ammonium persulfateSigma AldrichA3678Hygroscopic and degrades in the presence of water
Phosphate buffered saline tabletsFisher ScientificBP2944Keep dry
Alginic acid, sodium saltAcros Organics177775000Use heat to aid in dissolving
Calcium chloride dihydrateFisher ScientificC79
Canola oilLocal storeObtain from a local store
Tween 20Sigma-Aldrich93773
70% (v/v) IsopropoanolFisher ScientificA416-4
Porcine earsHaine's Pork ShopObtain from a local butcher
Sodium ChlorideFisher ScientificS271-3
Human embryonic kidney 293 cellsATCCATCC CRL-1573Store in liquid nitrogen for long-term use
DMEM: 1x, high glucose, no pyruvateLife Technologies11965126Refrigerate
Fetal bovine serumLife Technologies10082-147Refrigerate
Penn Strep: 10,000 U/mlLife Technologies15140-122Refrigerate
Trypsin-EDTA: 0.5%, 10xLife Technologies15400-054Refrigerate
MethanolVWRAAA44571-K7
Live/Dead Cell viability kitLife TechnologiesL3224Light sensitive, keep frozen
XTT cell viability kitSigma AldrichTOX2-1KTLight sensitive, keep frozen
Clear DMEM: 1x, high glucose, no phenolLife Technologies21063-029Refrigerate
Dulbecco's PBS: 1xLife Technologies14190136Refrigerate
Sodium citrateEMDSX0445-1
Positive displacement pipetteBrandTech Scientific, INC2702904Dispenses 100 - 500 µl and comes with attachable tips
No 3. Stainless Steel scalpel handleSigma AldrichS2896
Miltex sterile surgical bladesFisher Scientific12-460-440Size 10
Power gem homogenizerFisher Scientific08-451-660Model # 125
Porcelain mortar and pestleSigma AldrichZ247464Holds 50 ml
FreeZone 1 L benchtop freeze dry systemLabconco7740020Freeze samples prior to use
Oil sealed rotary vane pumpEdwardsA65301906Model # RV5
Incubating orbital shakerVWR12620-946Model # 980153
Benchtop refrigerated centrifugeForma Scientific, INCModel # 5682
Heated ovensVWRModel # 1235PC
2 N force gaugeShimpoFGV-0.5XYModel # FGV-0.5XY
E-force test standShimpoFGS-200PVModel # FGS-200PV
Tissue culture swinging bucket centrifugeBeckman Coulter366830Model #6S-6KR
Tissue culture microcentrifugeEppendorfModel #5415C
Hemacytometer setHausser Scientific3720Requires replacement cover glass slips
Slide warmerLab ScientificXH-2022Model # XH-2002
Portable heating lampUnderwriters LaboratoriesHelps to maintain polymer temperature at 37 °C
Inverted fluorescent microscopeZeissModel Axiovert 25 CFL
Heated water bathVWRModel # 1235PC
Rocking platformVWRSeries 100
Multiskan FC microtiter plate readerThermo ScientificType 357
Cell culture incubatorVWRModel # 2350T
Purifier class II biosafety cabinetLabconcoDelta Series

Referências

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