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  • Déclarations de divulgation
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  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.

Résumé

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to lessen the impact of debilitating conditions but remain elusive in many cases. Only by understanding the causes and pathology of diseases associated with aging, can scientists begin to identify potential therapeutic targets and develop strategies for intervention. The most common age-related conditions are neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease and blindness. Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the elderly. Genome wide association studies have previously identified loci that are associated with increased susceptibility to this disease and identified two regions of interest: complement factor H (CFH) and the 10q26 locus, where the age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high-temperature requirement factor A1 (HtrA1) genes are located. CFH acts as a negative regulator of the alternative pathway (AP) of the complement system while HtrA1 is an extracellular serine protease. ARMS2 is located upstream of HtrA1 in the primate genome, although the gene is absent in mice. To study the effects of these genes, humanized knock-in mouse lines of Cfh and ARMS2, knockouts of Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 and HtrA4 as well as a conditional neural deletion of HtrA2 were generated. Of all the genetically engineered mice produced only mice lacking HtrA2, either systemically or in neural tissues, displayed clear phenotypes. In order to examine these mice thoroughly and systematically, an initial phenotyping schedule was established, consisting of a series of tests related to two main diseases of interest: AMD and Parkinson's. Genetically modified mice can be subjected to appropriate experiments to identify phenotypes that may be related to the associated diseases in humans. A phenotyping regimen with a mitochondrial focus is presented here alongside representative results from the tests of interest.

Introduction

les maladies liées à l'âge sont de plus en plus répandue dans la société moderne. Comme la science médicale améliore et l'espérance de vie augmente, la population continue de vieillir et le fardeau de ces maladies augmente. Des traitements efficaces sont nécessaires pour réduire l'impact des conditions débilitantes, mais restent difficiles dans de nombreux cas. Seule la compréhension des causes et de la pathologie des maladies associées au vieillissement scientifiques peuvent commencer à identifier des cibles thérapeutiques potentielles et élaborer des stratégies d'intervention. des conditions liées à l'âge communs comprennent des troubles neurodégénératifs tels que la maladie de Parkinson (PD) et la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA). PD est trouble du mouvement le plus courant causé par la neurodégénérescence chez les humains. La plupart des patients parkinsoniens présentent des symptômes tels que tremblements de repos, bradykinésie et la rigidité après 50 ans. L'apparition précoce a également été observée dans environ 10% des cas.

La DMLA est la principale cause de cécité dansles photorécepteurs, les personnes âgées endommageant progressivement et l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dans l'oeil. La vision centrale est altérée, mais la vision périphérique est généralement affectée. Il existe deux formes de DMLA. Dans la forme «sèche», les dépôts de protéines extracellulaires connus sous forme de drusen entre l'EPR et la membrane de Bruch (BM), conduisant à une atrophie géographique et le flou de la vision centrale. Les "humides" plus sévères forment les résultats de néovascularisation de la choroïde à travers BM dans les couches de l'EPR et de photorécepteurs et peuvent conduire à des hamorrhaging sous la rétine qui provoque des dommages permanents au tissu rétinien. Le génome des études d'association de large ont déjà identifié des loci qui sont associés à une susceptibilité accrue à la maladie et a identifié deux régions d'intérêt: le facteur H du complément (CFH) sur le chromosome 1 et le locus 10q26, où liée à l'âge maculopathie susceptibilité 2 (ARMS2) et à haute température facteur de condition A1 (HtrA1) gènes sont situés 1-5 . Des combinaisons de ces allèles augmentent la probabilité d' une DMLA d'une manière dépendante de la dose et les SNP spécifiques peuvent être associés soit préférentiellement des formes sèches ou humides , de la DMLA 3-6.

CFH agit comme un régulateur négatif de la voie alternative (AP) du système du complément en inhibant l'activation de C3. Un polymorphisme nucléotidique simple (SNP) a été liée à un risque accru d'AMD, ce qui provoque l' échange de la tyrosine 402 dans l' exon 9 avec histidine en raison d'un T à C substitution 1. Dans la DMLA on pense que le PA est misregulated en raison d'une perte de fonction de CFH, mais si le SNP joue un rôle causal est peu claire. Une hypothèse est que l'histidine chargée positivement est pensé à nier la capacité de CFH à se lier à l' interaction des protéines C-réactive protéine et du sulfate d'héparine 1,7. Des études in vitro de CFH Y402H fournissent des résultats contradictoires sur les différences fonctionnelles entre les variantes, et vivo travail Cfh - / - souris exprimant humanisé CFH est en cours 8. ARMS2 est situé en amont HtrA1 dans le génome des primates, bien que le gène est absent chez la souris. HtrA1 est une sérine-protéase, mais ARMS2 est mal caractérisée. Le déséquilibre de liaison entre les SNP dans le locus AMD associée a rendu difficile de déterminer les contributions au risque de mutations individuelles des gènes dans cette région, mais des travaux récents ont suggéré qu'il est surexpression de HtrA1 plutôt que ARMS2 qui mène à la néovascularisation et dépôts de protéines sous - rétiniens 9-11. Toutefois, la proximité des gènes de ce locus peut permettre des interactions qui ne peuvent pas être étudiés en utilisant des transgènes insérés au hasard.

En plus de la DMLA, la famille HtrA de sérine-protéases ont été associées à de nombreuses maladies humaines. Toutes les protéines HtrA contiennent un domaine de sérine-protéase suivi d'au moins un domaine PDZ C-terminale. HtrA1, HtrA3 et HtrA4 partagent le grmanges d'homologie, se composant d'un domaine de peptide signal, de liaison du facteur ressemblant à l'insuline de croissance, un domaine inhibiteur de protéase Kazal, le domaine de la sérine protéase et un domaine PDZ. HtrA2 a une extrémité N-terminale différente, composée d'une séquence de localisation mitochondriale, un domaine transmembranaire et un inhibiteur de domaine de liaison à l' apoptose suivie par la protéase et les domaines PDZ 12-16. HtrA1 chez les mammifères est régulée par le remodelage induit par le substrat dans le site actif de son domaine de protéase 17-20 et HtrA2 peut aussi être modulée par l' interaction entre la sérine protéase et les domaines PDZ qui supprime l' activité de protease 21. Fait intéressant, le domaine PDZ ne semble pas conférer une réglementation similaire à HtrA3 16. Les protéases HtrA peuvent également être réglementées par des facteurs extrinsèques: il a été récemment démontré qu'il existe une interaction réglementaire entre HtrA1 et protoporphyrines 22 et HtrA2 peuvent être régulées par la phosphorylation lors de l' activation de la kinase MAP p38la voie d'une manière dépendante PINK1 23. La suppression des membres individuels de la famille HtrA chez la souris a été documentée, mais les effets mécanistes sont pour la plupart peu claire en partie à cause du manque de phénotypes visibles.

HtrA1 joue un rôle important dans le contrôle de la qualité de la protéine et de sa mauvaise régulation ou la mutation a été associée à de nombreuses maladies humaines différentes , y compris l' arthrite, le cancer et un risque accru de DMLA 3,4,24-32. Perte de la fonction HtrA2 dans les tissus neuronaux ont été associés à des phénotypes parkinsoniens chez les humains et les souris, tandis que sa perte de tissus non neuraux entraîne un vieillissement accéléré 33-37. HtrA3 dysrégulation a été associée à des maladies telles que la pré - éclampsie et certains types de cancer 38,39. Up-régulation de HtrA4 a été observée dans les placentas de patients atteints de prééclampsie , mais les souris knock - out ne pas afficher un phénotype manifeste 40,41. Le manque de phénotypes observés chez certaines souris knock-out a étépostulé pour être le résultat d' une compensation entre le membre de la famille HtrA: on pense que les deux HtrA4 et HtrA1 interagissent avec la famille des protéines TGF-B, ce qui permet une compensation par HtrA1 sur la suppression de HtrA4 41. De même, on pense que depuis HtrA1 et HtrA3 ont un degré élevé d'homologies de domaine qu'ils peuvent avoir des fonctions complémentaires 42. Cependant, il a été suggéré que les protéines HtrA peuvent avoir un rôle partiellement antagonistes, en concurrence pour réguler 43 cibles communes.

Pour approfondir ces facteurs de risque trois lignées de souris knock-in humanisés ont été générés. Dans Cfh TM1 (CFH * 9) jhoh et Cfh TM2 (CFH * 9) jhoh, exon 9 du gène CFH remplacé par exon 9 de l'homologue humain. Cfh TM1 (CFH * 9) jhoh code pour la non-maladie associée tyrosine résidu en position 402, tandis que Cfh tM2 (CFH * 9) jhoh porte le Y402H, SNP de risque associé. DansARMS2 tm1jhoh la séquence ARMS2 humaine a été la cible d'une région en amont de HtrA1. Une séquence d'arrêt loxP flanquée placé en amont de la séquence du gène , mais en aval du promoteur inclus UBIC a été excisé par croisement des souris OzCre, qui expriment la recombinase Cre sous le contrôle du promoteur Rosa26, 34 comme décrit précédemment. En plus de ces knock-in lignes, allèles knock - out conditionnel pour Cfh et HtrA1 (Cfh tm1jhoh et HtrA1 tm1jhoh), ainsi que les autres membres connus de la famille HtrA ont été générés: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) et HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). Les KO lignée germinale ont été créés par le croisement des souris OzCre aux animaux conçus pour flanquer exons spécifiques avec des sites loxP, tels que la suppression provoque un décalage du cadre et / ou suppression du domaine actif (Cfh; exon 3, HtrA1; exons 2-3, HtrA2: exons 2-4, HtrA3; ' exon 3, HtrA4; exons 4-6) 34,41. Une délétion neuronal de HtrA2, supprimé en utilisant Cre recombinase sous le contrôle du promoteur de la nestine (HtrA2 flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J), a également été décrite 34. Seules les souris dépourvues de HtrA2, soit systémique ou dans les tissus neuronaux, affichés phénotypes clairs, présentant des phénotypes parkinsoniens.

Comme certains de ces gènes d'intérêt sont posés à être localisées aux mitochondries 11,44-47, et la suppression de HtrA2 généré phénotypes parkinsoniens, un régime de phénotypage avec un accent mitochondrial et neurologique est décrit ici et des résultats représentatifs des tests d'intérêt sont fournis . Afin d'examiner des souris génétiquement modifiées produites pour enquêter sur l'homme, la maladie liée à l'âge à fond et systématiquement un calendrier de phénotypage initial a été créé, composé d'une série de tests relatifs aux deux principauxmaladies d'intérêt: AMD et de Parkinson.

Protocole

Ethique Déclaration: Les études portant sur des animaux ont été menées en conformité avec les instituts nationaux de recommandations de santé dans le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Commission (IACUC) à l'Université de Yale.

1. Test du comportement des souris génétiquement modifiées

Remarque: Toutes les souris doivent être soumis au même régime de tests pour limiter les différences de habituation à la manipulation. Les essais doivent être effectués à la même heure chaque fois.

  1. Neonatal Hind Limb test
    Note: Le test de membre postérieur est effectué tous les jours de jour postnatal (P) 4 à P10 pour évaluer proximale force musculaire des membres postérieurs, la faiblesse et la fatigue.
    1. souris de transport vers la zone d'essai et laisser reposer pendant 30 minutes avant le test.
    2. Préparer un appareil d'essai par un nettoyage 50 ml tube conique de 70% d'éthanol, en poussant deux (P4-P8) ou un (P9-P10) des boules de coton au fond du tUbe et la fixation dans une position verticale.
    3. Retirer un chiot à partir du poids de la cage et enregistrer. Gardez chiot dans la tenue plateau sur coussin chauffant chaque fois pas tester.
    4. suspendre doucement les membres postérieurs du nouveau-né sur le rebord du tube conique, de telle sorte qu'il est orienté vers le bas vers les boules de coton. Comptez le nombre de tentatives de traction faites et mesure la latence de tomber à l'aide d'un chronomètre.
    5. Répéter une fois de plus, puis étiqueter le chiot avec le marqueur. Ensuite, identifier les chiots P6 par orteil écrêtage. Frottez doucement les chiots avec une literie de cage avant de remplacer.
    6. Essuyez tube conique avec 70% d'éthanol.
    7. Répétez le test sur le prochain chiot jusqu'à ce que toute la litière a été testée.
    8. Jeter boule de coton et d'un tube conique. Nettoyer tout l'équipement avec 70% d'éthanol.
  2. Weanling test Observation
    Note: Le test d'observation de sevrage est administré tous les jours de P19 à P21 pour marquer les niveaux de mouvement et d'activité générale.
    1. souris de transport vers la zone d'essai d'unnd laisser reposer pendant 30 minutes avant le test.
    2. Boîte de test en plexiglas marqué d'une grille de 6x6 de 2 pouces carrés sur la base d'un nettoyage avec 70% d'éthanol préparer. Mettre en place un équipement vidéo sur le côté de telle sorte que toute la boîte est dans le champ de vision. Gardez le mettre en place et alentours de la même chaque jour pour éviter l'introduction de la nouveauté.
    3. Retirer un weanling de la cage et placer dans une tasse de maintien propre. poids Record.
    4. Commencez l'enregistrement vidéo en filmant la carte d'identification de test, avec le numéro d'identification de la souris, l'âge et la date de l'essai. Transférer la souris de tenir tasse à la place du centre. Le temps de trois minutes, en comptant le nombre de lignes parcourues par les deux pattes avant de la souris lors de l'essai.
    5. Retour à la souris un enregistrement vidéo de la cage et l'extrémité propre.
    6. Nettoyer l'appareil d'essai avec 70% d'éthanol.
    7. Répétez jusqu'à ce que tous les déchets est testé, puis retourner tous les chiots à la cage.
    8. Nettoyer tous les équipements de test avec 70% d'éthanol.
    9. Utilisation des vidéos, quantifier le nombre d'élevage des événements en comptant après l'observation visuelle, où une souris se tient avec les deux pattes avant claires de soutien, et des événements, où les deux pattes avant sont engagés dans le nettoyage de toilettage.
  3. Grillage Grip Test de résistance
    Note: Le test de la force de préhension est réalisée sur deux jours entre P22 et P26, pour évaluer la force neuromusculaire.
    1. souris de transport vers la zone d'essai et permettent de se reposer en cage pendant 30 minutes avant le test.
    2. Préparer l'appareil par le nettoyage d'une boîte et maille grille Plexiglas avec 70% d'éthanol. Placez le film à bulles dans le fond de la boîte et couvrir avec du papier.
    3. souris séparés en groupes de trois, en plaçant dans chaque coupelles de retenue.
    4. Placez la première souris sur le centre du treillis métallique et inverser lentement 10-20 cm au-dessus de la surface molle dans le fond de la boîte en plexiglas. Mesurer la latence de tomber à l'aide d'un chronomètre. Terminate test après 60 secondes se sont écoulées si la souris ne fonctionne pastomber.
    5. souris Retour à la tasse de maintien, lingette engrener avec 70% d'éthanol et remplacer le papier sur le film à bulles. Effectuer le test sur les deux souris restantes dans le groupe avant de revenir à la première. Répétez jusqu'à ce que chaque souris a été testé un total de trois fois.
    6. Retour du groupe à une cage propre et continuer avec les groupes restants. S'il y a moins de trois souris dans un groupe quelconque, veiller à ce qu'un 5 min entre les essais intervalle de récupération est autorisé.
    7. Retour toutes les souris à la cage, disposer de papier et de l'équipement d'essai propre avec 70% d'éthanol.

2. Examen de la structure rétinienne

  1. Anesthésier les animaux à P30-35 par injection intraperitoneale de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg). Évaluer la profondeur de l'anesthésie en pinçant la patte et procéder uniquement en l'absence d'une réponse, conformément aux directives du IACUC. Perfuser avec 4% PFA / PBS 48.
  2. Pour supprimer les yeux, nettoyer la peau au si l'incisionTE avec 70% d'éthanol, avant de couper à travers la peau à la base du crâne. Peler la peau pour exposer le crâne et propre avec 70% d'éthanol. Utilisation d'instruments propres, couper soigneusement à travers le crâne pour atteindre les orbites et d'exposer les yeux. Sever le nerf optique, retirez délicatement l'œil de la prise et rincer dans du PBS.
  3. Fixer les yeux dans 4% de PFA / PBS pendant 10 min à température ambiante.
  4. Placez les yeux dans une petite boîte de Pétri contenant du PBS. Faire une petite incision dans le centre de la cornée en utilisant le point de ciseaux d'enlèvement. Retirer la cornée en coupant l'arête entre la cornée et la sclérotique. Utilisez une pince pour enlever l'iris. Enfin, décoller les couches de l'EPR, en laissant intacte la rétine et la lentille en place.
    Note: Les 4% de PFA / PBS fixation va provoquer un détachement RPE permettant l'EPR d'être facilement détachée de l'extérieur de la rétine.
  5. Nouveau fix dans 4% de PFA / 30% de saccharose / PBS pendant 15 min à température ambiante avant de retourner l'oeil à une boîte de Petri contenant du PBS. Retirez le lens en utilisant une pince, ce qui porte le corps vitré avec elle.
  6. Cryoprotect dans 30% de saccharose pendant une nuit à 4 ° C.
  7. yeux Coat dans Optimum composé de coupe de température (OCT) et transfert à un moule enrobage contenant frais octobre. Orienter l'oeil de telle sorte que le plan sagittal est parallèle à la face de coupe, en utilisant le moins de mouvements possibles et d'éviter l'introduction de bulles d'air. gel Flash en immergeant le moule dans un bain de glace / éthanol sec. blocs de conserver à -80 ° C.
  8. L'utilisation d'un cryostat, couper 20 um sections sagittal et de recueillir sur des lames préalablement nettoyées.
  9. Sections Stain avec hématoxyline et éosine selon des protocoles standards 49. L'image à l'aide d'un microscope optique équipé pour la microscopie en champ clair.

3. histochimique Coloration

  1. La préparation des échantillons
    1. Euthanasier animaux à P30-35 utilisant overdose isoflurane (30% dans du propylène glycol) par inhalation de chute libre. Évaluer l'euthanasie par la cessationde la respiration, le rythme cardiaque et l'absence de réponse à pincer la patte. Confirmer la mort par dislocation cervicale et le prélèvement d'organes, conformément aux directives du IACUC.
    2. Pour supprimer le cerveau, nettoyer la peau au niveau du site d'incision avec 70% d'éthanol, avant de couper à travers la peau à la base du crâne. Peler la peau pour exposer le crâne et propre avec 70% d'éthanol. Utilisation d'instruments propres, soigneusement coupés à travers le crâne et enlever pour exposer le cerveau. Retirer les membranes, et retirez délicatement le cerveau de la cavité du crâne. Rincer dans du PBS.
    3. Enduire le cerveau dans l'OCT et le transfert à un moule enrobage contenant frais octobre Orienter le cerveau de telle sorte que le plan sagittal est parallèle à la face de coupe, en utilisant le moins de mouvements possibles et d'éviter l'introduction de bulles d'air. gel Flash en immergeant le moule dans un bain de glace / éthanol sec et conserver à -80 ° C.
    4. L'utilisation d'un cryostat, couper 10 um sections sagittal et de recueillir sur des lames préalablement nettoyées.
  2. NADH diaphorase Coloration
    1. Préparer tampon Tris 0,05 M, à pH 7,6 par dissolution de 5,72 g de Tris-HCl et 1,66 g de Tris base dans de l'eau déminéralisée-1L. Conserver à 4 ° C pendant jusqu'à six semaines.
    2. Préparer la solution de NADH (mM NADH 2,25 dans un tampon Tris 0,05 M). Aliquoter et conserver à -20 ° C.
    3. Préparer une solution NBT (2,5 mM Nitro-Blue tétrazolium dans un tampon Tris 0,05 M). Conserver à 4 ° C pendant jusqu'à six semaines dans une bouteille en verre.
    4. Combiner des volumes égaux de solution NADH et une solution NBT pour faire solution de coloration et ajouter 1 ml à chaque diapositive. Incuber à 37 ° C dans une chambre humidifiée pendant 30 minutes.
    5. Solution de coloration Aspirer et laver trois fois avec dH 2 O.
    6. Laver trois fois chacun dans l' ordre croissant et décroissant des concentrations d'acétone / dH 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) pendant 2 minutes à la température ambiante.
    7. Rincer trois fois en dH 2 O et monter des sections avec un milieu aqueux. L'image à l'aide d'un microscope optique équipé pour lumineux fmicroscopie ield. Coloration au bleu correspond à l'activité enzymatique.
  3. Succinate déshydrogénase histochimique Coloration
    1. Préparer 0,2 M monosodique / phosphate dH 2 O et 0,2 M de phosphate de sodium dibasique / dH 2 O.
    2. Faire 0,2 M de tampon phosphate, pH 7,6, en combinant 3 parties de phosphate monobasique avec 20 parties de phosphate de sodium dibasique.
    3. Préparer une solution de coloration (0,1 M de succinate de sodium, 1,25 M dans un tampon de NBT phosphate 0,2 M) et ajouter 1 ml à chaque diapositive. Incuber à 37 ° C dans une chambre humidifiée pendant 60 min.
    4. Solution de coloration Aspirer et laver trois fois en dH 2 O.
    5. Laver trois fois chacun dans ascendantes et descendantes des concentrations d'acétone / dH 2 O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) pendant 2 minutes à la température ambiante.
    6. Rincer trois fois en dH 2 O et monter des sections avec un milieu aqueux. L'image à l'aide d'un microscope optique équipé pour la microscopie en champ clair. Coloration au bleu correspond enactivité zymatic.

Résultats

Cette section décrit des exemples de résultats obtenus en utilisant ces méthodes. Dans le test de membre postérieur, le nombre d'essais de traction réalisés et le temps d'attente de tomber sont additionnés sur deux essais consécutifs pour chaque jour. Ce test peut être utilisé pour comparer génétiquement différents groupes de distinguer les souris avec une réduction de force neuromusculaire HtrA2 tm1jhoh (HTRA2 KO) de souris dans la Figur...

Discussion

traitements robustes sont nécessaires pour limiter l'impact des conditions liées au vieillissement humain débilitante, mais ils restent hors de portée pour de nombreuses conditions. Pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles et élaborer des stratégies d'intervention, les causes et la pathologie des maladies associées au vieillissement doivent d'abord être compris. Toutes les souris génétiquement modifiées immédiatement présentes avec des phénotypes clairs qui sont liés à la malad...

Déclarations de divulgation

The authors have no competing interests to disclose.

Remerciements

Le financement de cette recherche provient du Fonds de recherche du doyen Yale Medical School (JH) Foundation et médicale Rosebay. Nous remercions le Dr Claire Koenig pour l'aide avec des expériences comportementales. Génétiquement lignées de souris Engineered ont été générés à Ozgene (Perth, Australie).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
EthanolDecon (Fisher Scientific)435541
50 ml conical tubeFisher Scientific1443222
cotton ballsWalmart
heat matSunbeam0000756-500-000
Holding tray (ice cube tray)Walmart
Electronic stopwatchGOGOPC396
Plexiglass boxconstructed in workshop12" by 12" 
Vixia HF R400 CamcorderCanon8155B004
9 oz Clear CupsWalmart
1/4 inch wire meshHome Depot204331884 (online) / 554219 (in store)12" by 12" 
Bubble wrapVWR470092-416
Straight specimen forcepsVWR82027-438
Fine-tip dissecting forcepsVWR82027-408
Fine scissorsVWR82027-578
Paraformaldehyde 16% solutionElectron Microscopy Sciences15710
10x phosphate buffered saline pH 7.4American BioanalyticalAB11072-04000
SucroseJT Baker4072-01
superfrost slidesFisher Scientific12-550-15
Hematoxylin Stain SolutionFisher Scientific (Ricca)353016
Eosin Y Stain SolutionFisher Scientific (Ricca)2845-32
Tris hydrochlorideSigmaT3253
TrisAmerican BioanalyticalAB02000-01000
Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrateSigmaN8129
Nitrotetrazolium Blue chlorideSigmaN6876
AcetoneJT Baker9006-05
Sodium phosphate monobasic monohydrateSigmaS9638
Sodium phosphate dibasic heptahydrateSigmaS9390
Sodium succinate dibasic hexahydrateSigmaS2378
VectaMount aqueous mounting mediumVector LabsH-5501-60
Cover glassFisher Scientific12-545-M60 mm x 24 mm
AxioImager A1 microscopeZeiss
Video camera tripodAmazon
Optimal Cutting Temperature (OCT)Fischer Scientific23730571
Cryostat Sectioning  MachineLeica CM1900Discontinued but since replaced by CM1950

Références

  1. Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308, 385-389 (2005).
  2. Zareparsi, S., et al. Strong association of the Y402H variant in complement factor H at 1q32 with susceptibility to age-related macular degeneration. Am J Hum Genet. 77, 149-153 (2005).
  3. Yang, Z., et al. A variant of the HTRA1 gene increases susceptibility to age-related macular degeneration. Science. 314, 992-993 (2006).
  4. Dewan, A., et al. HTRA1 promoter polymorphism in wet age-related macular degeneration. Science. 314, 989-992 (2006).
  5. Francis, P. J., Zhang, H., Dewan, A., Hoh, J., Klein, M. L. Joint effects of polymorphisms in the HTRA1, LOC387715/ARMS2, and CFH genes on AMD in a Caucasian population. Mol Vis. 14, 1395-1400 (2008).
  6. Cameron, D. J., et al. HTRA1 variant confers similar risks to geographic atrophy and neovascular age-related macular degeneration. Cell Cycle. 6, 1122-1125 (2007).
  7. Herbert, A. P., et al. Structure shows that a glycosaminoglycan and protein recognition site in factor H is perturbed by age-related macular degeneration-linked single nucleotide polymorphism. J Biol Chem. 282, 18960-18968 (2007).
  8. Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor h prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged cfh knockout mice. Am J Pathol. 185, 29-42 (2015).
  9. Nakayama, M., et al. Overexpression of HtrA1 and exposure to mainstream cigarette smoke leads to choroidal neovascularization and subretinal deposits in aged mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 6514-6523 (2014).
  10. Liu, J., Hoh, J. Postnatal overexpression of the human ARMS2 gene does not induce abnormalities in retina and choroid in transgenic mouse models. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, 1387-1388 (2015).
  11. Kanda, A., et al. A variant of mitochondrial protein LOC387715/ARMS2, not HTRA1, is strongly associated with age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16227-16232 (2007).
  12. Zumbrunn, J., Trueb, B. Primary structure of a putative serine protease specific for IGF-binding proteins. FEBS Lett. 398, 187-192 (1996).
  13. Clausen, T., Southan, C., Ehrmann, M. The HtrA family of proteases: implications for protein composition and cell fate. Mol Cell. 10, 443-455 (2002).
  14. Nie, G. Y., Hampton, A., Li, Y., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Identification and cloning of two isoforms of human high-temperature requirement factor A3 (HtrA3), characterization of its genomic structure and comparison of its tissue distribution with HtrA1 and HtrA2. Biochem J. 371, 39-48 (2003).
  15. Runyon, S. T., et al. Structural and functional analysis of the PDZ domains of human HtrA1 and HtrA3. Protein Sci. 16, 2454-2471 (2007).
  16. Glaza, P., et al. Structural and Functional Analysis of Human HtrA3 Protease and Its Subdomains. PLoS One. 10, e0131142. 10, e0131142 (2015).
  17. Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3, 380-387 (2003).
  18. Grau, S., et al. Implications of the serine protease HtrA1 in amyloid precursor protein processing. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6021-6026 (2005).
  19. Lecha, M., Puy, H., Deybach, J. C. Erythropoietic protoporphyria. Orphanet J Rare Dis. 4, 19 (2009).
  20. Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chem Soc Rev. 40, 340-362 (2011).
  21. Li, W., et al. Structural insights into the pro-apoptotic function of mitochondrial serine protease HtrA2/Omi. Nat Struct Biol. 9, 436-441 (2002).
  22. Jo, H., Patterson, V., Stoessel, S., Kuan, C. Y., Hoh, J. Protoporphyrins enhance oligomerization and enzymatic activity of HtrA1 serine protease. PLoS One. 9, 115362 (2014).
  23. Bogaerts, V., et al. Genetic variability in the mitochondrial serine protease HTRA2 contributes to risk for Parkinson disease. Hum Mutat. 29, 832-840 (2008).
  24. Baldi, A., et al. The HtrA1 serine protease is down-regulated during human melanoma progression and represses growth of metastatic melanoma cells. Oncogene. 21, 6684-6688 (2002).
  25. Oka, C., et al. HtrA1 serine protease inhibits signaling mediated by Tgfbeta family proteins. Development. 131, 1041-1053 (2004).
  26. Chien, J., et al. A candidate tumor suppressor HtrA1 is downregulated in ovarian cancer. Oncogene. 23, 1636-1644 (2004).
  27. Grau, S., et al. The role of human HtrA1 in arthritic disease. J Biol Chem. 281, 6124-6129 (2006).
  28. Chien, J., et al. Serine protease HtrA1 modulates chemotherapy-induced cytotoxicity. J Clin Invest. 116, 1994-2004 (2006).
  29. Chien, J., Campioni, M., Shridhar, V., Baldi, A. HtrA serine proteases as potential therapeutic targets in cancer. Curr Cancer Drug Targets. 9, 451-468 (2009).
  30. Hara, K., et al. Association of HTRA1 mutations and familial ischemic cerebral small-vessel disease. N Engl J Med. 360, 1729-1739 (2009).
  31. Jones, A., et al. Increased expression of multifunctional serine protease, HTRA1, in retinal pigment epithelium induces polypoidal choroidal vasculopathy in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14578-14583 (2011).
  32. Vierkotten, S., Muether, P. S., Fauser, S. Overexpression of HTRA1 leads to ultrastructural changes in the elastic layer of Bruch's membrane via cleavage of extracellular matrix components. PLoS One. 6, e22959 (2011).
  33. Strauss, K. M., et al. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson's disease. Hum Mol Genet. 14, 2099-2111 (2005).
  34. Patterson, V. L., et al. Neural-specific deletion of Htra2 causes cerebellar neurodegeneration and defective processing of mitochondrial OPA1. PLoS One. 9, 115789 (2014).
  35. Jones, J. M., et al. Loss of Omi mitochondrial protease activity causes the neuromuscular disorder of mnd2 mutant mice. Nature. 425, 721-727 (2003).
  36. Martins, L. M., et al. Neuroprotective role of the Reaper-related serine protease HtrA2/Omi revealed by targeted deletion in mice. Mol Cell Biol. 24, 9848-9862 (2004).
  37. Kang, S., et al. Loss of HtrA2/Omi activity in non-neuronal tissues of adult mice causes premature aging. Cell Death Differ. 20, 259-269 (2013).
  38. Dynon, K., et al. HtrA3 as an early marker for preeclampsia: specific monoclonal antibodies and sensitive high-throughput assays for serum screening. PLoS One. 7, e45956 (2012).
  39. Singh, H., et al. HtrA3 Is Downregulated in Cancer Cell Lines and Significantly Reduced in Primary Serous and Granulosa Cell Ovarian Tumors. J Cancer. 4, 152-164 (2013).
  40. Inagaki, A., et al. Upregulation of HtrA4 in the placentas of patients with severe pre-eclampsia. Placenta. 33, 919-926 (2012).
  41. Liu, J., Li, Y., Hoh, J. Generation and characterization of mice with a conditional null allele of the HtrA4 gene. Mol Med Rep. , (2015).
  42. Bowden, M. A., Di Nezza-Cossens, L. A., Jobling, T., Salamonsen, L. A., Nie, G. Serine proteases HTRA1 and HTRA3 are down-regulated with increasing grades of human endometrial cancer. Gynecol Oncol. 103, 253-260 (2006).
  43. Chen, Y. Y., et al. Functional antagonism between high temperature requirement protein A (HtrA) family members regulates trophoblast invasion. J Biol Chem. 289, 22958-22968 (2014).
  44. Fritsche, L. G., et al. Age-related macular degeneration is associated with an unstable ARMS2 (LOC387715) mRNA. Nat Genet. 40, 892-896 (2008).
  45. Beleford, D., Rattan, R., Chien, J., Shridhar, V. High temperature requirement A3 (HtrA3) promotes etoposide- and cisplatin-induced cytotoxicity in lung cancer cell lines. J Biol Chem. 285, 12011-12027 (2010).
  46. Hegde, R., et al. Identification of Omi/HtrA2 as a mitochondrial apoptotic serine protease that disrupts inhibitor of apoptosis protein-caspase interaction. J Biol Chem. 277, 432-438 (2002).
  47. Martins, L. M., et al. The serine protease Omi/HtrA2 regulates apoptosis by binding XIAP through a reaper-like motif. J Biol Chem. 277, 439-444 (2002).
  48. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
  49. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008. 2008, (2008).
  50. Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72, 251-264 (1974).
  51. El-Khodor, B. F., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212, 29-43 (2008).
  52. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
  53. Chance, B., Williams, G. R., Holmes, W. F., Higgins, J. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. V. A mechanism for oxidative phosphorylation. J Biol Chem. 217, 439-451 (1955).
  54. Kamo, N., Muratsugu, M., Hongoh, R., Kobatake, Y. Membrane potential of mitochondria measured with an electrode sensitive to tetraphenyl phosphonium and relationship between proton electrochemical potential and phosphorylation potential in steady state. J Membr Biol. 49, 105-121 (1979).
  55. Brown, G. C., Brand, M. D. Proton/electron stoichiometry of mitochondrial complex I estimated from the equilibrium thermodynamic force ratio. Biochem J. 252, 473-479 (1988).

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