노화의 인간의 질병에 관여 유전자를 연구에 사용 된 유전자 변형 마우스에 대한 표현형 요법

요약

A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.

초록

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to lessen the impact of debilitating conditions but remain elusive in many cases. Only by understanding the causes and pathology of diseases associated with aging, can scientists begin to identify potential therapeutic targets and develop strategies for intervention. The most common age-related conditions are neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease and blindness. Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the elderly. Genome wide association studies have previously identified loci that are associated with increased susceptibility to this disease and identified two regions of interest: complement factor H (CFH) and the 10q26 locus, where the age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high-temperature requirement factor A1 (HtrA1) genes are located. CFH acts as a negative regulator of the alternative pathway (AP) of the complement system while HtrA1 is an extracellular serine protease. ARMS2 is located upstream of HtrA1 in the primate genome, although the gene is absent in mice. To study the effects of these genes, humanized knock-in mouse lines of Cfh and ARMS2, knockouts of Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 and HtrA4 as well as a conditional neural deletion of HtrA2 were generated. Of all the genetically engineered mice produced only mice lacking HtrA2, either systemically or in neural tissues, displayed clear phenotypes. In order to examine these mice thoroughly and systematically, an initial phenotyping schedule was established, consisting of a series of tests related to two main diseases of interest: AMD and Parkinson's. Genetically modified mice can be subjected to appropriate experiments to identify phenotypes that may be related to the associated diseases in humans. A phenotyping regimen with a mitochondrial focus is presented here alongside representative results from the tests of interest.

서문

연령 관련 질환은 현대 사회에서 점점 더 널리되고있다. 의료 과학이 향상되고 평균 수명이 증가함에 따라, 인구는 계속 나이를 이러한 질병의 부담이 커집니다. 효과적인 치료법은 쇠약 조건의 영향을 줄이기 위해 필요하지만, 많은 경우에 어려운 남아있다. 만 원인 및 노화와 관련된 질병의 병리를 이해함으로써 과학자들은 개입 전략을 잠재적 인 치료 목표를 식별하고 개발을 시작할 수 있습니다. 일반적인 노화와 관련된 상태는 파킨슨 병 (PD), 연령 관련 황반 변성 (AMD)과 같은 신경 퇴행성 장애를 포함한다. PD는 인간의 신경 퇴행에 의한 가장 일반적인 운동 장애이다. 대부분의 PD 환자는 50 세 이후 진전, 운동 완만 및 강성을 휴식 등의 증상을 보여줍니다. 조기 개시는 경우 약 10 %에서 관찰되었다.

AMD는 실명의 주요 원인입니다노인 점진적 감광체 손상 및 눈의 망막 색소 상피 (RPE). 중심 시력이 손상되지만 주변 시력은 일반적으로 영향을받지 않습니다. AMD의 두 가지 형태가있다. "가공"형태에서, RPE와 브루흐의 막 (BM) 사이 드루 젠의 형태로 알려진 세포 외 단백질 예금, 지리적 위축으로 이어지는 중앙 비전의 흐림. 더 심각한 "습식"형태의 망막 색소 상피와 광 수용체 층에 BM에서 맥락막 신생 혈관에서의 결과와는 망막 조직에 영구적 인 손상을 유발하는 망막 아래에 hamorrhaging으로 이어질 수 있습니다. 1 번 염색체 및 10q26 궤적, 연령 관련 황반 병증 감수성이 (ARMS2)과에 보체 인자 H (CFH) : 게놈 넓은 협회 연구는 이전에이 질환이 증가 감수성과 관련된 관심의 두 영역을 식별 궤적을 확인했다 고온 조건 팩터 A1 (HtrA1) 유전자 ^1-5 위치한 . 이러한 대립 유전자의 조합 투여 량 의존적으로 AMD의 가능성을 증가시키고 특정 SNP를 우선적 AMD ^3-6의 습식 또는 건식 형태 중 하나와 연관 될 수있다.

CFH는 C3의 활성화를 억제함으로써 보체 시스템의 대체 경로 (AP)의 음성 조절제로서 작용한다. 단일 염기 다형성 (SNP)이 때문에 C 대체 ^1에 T에 히스티딘과 엑손 9 티로신 (402)의 교환을 일으키는 원인이 AMD의 위험 증가에 연결되어 있습니다. AMD에이 AP 때문에 CFH의 기능의 손실이 있지만, SNP는 인과 적 역할은 분명하지 않다 재생되는지 misregulated 것으로 여겨진다. 한 가설은 양전하 히스티딘 단백질 헤파린 설페이트 ^1,7- 단백질 반응성 C 상호 작용에 결합 CFH의 능력을 무효로하는 것으로 생각된다는 것이다.에서 CFH Y402H 시험 관내 연구 변종 간의 기능 차이 위에 충돌하는 결과를 제공하고,의 작업을 생체 내에 CFH ^{- / -} 인간화 CFH ⁸ 진행되고 발현하는 마우스. 유전자가 쥐에 존재하지만 ARMS2는 영장류 게놈 HtrA1의 상류에 위치한다. HtrA1는 세린 프로테아제하지만 ARMS2 저조한 특징입니다. AMD의 관련 현장에서의 SNP 사이의 연관 불균형이 어려운이 지역에서 유전자의 개별 돌연변이의 위험에 기여를 결정했다,하지만 최근의 작업은 혈관 신생에 이르게 오히려 ARMS2보다 HtrA1의 과발현이 있음을 제안하고 망막 단백질 예금 ^9-11. 그러나,이 로커스에서 유전자의 근접 임의로 삽입 된 유전자를 이용하여 연구 할 수없는 상호 작용을 허용 할 수있다.

AMD에 더하여, 세린 프로테아제의 HtrA 가족 많은 인간 질환과 관련되어있다. 모든 HtrA 단백질은 적어도 하나의 C 말단 PDZ 도메인 뒤에 세린 프로테아제 도메인을 함유한다. HtrA1, HtrA3 및 HtrA4은 GR을 공유신호 펩타이드, 인슐린 유사 성장 인자 결합 도메인, Kazal 프로테아제 억제제 도메인의 세린 프로테아제 도메인과 PDZ 도메인 이루어진 eatest 동성. HtrA2은 미토콘드리아 파악 시퀀스 경막 도메인 이루어지는 다른 N 말단을 가지며 아폽토시스 결합 도메인의 프로테아제 억제제 및 PDZ 도메인 ^12-16 하였다. 포유류 HtrA1은 프로테아제 도메인 ^17-20의 활성 부위에있는 기판 유도 개조에 의해 조절되고, HtrA2은 프로테아제 ^활성을 억제 ⁽²¹⁾ 세린 프로테아제 및 PDZ 도메인 간의 상호 작용에 의해 조절 될 수있다. 흥미롭게도, PDZ 도메인은 HtrA3 ^(16)에 유사한 규정을 부여 나타나지 않습니다. 이는 최근 HtrA1 사이 규제 작용이 존재 함을 증명 하였다 ^(22)와 protoporphyrins HtrA2이 P38의 MAP 키나제의 활성화시 인산화에 의해 조절 될 수있다 다음 HtrA 프로테아제는 외적 요인에 의해 조절 될 수있다PINK1 의존적으로 ²³ 통로입니다. 마우스의 HtrA 가족의 개별​​ 구성원의 삭제는 그러나 기계적인 효과는 대부분 부분적으로 볼 수 표현형의 부족으로 불분명, 문서화되고있다.

HtrA1 단백질 품질 제어에 중요한 기능을 담당하고 그 misregulation 또는 돌연변이 성 관절염, 암, AMD ^3,4,24-32 위험의 증가 등 다양한 인간 질환과 관련되어있다. 가속 비 신경 조직 결과에서의 손실이 ^{33-37 노화} 동안 신경 조직에 HtrA2 기능의 상실은 인간과 생쥐의 PD의 표현형과 관련되어있다. HtrA3의 조절 곤란이 자간전증과 암 ^{(38, 39)의} 특정 유형을 포함하여 질병과 관련이있다. 최대 규제 HtrA4의는 명백한 표현형 ^{40, 41를} 표시하지 않습니다 자간전증 환자하지만 녹아웃 생쥐의 태반에서 관찰되었다. 일부 녹아웃 마우스에서 관찰 된 표현형의 부족은있다HtrA의 가족 구성원 사이의 보상의 결과로 가정 :이 HtrA4과 HtrA1 모두 HtrA4 ^(41)의 삭제에 HtrA1에 의해 보상을 허용, 단백질의 TGF-B 가족과 함께 상호 작용하는 것으로 생각된다. 유사하게, HtrA1 및 HtrA3 도메인 동성 높은 수준을 가지므로 그들은 상보 기능 ^(42)을 가질 수 있다고 생각된다. 그러나 HtrA 단백질 공통 타겟 ^(43)을 조절하는 경쟁 부분적 길항제 역할을 가질 수 있음을 제안하고있다.

또한 이러한 위험을 조사하기 위해 세 가지 인간화 녹아웃 마우스 라인 생성 된 요인. CFH의 ^{TM1에서는 (CFH * 9) jhoh} 및 CFH의 ^{TM2 (CFH * 9) jhoh} 상기 CFH 유전자의 엑손 9. 인간 동족체의 엑손 9 치환 CFH의 ^{TM1된다 (CFH는 * 9) jhoh은} 비 질병 관련 티로신 인코딩 Y402H, 위험 관련 SNP를 전달 ^jhoh CFH의 ^{TM2 (CFH * 9)} 반면 위치 (402)에서 잔류 물. 에서인간 ARMS2 순서 ^tm1jhoh ARMS2는 HtrA1의 상류 지역을 대상으로 하였다. 유전자 서열 그러나 포함 UBIC 프로모터 하류의 상류 놓인에 loxP-측면 STOP 시퀀스는 이전 ³⁴ 바와 같이, Rosa26 프로모터의 제어하에 Cre 호텔 재조합 효소를 발현 OzCre 마우스로 건너 절제 하였다. 뿐만 아니라이 노크에 선, CFH 및 HtrA1 (CFH ^tm1jhoh 및 HtrA1의 ^{tm1jhoh)뿐만} 아니라 다른 알려진 HtrA 가족 구성원에 대한 조건부 녹아웃 대립 유전자가 생성 : HtrA2 (HtrA2의 ^tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3의 ^tm1jhoh) 및 HtrA4 ( HtrA4의 ^tm1jhoh). 엑손 3, HtrA1; 세균 줄 녹아웃은 삭제 활성 도메인 (CFH의 프레임 이동 및 / 또는 삭제를 발생하도록에 loxP 사이트와 특정 엑손의 측면하도록 설계 동물 OzCre 마우스를 교차하여 만든 엑손 2엑손 2-4, HtrA3; HtrA2, -3 엑손 3, HtrA4; 4-6) ^34,41를 엑손. HtrA2의 신경 삭제, 네 스틴 프로모터의 제어하에 Cre 호텔 재조합 효소를 사용하여 삭제 (HtrA2 ^flox, Tg는 (네스-CRE) 1Kln / J)는도 ^34을 설명 하였다. HtrA2가없는 전용 마우스, 중 전신 또는 신경 조직에서는 파킨슨 표현형으로 제시, 분명 표현형을 표시.

관심의 유전자 중 일부는 미토콘드리아 ^11,44-47 언어로 번역 될 상정하고, HtrA2의 삭제는 파킨슨 표현형, 미토콘드리아 및 신경 학적 초점을 맞춘 표현형 요법 여기에 설명되어 관심의 시험에서 대표적인 결과가 제공되어 생성되기 때문에 . 두 개의 주요 관련된 일련의 테스트 이루어진 체계적 초기 표현형 계획이 수립되었다 완전히 인간, 연령 관련 질환을 연구하고 생산 된 유전자 변형 마우스를 조사하기 위해서관심의 질환 : AMD와 파킨슨.

프로토콜

윤리 문 : 동물과 관련된 연구는 예일 대학의 실험실 동물의 관리 및 사용과 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 가이드 건강 권고의 국립 연구소 준수 실시 하였다.

유전자 변형 마우스 1. 행동 테스트

주 : 모든 마우스는 처리에 습관화 차이를 제한하기 위해 동일한 시험 요법을 실시해야한다. 시험 날의 동일한 시간마다 수행되어야한다.

1. 신생아 뒷다리 테스트
   주 : 뒷다리 시험 근위 뒷다리 근력, 쇠약 및 피로를 평가하기 위하여 생후 P10로 일 (P) 4 매일 수행된다.
   1. 시험 영역으로 전송 마우스는 시험 전에 30 분 동안 휴식을 허용합니다.
   2. t의 바닥에 두 개 (P4-P8) 또는 1 (P9-P10)면 공을 추진, 70 % 에탄올로 50 ML 원뿔 튜브를 청소하여 시험 장치를 준비우베는 수직 위치에 고정.
   3. 케이지 기록 무게에서 한 강아지를 제거합니다. 테스트하지 때마다 열 패드 트레이를 들고 강아지를 유지합니다.
   4. 부드럽게는면 공을 향해 아래로 향하게되도록, 원뿔 튜브의 변죽을 통해 신생아의 뒷다리를 일시 중지합니다. 스톱워치를 사용하여 가을에 만든 풀 시도 및 측정 대기 시간의 수를 계산합니다.
   5. 마커와 강아지 레이블을 한 번 더 반복 한 다음. 그 후, 발가락 클리핑에 의해 P6 새끼를 식별합니다. 교체하기 전에 홈 케이지에서 침구 부드럽게 새끼를 문질러.
   6. 70 % 에탄올로 원뿔 튜브를 닦아주십시오.
   7. 전체 쓰레기가 테스트 될 때까지 다음 강아지에 테스트를 반복합니다.
   8. 목화 공 및 원뿔 튜브 폐기하십시오. 70 % 에탄올로 청소 모든 장비.
2. 젖을 갓 뗀 관측 테스트
   참고 : 젖을 갓 뗀 관찰 시험은 운동과 일반 활동 수준을 점수로 P21로 P19 매일 투여한다.
   1. 테스트 영역 (A)에 전송 생쥐차 테스트하기 전에 30 분 동안 휴식을 할 수 있습니다.
   2. 70 % 에탄올로 세척하여 기본 2 인치 사각형의 좁은 격자 표시 플렉시 글라스 테스트 상자를 준비합니다. 전체 상자가보기 필드에되도록 측에 비디오 장치를 설정합니다. (가) 설정하고 새로운 항목을 도입 피하기 위해 매일 같은 환경 유지.
   3. 깨끗한 유지 컵에 케이지와 장소에서 한 젖을 갓 뗀를 제거합니다. 녹음 무게.
   4. 마우스 식별 번호, 나이, 테스트 날짜, 시험 인증 카드를 촬영하여 동영상 촬영을 시작한다. 중앙 광장에 컵을 들고에서 마우스를 전송합니다. 3 분 동안 시간 시험 동안, 마우스 두 앞발로 이송 라인 수를 카운트.
   5. 깨끗한 케이지과 끝 비디오 녹화에 마우스를 돌려줍니다.
   6. 70 % 에탄올로 시험 장치를 청소합니다.
   7. 모든 쓰레기가 테스트 될 때까지 다음 홈 케이지에 모든 새끼를 반환 반복합니다.
   8. 70 % 에탄올로 청소 모든 시험 장비.
   9. 동영상을 사용하여, 마우스 지원의 명확한 두 앞발을 의미 경우, 육안 관찰 후 집계, 두 앞발이 청소에 종사하는 이벤트를 정리하여 이벤트를 양육의 수를 정량.
3. 와이어 메쉬 그립 강도 시험
   주 : 악력 시험 P22과 P26 사이의 다른 일 실시하고, 신경 근육 강도를 평가.
   1. 시험 영역으로 전송 마우스 및 테스트하기 전에 30 분 동안 홈 케이지 휴식 할 수 있습니다.
   2. 70 % 에탄올과 플렉시 글라스 상자와 메쉬 그리드를 청소하여 장치를 준비합니다. 상자의 바닥에 버블 랩을 놓고 종이 커버.
   3. 개별 지주 컵에 배치하는 세 그룹으로 분리 된 쥐.
   4. 와이어 메쉬의 중심에 최초의 마우스를 놓고 천천히 플렉시 글라스 상자의 아래쪽에있는 부드러운 표면 위에 10-20cm를 반전. 스톱워치를 사용하여 떨어 대기 시간을 측정한다. 마우스를하지 않는 경우 60 초 경과 후 시험을 종료가을.
   5. 70 % 에탄올로 메쉬와 버블 랩을 통해 용지를 교체 와이프 ​​들고 컵에 마우스를 돌려줍니다. 처음으로 돌아 가기 전에 그룹의 나머지 두 쥐에 대한 테스트를 실시한다. 각 마우스가 세 번 총을 시험 때까지 반복합니다.
   6. 깨끗한 케이지에 그룹을 반환하고 나머지 그룹을 계속합니다. 어떤 그룹의 세 가지 마우스보다 적은 경우, 5 분 간 재판 복구 간격이 허용되어 있는지 확인합니다.
   7. 홈 케이지에 마우스를 모두 반환 70 % 에탄올로 종이와 깨끗한 시험 장비 폐기하십시오.

망막 구조 2. 시험

1. 복강 내 케타민 주사 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)에 의해 P30-35에서 동물을 마취. 발바닥을 협지함으로써 마취 깊이를 평가하고 IACUC 지침 라인에만 응답의 부재하에 수행. 4 % PFA / PBS ⁽⁴⁸⁾ 관류.
2. 절개시에 피부를 청소, 눈을 제거하려면두개골의베이스에 피부를 통해 절단하기 전에, 70 % 에탄올로 테. 70 % 에탄올로 두개골과 청소를 노출 피부를 벗겨. 깨끗한기구를 사용하여주의 깊게 눈 소켓 도달 눈을 노출 두개골을 잘랐다. 조심스럽게 소켓에서 눈을 제거하고 PBS로 씻어, 시신경을 절단.
3. 실온에서 10 분 동안 4 % PFA / PBS에서 쳐다.
4. PBS를 포함하는 작은 페트리 접시에 눈을 넣습니다. 스티치 제거 가위를 사용하여 각막의 중앙에 작은 절개 부위를 만든다. 각막과 공막 사이의 가장자리를 절단하여 각막을 제거합니다. 조리개를 제거하기 위해 집게를 사용합니다. 마지막으로, 망막 손상과 장소에 렌즈를 떠나 RPE 층을 벗겨.
   주 : 4 % PFA / PBS에서 고정이 RPE 쉽게 망막의 외부로부터 박리 할 수​​ RPE 박리의 원인이된다.
5. 다시 수정 PBS를 함유하는 페트리 접시에 눈에 반환하기 전에 4 % PFA / 30 % 수 크로스, 실온에서 15 분 / PBS있다. 렌은 잡아 당깁니다그것과 함께 유리체을 가져, 집게를 사용하여이야.
6. 밤새 4 ° C에서 30 % 자당에 Cryoprotect.
7. 신선한 OCT를 포함하는 포함 금형에 최적의 절단 온도 화합물 OCT () 및 전송에 코트 눈. 시상면은 가능한 한 적은 수의 동작을 사용하여 기포의 도입을 피 절삭면과 평행이되도​​록 눈의 방향. 드라이 아이스 / 에탄올 욕에 침지하여 주형 플래시 동결. -80 ° C에서 보관 블록.
8. 그라 이오 스탯을 사용하여 20 μm의 시상 부분을 잘라 미리 세정 슬라이드에 수집합니다.
9. 표준 프로토콜 ^49에 따라 헤 마톡 실린 및 에오신으로 얼룩 부분. 밝은 필드 현미경을 위해 장착 된 광학 현미경을 사용하여 이미지.

3. 조직 화학적 염색

1. 샘플 준비
   1. 오픈 드롭 흡입을 통해 이소 플루 란 과다 복용 (프로필렌 글리콜 30 %)를 사용하여 P30-35에서 동물을 안락사. 중단에 의해 안락사 평가호흡, 심장 박동 및 발바닥을 곤란에 대한 응답의 부족. IACUC 지침에 맞춰 자궁 경부 전위 및 장기 제거에 의해 죽음을 확인합니다.
   2. 두개골의 기지에서 피부를 통해 절단하기 전에, 70 % 에탄올로 절개 부위의 피부를 청소, 뇌를 제거합니다. 70 % 에탄올로 두개골과 청소를 노출 피부를 벗겨. 조심스럽게 두개골을 잘라 깨끗한 도구를 사용하여 뇌를 노출 제거합니다. 멤브레인을 제거하고 부드럽게 두개골 캐비티에서 뇌를 제거합니다. PBS로 씻어.
   3. 신선한 OCT를 포함하는 포함 금형에 OCT 뇌 및 전송 코트. 시상면은 가능한 한 적은 수의 동작을 사용하여 기포의 도입을 피 절삭면과 평행이되도​​록 방향을 뇌. -80 ° C에서 드라이 아이스 / 에탄올 욕조와 저장소에 금형을 침지하여 플래시 동결.
   4. 그라 이오 스탯을 사용하여 10 μm의 시상 부분을 잘라 미리 세정 슬라이드에 수집합니다.
<리> NADH 디아 포라 염색
1. 1L-탈 이온수에 5.72 g 트리스 - 염산 및 1.66 g의 트리스 기반을 용해하여 0.05 M 트리스 완충액, pH가 7.6을 준비합니다. 최대 6 주 동안 4 ° C에서 보관하십시오.
2. NADH 용액 (0.05 M 트리스 완충액에서 2.25 mM의 NADH)를 준비합니다. -20 ° C에서 나누어지는 및 저장.
3. NBT 용액 (0.05 M 트리스 완충액 2.5 mM의 니트로 블루 테트라 졸륨)를 준비합니다. 유리 병에 최대 6 주 동안 4 ° C에서 보관하십시오.
4. 염색 액을 각각의 슬라이드에 1 ml에 추가 NADH 솔루션 및 NBT 솔루션의 동일한 볼륨을 결합합니다. 30 분간 가온 챔버 내에 37 ℃에서 인큐베이션.
5. 대기음 염색 액과 DH ₂ O.로 3 회 씻어
6. 오름차순 및 내림차순 아세톤 농도로 3 회 세척 / DH ₂ 0 (30 %, 60 %, 90 %, 60 %, 30 %)을 실온에서 2 분.
7. DH ₂ O에 세 번 씻어 수성 매체 섹션을 탑재합니다. 광학 현미경을 사용하여 이미지의 밝은 f를 위해 장착의 ield 현미경. 블루 염색 효소 활성에 해당합니다.
2. 탈수소 효소 조직 화학 염색을 숙시 네이트
   1. 0.2 M 나트륨 염기 인산 / DH ₂ O 0.2 M 나트륨 이염 인산 / DH ₂ O. 준비
   2. 20 부 나트륨 이염 인산 3 부 염기성 인산을 결합하여 0.2 M 인산 완충액, pH가 7.6를 확인합니다.
   3. 염색 용액 (0.1 M 나트륨 숙시 네이트, 0.2 M 인산 완충액 1.25 M NBT)를 준비하고 각각의 슬라이드에 1 ml에 추가 할 수 있습니다. 60 분 동안의 가습 챔버 내에서 37 ℃에서 인큐베이션.
   4. 대기음 염색 액과 DH ₂ O. 세 번 씻어
   5. 오름차순으로 3 회 세척하고 아세톤의 농도를 내림 / DH ₂ O (30 %, 60 %, 90 %, 60 %, 30 %)을 실온에서 2 분.
   6. DH ₂ O에 세 번 씻어 수성 매체 섹션을 탑재합니다. 밝은 필드 현미경을 위해 장착 된 광학 현미경을 사용하여 이미지. 블루 염색은 실내에 해당zymatic 활동.

결과

이 섹션에서는 이러한 방법을 사용하여 얻을 수있는 결과의 예를 설명합니다. 뒷 사지 시험에서, 풀 시도 횟수가 이루어지고 지연은 매일 두 개의 연속적인 시험을 통해 합산되어 낙하. .이 시험은 감소 신경근 강도 HtrA2의 ^tm1jhoh 쥐 구별 전적으로 다른 그룹과 비교하는데 사용될 수있다 (HTRA2 KO)도 1a에 마우스 - B는 P4-6에서 감소 하?...

토론

강력한 치료법은 인간의 노화와 관련된 쇠약 상태의 영향을 제한 할 필요가 있지만, 여러 조건을 피하는 유지된다. 잠재적 인 치료 목표를 식별하고 개입 전략을 개발하기 위해, 원인과 노화와 관련된 질병의 병리 먼저 이해해야합니다. 되지 않은 유전자는 이전 연구에서 인간 상태로 연결되어있다하더라도, 관심있는 질병과 관련된 표현형 즉시 분명 존재하는 모든 유전자 변형 마우스. 따라서보...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	Decon (Fisher Scientific)	435541
50 ml conical tube	Fisher Scientific	1443222
cotton balls	Walmart
heat mat	Sunbeam	0000756-500-000
Holding tray (ice cube tray)	Walmart
Electronic stopwatch	GOGO	PC396
Plexiglass box	constructed in workshop		12" by 12"
Vixia HF R400 Camcorder	Canon	8155B004
9 oz Clear Cups	Walmart
1/4 inch wire mesh	Home Depot	204331884 (online) / 554219 (in store)	12" by 12"
Bubble wrap	VWR	470092-416
Straight specimen forceps	VWR	82027-438
Fine-tip dissecting forceps	VWR	82027-408
Fine scissors	VWR	82027-578
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710
10x phosphate buffered saline pH 7.4	American Bioanalytical	AB11072-04000
Sucrose	JT Baker	4072-01
superfrost slides	Fisher Scientific	12-550-15
Hematoxylin Stain Solution	Fisher Scientific (Ricca)	353016
Eosin Y Stain Solution	Fisher Scientific (Ricca)	2845-32
Tris hydrochloride	Sigma	T3253
Tris	American Bioanalytical	AB02000-01000
Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate	Sigma	N8129
Nitrotetrazolium Blue chloride	Sigma	N6876
Acetone	JT Baker	9006-05
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma	S9638
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma	S9390
Sodium succinate dibasic hexahydrate	Sigma	S2378
VectaMount aqueous mounting medium	Vector Labs	H-5501-60
Cover glass	Fisher Scientific	12-545-M	60 mm x 24 mm
AxioImager A1 microscope	Zeiss
Video camera tripod	Amazon
Optimal Cutting Temperature (OCT)	Fischer Scientific	23730571
Cryostat Sectioning  Machine	Leica	CM1900	Discontinued but since replaced by CM1950