JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.

Аннотация

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to lessen the impact of debilitating conditions but remain elusive in many cases. Only by understanding the causes and pathology of diseases associated with aging, can scientists begin to identify potential therapeutic targets and develop strategies for intervention. The most common age-related conditions are neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease and blindness. Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the elderly. Genome wide association studies have previously identified loci that are associated with increased susceptibility to this disease and identified two regions of interest: complement factor H (CFH) and the 10q26 locus, where the age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high-temperature requirement factor A1 (HtrA1) genes are located. CFH acts as a negative regulator of the alternative pathway (AP) of the complement system while HtrA1 is an extracellular serine protease. ARMS2 is located upstream of HtrA1 in the primate genome, although the gene is absent in mice. To study the effects of these genes, humanized knock-in mouse lines of Cfh and ARMS2, knockouts of Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 and HtrA4 as well as a conditional neural deletion of HtrA2 were generated. Of all the genetically engineered mice produced only mice lacking HtrA2, either systemically or in neural tissues, displayed clear phenotypes. In order to examine these mice thoroughly and systematically, an initial phenotyping schedule was established, consisting of a series of tests related to two main diseases of interest: AMD and Parkinson's. Genetically modified mice can be subjected to appropriate experiments to identify phenotypes that may be related to the associated diseases in humans. A phenotyping regimen with a mitochondrial focus is presented here alongside representative results from the tests of interest.

Введение

Связанные с возрастом заболевания становятся все более распространенными в современном обществе. Как медицинская наука и улучшает продолжительность жизни увеличивается, население продолжает стареть и бремя этих заболеваний растет. Эффективные способы лечения необходимы, чтобы уменьшить воздействие изнурительных условий, но остаются недостижимой во многих случаях. Только понимание причин и патологии заболеваний, связанных со старением ученые могут начать идентифицировать потенциальные терапевтические цели и разработать стратегии для вмешательства. Общие условия, связанные с возрастом включают нейродегенеративные расстройства, такие как болезнь Паркинсона (PD) и возрастной макулярной дегенерации (ВМД). PD является наиболее распространенным нарушением движения, вызванное нейродегенерации у людей. Большинство пациентов PD показывают такие симптомы, как тремор покоя, брадикинезия и жесткость после 50-летнего возраста. Раннее начало также наблюдается примерно в 10% случаев.

AMD является ведущей причиной слепоты впожилых людей, постепенно повреждая фоторецепторов и пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) в глазу. Центральное зрение ухудшается, но периферийное зрение, как правило, не влияет. Есть две формы AMD. В «сухой» форме, внеклеточные белковые отложения, известные как друзы формы между ПЭС и мембраной Бруха (БМ), что приводит к географической атрофии и размытость центрального зрения. Более серьезные «мокрые» результаты формируются из неоваскуляризации из хориоидеи через БМ в РПЭ и фоторецепторов слоев и может привести к hamorrhaging под сетчатки, что приводит к необратимому повреждению ткани сетчатки. Геном широкие исследования ассоциаций ранее идентифицированы локусы, которые связаны с повышенной восприимчивостью к этому заболеванию и определили две области, представляющие интерес: фактор комплемента H (CFH) на хромосоме 1 и 10q26 локуса, где возрастная макулопатии восприимчивость 2 (ARMS2) и высокотемпературный фактор требования A1 (HTRA1) гены расположены 1-5 . Комбинации этих аллелей увеличивает вероятность ВМД в зависимости от дозы и специфические ОНП могут быть преимущественно связаны либо с влажной или сухой формы ВМД 3-6.

КЛОХ действует как негативный регулятор альтернативного пути (AP) системы комплемента, путем ингибирования активации С3. Один нуклеотидного полиморфизма (SNP) был связан с повышенным риском AMD, в результате чего обмен тирозина 402 в экзоне 9 с гистидин из - за Т до С замещения 1. В AMD полагают, что точка доступа является misregulated из-за потери функции КЛОХ но SNP играет причинную роль неясно, будет ли. Одна гипотеза состоит в том, что положительно заряженные гистидин , как полагают, свести на нет способность CFH связываться с взаимодействующих белков С-реактивного белка и гепаринсульфат 1,7. В пробирке исследования CFH Y402H обеспечивают противоречивые результаты более функциональных различий между вариантами, и в Vivo работу в CFH - / - мышей , выражающие гуманизированное CFH продолжается 8. ARMS2 расположена выше по потоку от HTRA1 в геноме приматов, хотя ген отсутствует у мышей. HTRA1 представляет собой серин-протеазы, но ARMS2 плохо охарактеризованы. Неравновесия по сцеплению между ОНП в AMD-ассоциированной локуса затрудняет определить вклад в риск отдельных мутаций генов в этом регионе, но недавняя работа предположил, что избыточная экспрессия HTRA1, а не ARMS2, что приводит к неоваскуляризации и субретинальном белковые отложения 9-11. Тем не менее, близость генов в этом локусе может позволить взаимодействий, которые не могут быть исследованы с помощью случайным образом вставленные трансгенов.

В дополнение к AMD, семейство HtrA сериновых протеаз было связано со многими заболеваниями человека. Все белки HtrA содержат домен сериновой протеазы с последующей по меньшей мере, одного С-концевого домена PDZ. HTRA1, HtrA3 и HtrA4 разделяют грвкусишь от гомологии, состоящий из сигнального пептида, инсулиноподобного фактора роста связывающий домен, домен ингибитора протеазы Kazal, домен сериновой протеазы и домен PDZ. HtrA2 имеет другой N-конец, состоящий из последовательности митохондриальной локализации, трансмембранный домен и ингибитор апоптоза связывающего домена следуют протеазы и PDZ доменов 12-16. Млекопитающим HTRA1 регулируется ремоделирования субстрат-индуцированного в активном центре своей области протеазы 17-20, и HtrA2 также может быть модулирован за счет взаимодействия между сериновых протеаз и PDZ доменами , который подавляет активность протеазы 21. Интересно отметить , что домен PDZ как представляется , не придавать подобное регулирование к HtrA3 16. Протеазы HtrA также можно регулировать с помощью внешних факторов: это было недавно показано , что существует регулирующую взаимодействие между HTRA1 и протопорфиринов 22 и HtrA2 может регулироваться с помощью фосфорилирования при активации р38 МАР - киназыпуть в PINK1-зависимым способом 23. Удаление отдельных членов семьи HtrA у мышей было документально подтверждено, однако механистические эффекты в основном остаются неясными отчасти из-за отсутствия видимых фенотипов.

HTRA1 играет важную роль в контроле качества белка и его misregulation или мутация была связана со многими различными заболеваниями человека , включая артрит, рак и повышенным риском 3,4,24-32 AMD. Потеря функции HtrA2 в нервных тканях было связано с PD фенотипов у людей и мышей, в то время как его потеря от не-нервных тканей приводит к ускоренному старению 33-37. HtrA3 дисрегуляция было связано с болезнями , включая преэклампсии и некоторых видов рака 38,39. Up-регулирование HtrA4 наблюдается в плаценте больных преэклампсией , но нокаутных мышей не обнаруживают явную фенотип 40,41. Отсутствие фенотипов наблюдается у некоторых мышей с былопостулируется результатом компенсации между членами семьи HtrA: считается , что оба HtrA4 и HTRA1 взаимодействуют с TGF-B семейства белков, что позволяет компенсации путем HTRA1 при удалении HtrA4 41. Точно так же, полагают , что , так как HTRA1 и HtrA3 имеют высокую степень гомологии доменов они могут иметь дополнительные функции , 42. Тем не менее, было высказано предположение , что HtrA белки могут иметь частично антагонистические роли, конкурируя регулировать общие цели 43.

Для дальнейшего изучения этих факторов риска были созданы три очеловеченные стук в линии мыши. В CfH TM1 (CFH * 9) jhoh и CfH ТМ2 (CFH * 9) jhoh, экзона 9 гена CFH заменяется экзоне 9 человеческого гомолога. CfH TM1 (CFH * 9) jhoh кодирует без заболевания , связанного тирозин остаток в положении 402, тогда как CfH ТМ2 (CFH * 9) jhoh несет Y402H, риск-ассоциированной SNP. ВARMS2 tm1jhoh человеческой последовательности ARMS2 была направлена ​​на область вверх по течению от HTRA1. LoxP-фланкирован последовательность СТОП помещен выше последовательности гена , но ниже по потоку от включенного UbiC промотора , был вырезан путем скрещивания с мышами OzCre, которые выражают Cre рекомбиназу под контролем промотора Rosa26, как было описано выше 34. В дополнение к этим цепную в линиях, условных нокаута аллеля CfH и HTRA1 (CFH tm1jhoh и HTRA1 tm1jhoh), а также других известных членов семьи HtrA генерировались: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) и HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). Нокауты зародышевой линии были созданы путем скрещивания мышей OzCre к животным спроектированных для фланкирования конкретных экзонов с LoxP сайтов, таким образом, что удаление вызывает смещение кадра и / или удаление активного домена (CFH; экзона 3, HTRA1; экзоны 2-3, HtrA2: экзоны 2-4, HtrA3; экзон 3, HtrA4; экзоны 4-6) 34,41. Нейронные удаление HtrA2, удаленные с помощью Cre рекомбиназу под контролем промотора Nestin (HtrA2 Flox; Tg (NES-CRE) 1Kln / J), также был описан 34. Только мыши, лишенные HtrA2, либо системно, либо в нервных тканях, отображаются четкие фенотипы, представляя с паркинсонизмом фенотипов.

Поскольку некоторые из этих генов интерес положенное быть локализованы в митохондриях 11,44-47 и удаление HtrA2 генерируется Parkinsonian фенотипы, режим фенотипирования с митохондриальной и неврологического фокус описан здесь и репрезентативные результаты испытаний , представляющих интерес предоставляются , Для того чтобы исследовать методом генной инженерии мышей, полученные для исследования человека, связанные с возрастом заболевания тщательно и систематически был создан первоначальный график фенотипирования, состоящий из серии испытаний, связанных с двумя основнымизаболевания интерес: AMD и Паркинсона.

протокол

Этика заявление: Исследования с участием животных были проведены в соответствии с национальными институтами рекомендаций здравоохранения в Руководстве для использования Комитетом по уходу и использованию лабораторных животных и Уходу за животными и (IACUC) в Йельском университете.

1. Поведенческий тест генномодифицированных мышей

Примечание: Все мыши должны быть подвергнуты той же схеме тестирования, чтобы ограничить различия в привыканием к обработке. Тесты должны выполняться в то же время суток каждый раз.

  1. Новорожденных Hind Лимб Тест
    Примечание: Тест задних конечностей проводится ежедневно с постнатальный день (P) 4 к P10 для оценки проксимального задних конечностей силы мышц, слабость и усталость.
    1. Транспорт мышей к тестированию области и позволяют отдыхать в течение 30 минут перед испытанием.
    2. Подготовка опытного устройства путем очистки 50 мл коническую трубку с 70% -ным этанолом, толкая два (P4-P8) или один (Р9-Р10) ватные шарики в нижней части ТUbe и закрепление в вертикальном положении.
    3. Удалите один детеныша из клетки и записывать вес. Держите щенка в проведении лоток на тепловой площадку всякий раз, когда не испытывая.
    4. Осторожно приостановить задних конечностей новорожденному через край конической трубки, таким образом, чтобы она была обращена вниз в направлении ватные шарики. Подсчитайте количество выдвижных попыток и измерить задержки падения с помощью секундомера.
    5. Повторите еще раз, а затем пометить детеныша с маркером. Затем определить P6 щенков от носка вырезку. Руб щенков аккуратно с подстилкой из домашней клетки перед заменой.
    6. Протрите коническую трубку с 70% этанола.
    7. Повторите тестирование на следующей щенком, пока весь мусор не был проверен.
    8. Утилизировать ватным тампоном и коническую трубку. Промывайте все оборудование с 70% этанола.
  2. Тест по наблюдению сосущих
    Примечание: Тест наблюдения вводится ребенок, недавно отнятый от груди ежедневно с P19 до P21, чтобы выиграть уровни движения и общей активности.
    1. Транспорт мышей к тестированию учаСткае позволяют отдыхать в течение 30 минут перед испытанием.
    2. Подготовка тестирования окно Plexiglas помеченный 6x6 сеткой 2 дюйма квадратов на основании путем очистки с 70% -ным этанолом. Настройка видеооборудования в сторону таким образом, что вся коробка находится в поле зрения. Держите установить и окрестности тот же каждый день, чтобы избежать введения новизны.
    3. Удалите один сосущих из клетки и поместить в чистую чашку холдинга. Запись веса.
    4. Начните видеозапись, снимая удостоверение личности теста, с идентификационным номером мыши, возраст и дата испытания. Перенесите мышь от проведения чашку к центральной площади. Время в течение трех минут, подсчета количества линий, пересекаемых обеими передними лапами мыши во время испытания.
    5. Возвращение мыши в чистую клетку и окончания записи видео.
    6. Для очистки устройства тестирования с 70% этанола.
    7. Повторяйте, пока все мусор не тестируется, а затем вернуть все щенков в домашней клетке.
    8. Промывайте все оборудование для испытаний с 70% этанола.
    9. Использование видео, количественно оценить количество событий путем выращивания подведении после визуального наблюдения, где мышь стоит обеими передними лапами ясными поддержки, и холить события, где обе передние лапы занимаются уборкой.
  3. Проволочная сетка Возьмитесь испытание на прочность
    Примечание: испытание на прочность сцепления проводится через день между P22 и P26, для оценки нервно-мышечную силу.
    1. Транспорт мышей к тестированию области и позволяют отдыхать в домашней клетке в течение 30 мин перед испытанием.
    2. Подготовьте устройство путем очистки коробки и защитной сетки из плексигласа с 70% этанола. Поместите пузырчатую пленку в нижней части окна и накрыть бумагой.
    3. Отдельные мышей на группы по три, размещение в отдельных чашках холдинга.
    4. Поместите первую мышь на центр проволочной сетки и медленно инвертировать 10-20 см над мягкой поверхностью в нижней части коробки плексигласа. Измерьте задержку падения с помощью секундомера. Прекратить тестирование после 60 секунд прошло, если мышь непадать.
    5. Возвращение мыши проведение чашку, салфетку сетка с 70% этанола и заменить бумагу над пузырчатую пленку. Провести тест на оставшихся двух мышей в группе, прежде чем вернуться к первому. Повторите до тех пор, пока каждая мышь была протестирована в общей сложности три раза.
    6. Возвращение группы в чистую клетку и продолжить с остальными группами. Если имеется меньше трех мышей в любой группе, убедитесь, что в 5 мин между пробный интервал восстановления допускается.
    7. Возвращение всех мышей в домашней клетке, утилизации бумаги и чистого оборудования тестирования с 70% этанола.

2. Исследование структуры Ретинального

  1. Анестезировать животными в P30-35 путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг). Оценка глубины анестезии, зажимая подушечку и исходить только при отсутствии ответа, в соответствии с руководящими принципами IACUC. Заливать с 4% PFA / PBS 48.
  2. Чтобы удалить глаза, очищают кожу на надрез сит.е с 70% -ным этанолом, перед нарезкой через кожу у основания черепа. Отогните кожи подвергать черепа и чистой с 70% этанола. Использование чистых инструментов, тщательно вырезать через череп, чтобы достигнуть глазницы и подвергать глаза. Sever зрительного нерва, осторожно удалить глаз из гнезда и промыть в PBS.
  3. Закрепить глаза в 4% PFA / PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
  4. Поместите глаза в небольшую чашку Петри, содержащую PBS. Сделайте небольшой надрез в центре роговицы с помощью ножниц удаления стежка. Удалить роговицу разрезанием кромка между роговицей и склерой. Используйте пинцет, чтобы удалить диафрагму. И, наконец, слезть ПЭС слои, оставляя нетронутыми сетчатки глаза и объектив на месте.
    Примечание: 4% PFA / PBS, фиксация вызовет RPE отряду что позволяет ПЭС быть легко отделен от внешней поверхности сетчатки.
  5. Повторное исправление в 4% PFA / 30% сахарозы / PBS в течение 15 мин при комнатной температуре перед возвратом в глаза в чашку Петри, содержащую PBS. Вытяните Lenс с помощью пинцета, в результате чего стекловидное тело вместе с ним.
  6. Cryoprotect в 30% сахарозы в течение ночи при температуре 4 ° С.
  7. Coat глаза в оптимальном температуры резания соединения (ОКТ) и передачи вложению формы, содержащей свежий OCT. Сориентируйте глаз таким образом, что в сагиттальной плоскости параллельна режущей поверхности, используя в качестве несколько движений, как это возможно, и избежать введения пузырьков воздуха. Флэш-замораживание путем погружения формы в бане сухой лед / этанол. Хранить блоки при -80 ° С.
  8. Использование криостат, сократить 20 мкм сагиттальных срезов и собирать на предварительно очищенные горками.
  9. Пятно разделы гематоксилином и эозином в соответствии со стандартными протоколами 49. Изображение с помощью светового микроскопа, оборудованного для светлого поля микроскопии.

3. Гистохимическая Окрашивание

  1. Базовые приготовления
    1. Эвтаназии животных в P30-35 используя изофлуран передозировку (30% в пропиленгликоле) с помощью открытой капли ингаляции. Оценка эвтаназию прекращениемдыхания, сердцебиение и отсутствие реакции на ущемление подушечку. Подтверждение смерти путем смещения шейных позвонков и удаление органов, в соответствии с руководящими принципами IACUC.
    2. Для того, чтобы извлечь мозг, очищать кожу в месте разреза с 70% -ным этанолом, перед нарезкой через кожу у основания черепа. Отогните кожи подвергать черепа и чистой с 70% этанола. Использование чистых инструментов, тщательно вырезать через череп и удалить подвергать мозг. Удалите мембраны, и осторожно извлечь мозг из полости черепа. Полоскание в PBS.
    3. Coat мозг в ОСТ и переход к вложению формы, содержащей свежий ОКТ. Сориентируйте мозг таким образом, что в сагиттальной плоскости параллельна режущей поверхности, используя в качестве несколько движений, как это возможно, и избежать введения пузырьков воздуха. Флэш-замораживание путем погружения формы в сухом бане со льдом / этанол и хранят при -80 ° С.
    4. Использование криостат, вырезать 10 мкм сагиттальных срезов и собирать на предварительно очищенные горками.
    2. <литий> НАДН Диафораза Окрашивание
    1. Приготовьте 0,05 М Трис-буфера, рН 7,6 путем растворения 5,72 г Трис-HCl и 1,66 г трис-основания в 1 л деионизованной воды. Хранить при температуре 4 ° С в течение до шести недель.
    2. Приготовьте раствор NADH (2,25 мМ NADH в 0,05 М Трис-буфера). Алиготе и хранить при температуре -20 ° C.
    3. Приготовьте раствор NBT (2,5 мМ Нитро-тетразолия в 0,05 М Трис-буфера). Хранить при температуре 4 ° С в течение шести недель в стеклянной бутылке.
    4. Комбинат равные объемы раствора NADH и раствора NBT сделать окрашивание раствора и добавляют 1 мл для каждого слайда. Инкубируют при 37 ° С в увлажненной камере в течение 30 мин.
    5. Красящий раствор Аспирируйте и мыть три раза с дН 2 O.
    6. Промыть три раза каждый по восходящей и нисходящей концентрации ацетона / дН 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) в течение 2 мин при комнатной температуре.
    7. Промыть три раза в дН 2 O и смонтировать разделы с водной средой. Изображение с помощью светового микроскопа, оборудованного для яркого FIELD микроскопия. Синий окрашивание соответствует ферментативной активности.
  2. Сукцинатдегидрогеназу гистохимическим окрашиванием
    1. Приготовьте 0,2 М одноосновного фосфата натри / дН 2 O и 0,2 М двухосновного фосфата натрия / дН 2 O.
    2. Сделать 0,2 М фосфатный буфер, рН 7,6, комбинируя 3 части одноосновного фосфата с двухосновной фосфат 20 частей натрия.
    3. Приготовьте окрашивание раствора (0,1 М сукцинат натрия, 1,25 М NBT в 0,2 М фосфатном буфере) и добавляют 1 мл для каждого слайда. Инкубируют при 37 ° С в увлажненной камере в течение 60 мин.
    4. Красящий раствор Аспирируйте и мыть три раза в дН 2 O.
    5. Промыть три раза каждый по восходящей и нисходящей концентрации ацетона / дН 2 O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) в течение 2 мин при комнатной температуре.
    6. Промыть три раза в дН 2 O и смонтировать разделы с водной средой. Изображение с помощью светового микроскопа, оборудованного для светлого поля микроскопии. Синий окрашивание соответствует ENzymatic активность.

Результаты

В этом разделе описываются примеры результатов, получаемых с помощью этих методов. В тесте задних конечностей, число попыток тянуть и сделал латентность падать суммируются в течение двух последовательных тестов на каждый день. Этот тест может быть использован для ср?...

Обсуждение

Надежные процедуры необходимы, чтобы ограничить влияние изнурительных условий, связанных с старения человека, но они остаются неуловимыми для многих условий. Для того, чтобы определить потенциальные терапевтические цели и разработать стратегии вмешательства, причины и патология заб...

Раскрытие информации

The authors have no competing interests to disclose.

Благодарности

Финансирование этого исследования пришли из Rosebay Фонда медицинского и исследовательского фонда Йельского медицинской школе Дина (JH). Мы благодарим доктора Клэр Koenig за помощь в поведенческих экспериментах. Генно-инженерных мышей линий были получены в Ozgene (Перт, Австралия).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
EthanolDecon (Fisher Scientific)435541
50 ml conical tubeFisher Scientific1443222
cotton ballsWalmart
heat matSunbeam0000756-500-000
Holding tray (ice cube tray)Walmart
Electronic stopwatchGOGOPC396
Plexiglass boxconstructed in workshop12" by 12" 
Vixia HF R400 CamcorderCanon8155B004
9 oz Clear CupsWalmart
1/4 inch wire meshHome Depot204331884 (online) / 554219 (in store)12" by 12" 
Bubble wrapVWR470092-416
Straight specimen forcepsVWR82027-438
Fine-tip dissecting forcepsVWR82027-408
Fine scissorsVWR82027-578
Paraformaldehyde 16% solutionElectron Microscopy Sciences15710
10x phosphate buffered saline pH 7.4American BioanalyticalAB11072-04000
SucroseJT Baker4072-01
superfrost slidesFisher Scientific12-550-15
Hematoxylin Stain SolutionFisher Scientific (Ricca)353016
Eosin Y Stain SolutionFisher Scientific (Ricca)2845-32
Tris hydrochlorideSigmaT3253
TrisAmerican BioanalyticalAB02000-01000
Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrateSigmaN8129
Nitrotetrazolium Blue chlorideSigmaN6876
AcetoneJT Baker9006-05
Sodium phosphate monobasic monohydrateSigmaS9638
Sodium phosphate dibasic heptahydrateSigmaS9390
Sodium succinate dibasic hexahydrateSigmaS2378
VectaMount aqueous mounting mediumVector LabsH-5501-60
Cover glassFisher Scientific12-545-M60 mm x 24 mm
AxioImager A1 microscopeZeiss
Video camera tripodAmazon
Optimal Cutting Temperature (OCT)Fischer Scientific23730571
Cryostat Sectioning  MachineLeica CM1900Discontinued but since replaced by CM1950

Ссылки

  1. Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308, 385-389 (2005).
  2. Zareparsi, S., et al. Strong association of the Y402H variant in complement factor H at 1q32 with susceptibility to age-related macular degeneration. Am J Hum Genet. 77, 149-153 (2005).
  3. Yang, Z., et al. A variant of the HTRA1 gene increases susceptibility to age-related macular degeneration. Science. 314, 992-993 (2006).
  4. Dewan, A., et al. HTRA1 promoter polymorphism in wet age-related macular degeneration. Science. 314, 989-992 (2006).
  5. Francis, P. J., Zhang, H., Dewan, A., Hoh, J., Klein, M. L. Joint effects of polymorphisms in the HTRA1, LOC387715/ARMS2, and CFH genes on AMD in a Caucasian population. Mol Vis. 14, 1395-1400 (2008).
  6. Cameron, D. J., et al. HTRA1 variant confers similar risks to geographic atrophy and neovascular age-related macular degeneration. Cell Cycle. 6, 1122-1125 (2007).
  7. Herbert, A. P., et al. Structure shows that a glycosaminoglycan and protein recognition site in factor H is perturbed by age-related macular degeneration-linked single nucleotide polymorphism. J Biol Chem. 282, 18960-18968 (2007).
  8. Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor h prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged cfh knockout mice. Am J Pathol. 185, 29-42 (2015).
  9. Nakayama, M., et al. Overexpression of HtrA1 and exposure to mainstream cigarette smoke leads to choroidal neovascularization and subretinal deposits in aged mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 6514-6523 (2014).
  10. Liu, J., Hoh, J. Postnatal overexpression of the human ARMS2 gene does not induce abnormalities in retina and choroid in transgenic mouse models. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, 1387-1388 (2015).
  11. Kanda, A., et al. A variant of mitochondrial protein LOC387715/ARMS2, not HTRA1, is strongly associated with age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16227-16232 (2007).
  12. Zumbrunn, J., Trueb, B. Primary structure of a putative serine protease specific for IGF-binding proteins. FEBS Lett. 398, 187-192 (1996).
  13. Clausen, T., Southan, C., Ehrmann, M. The HtrA family of proteases: implications for protein composition and cell fate. Mol Cell. 10, 443-455 (2002).
  14. Nie, G. Y., Hampton, A., Li, Y., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Identification and cloning of two isoforms of human high-temperature requirement factor A3 (HtrA3), characterization of its genomic structure and comparison of its tissue distribution with HtrA1 and HtrA2. Biochem J. 371, 39-48 (2003).
  15. Runyon, S. T., et al. Structural and functional analysis of the PDZ domains of human HtrA1 and HtrA3. Protein Sci. 16, 2454-2471 (2007).
  16. Glaza, P., et al. Structural and Functional Analysis of Human HtrA3 Protease and Its Subdomains. PLoS One. 10, e0131142. 10, e0131142 (2015).
  17. Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3, 380-387 (2003).
  18. Grau, S., et al. Implications of the serine protease HtrA1 in amyloid precursor protein processing. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6021-6026 (2005).
  19. Lecha, M., Puy, H., Deybach, J. C. Erythropoietic protoporphyria. Orphanet J Rare Dis. 4, 19 (2009).
  20. Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chem Soc Rev. 40, 340-362 (2011).
  21. Li, W., et al. Structural insights into the pro-apoptotic function of mitochondrial serine protease HtrA2/Omi. Nat Struct Biol. 9, 436-441 (2002).
  22. Jo, H., Patterson, V., Stoessel, S., Kuan, C. Y., Hoh, J. Protoporphyrins enhance oligomerization and enzymatic activity of HtrA1 serine protease. PLoS One. 9, 115362 (2014).
  23. Bogaerts, V., et al. Genetic variability in the mitochondrial serine protease HTRA2 contributes to risk for Parkinson disease. Hum Mutat. 29, 832-840 (2008).
  24. Baldi, A., et al. The HtrA1 serine protease is down-regulated during human melanoma progression and represses growth of metastatic melanoma cells. Oncogene. 21, 6684-6688 (2002).
  25. Oka, C., et al. HtrA1 serine protease inhibits signaling mediated by Tgfbeta family proteins. Development. 131, 1041-1053 (2004).
  26. Chien, J., et al. A candidate tumor suppressor HtrA1 is downregulated in ovarian cancer. Oncogene. 23, 1636-1644 (2004).
  27. Grau, S., et al. The role of human HtrA1 in arthritic disease. J Biol Chem. 281, 6124-6129 (2006).
  28. Chien, J., et al. Serine protease HtrA1 modulates chemotherapy-induced cytotoxicity. J Clin Invest. 116, 1994-2004 (2006).
  29. Chien, J., Campioni, M., Shridhar, V., Baldi, A. HtrA serine proteases as potential therapeutic targets in cancer. Curr Cancer Drug Targets. 9, 451-468 (2009).
  30. Hara, K., et al. Association of HTRA1 mutations and familial ischemic cerebral small-vessel disease. N Engl J Med. 360, 1729-1739 (2009).
  31. Jones, A., et al. Increased expression of multifunctional serine protease, HTRA1, in retinal pigment epithelium induces polypoidal choroidal vasculopathy in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14578-14583 (2011).
  32. Vierkotten, S., Muether, P. S., Fauser, S. Overexpression of HTRA1 leads to ultrastructural changes in the elastic layer of Bruch's membrane via cleavage of extracellular matrix components. PLoS One. 6, e22959 (2011).
  33. Strauss, K. M., et al. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson's disease. Hum Mol Genet. 14, 2099-2111 (2005).
  34. Patterson, V. L., et al. Neural-specific deletion of Htra2 causes cerebellar neurodegeneration and defective processing of mitochondrial OPA1. PLoS One. 9, 115789 (2014).
  35. Jones, J. M., et al. Loss of Omi mitochondrial protease activity causes the neuromuscular disorder of mnd2 mutant mice. Nature. 425, 721-727 (2003).
  36. Martins, L. M., et al. Neuroprotective role of the Reaper-related serine protease HtrA2/Omi revealed by targeted deletion in mice. Mol Cell Biol. 24, 9848-9862 (2004).
  37. Kang, S., et al. Loss of HtrA2/Omi activity in non-neuronal tissues of adult mice causes premature aging. Cell Death Differ. 20, 259-269 (2013).
  38. Dynon, K., et al. HtrA3 as an early marker for preeclampsia: specific monoclonal antibodies and sensitive high-throughput assays for serum screening. PLoS One. 7, e45956 (2012).
  39. Singh, H., et al. HtrA3 Is Downregulated in Cancer Cell Lines and Significantly Reduced in Primary Serous and Granulosa Cell Ovarian Tumors. J Cancer. 4, 152-164 (2013).
  40. Inagaki, A., et al. Upregulation of HtrA4 in the placentas of patients with severe pre-eclampsia. Placenta. 33, 919-926 (2012).
  41. Liu, J., Li, Y., Hoh, J. Generation and characterization of mice with a conditional null allele of the HtrA4 gene. Mol Med Rep. , (2015).
  42. Bowden, M. A., Di Nezza-Cossens, L. A., Jobling, T., Salamonsen, L. A., Nie, G. Serine proteases HTRA1 and HTRA3 are down-regulated with increasing grades of human endometrial cancer. Gynecol Oncol. 103, 253-260 (2006).
  43. Chen, Y. Y., et al. Functional antagonism between high temperature requirement protein A (HtrA) family members regulates trophoblast invasion. J Biol Chem. 289, 22958-22968 (2014).
  44. Fritsche, L. G., et al. Age-related macular degeneration is associated with an unstable ARMS2 (LOC387715) mRNA. Nat Genet. 40, 892-896 (2008).
  45. Beleford, D., Rattan, R., Chien, J., Shridhar, V. High temperature requirement A3 (HtrA3) promotes etoposide- and cisplatin-induced cytotoxicity in lung cancer cell lines. J Biol Chem. 285, 12011-12027 (2010).
  46. Hegde, R., et al. Identification of Omi/HtrA2 as a mitochondrial apoptotic serine protease that disrupts inhibitor of apoptosis protein-caspase interaction. J Biol Chem. 277, 432-438 (2002).
  47. Martins, L. M., et al. The serine protease Omi/HtrA2 regulates apoptosis by binding XIAP through a reaper-like motif. J Biol Chem. 277, 439-444 (2002).
  48. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
  49. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008. 2008, (2008).
  50. Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72, 251-264 (1974).
  51. El-Khodor, B. F., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212, 29-43 (2008).
  52. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
  53. Chance, B., Williams, G. R., Holmes, W. F., Higgins, J. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. V. A mechanism for oxidative phosphorylation. J Biol Chem. 217, 439-451 (1955).
  54. Kamo, N., Muratsugu, M., Hongoh, R., Kobatake, Y. Membrane potential of mitochondria measured with an electrode sensitive to tetraphenyl phosphonium and relationship between proton electrochemical potential and phosphorylation potential in steady state. J Membr Biol. 49, 105-121 (1979).
  55. Brown, G. C., Brand, M. D. Proton/electron stoichiometry of mitochondrial complex I estimated from the equilibrium thermodynamic force ratio. Biochem J. 252, 473-479 (1988).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

113HTRA1HtrA2HtrA3HtrA4H CFH

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены