Le Neuron-astrocyte indirecte coculture Assay: Un<em&gt; In vitro</em&gt; Mise en place pour l&#39;investigation détaillée des interactions Neuron-glie

Résumé

Ce protocole décrit la coculture neurone-astrocyte indirect pour l'analyse compartimentée des interactions neurone-glie.

Résumé

le développement neuronal et la fonction est la condition préalable du développement et le cerveau adulte. Cependant, les mécanismes sous-jacents de la formation hautement contrôlé et l'entretien des réseaux neuronaux complexes ne sont pas complètement compris jusqu'à présent. Les questions ouvertes concernant les neurones dans la santé et la maladie sont diverses et allant de la compréhension du développement de base aux enquêtes sur les droits liés à des pathologies, par exemple, les maladies et la schizophrénie d'Alzheimer. L'analyse la plus détaillée de neurones peut être réalisé in vitro. Cependant, les neurones exigent des cellules et ont besoin du soutien supplémentaire de astrocytes pour leur survie à long terme. Cette hétérogénéité cellulaire est en conflit avec le but de disséquer l'analyse des neurones et des astrocytes. Nous présentons ici un essai de culture cellulaire qui permet la co-culture à long terme des neurones et des astrocytes primaires pures, qui partagent le même milieu chimiquement défini, tout en étant physiquementséparé. Dans cette configuration, les cultures survivent jusqu'à quatre semaines et le dosage est adapté à la diversité des enquêtes concernant les interactions neurone-glie.

Introduction

Tout au long des dernières décennies, l'interprétation générale de la fonction névroglie a évolué à partir de l'attribution d'un soutien simplement vers un rôle actif réglementaire concernant la fonction neuronale ^1. En raison de leur impact important sur le cerveau homéostasie dans la santé et la maladie ^2, astrocytes sont d' un intérêt particulier pour la communauté scientifique. Au cours des dernières années, une diversité d'études ont porté sur les interactions neurone-glie in vivo et in vitro ^3. Cependant, la plupart des systèmes de culture ne permettent pas l'analyse séparée des deux types de cellules et de leurs secrétomes respectifs.

Plusieurs approches exploitent la coculture directe des neurones et des cellules gliales pour atteindre la survie à long durable et le développement du réseau neuronal physiologiquement pertinents ^4-6. Le présent protocole atteint les mêmes objectifs tout en gardant les deux types de cellules physiquement séparés ^7. Par rapport à conditionemoyen d approches ^8,9, notre système permet d'étudier la communication bidirectionnelle entre les neurones et les astrocytes. L'expression des molécules de signalisation sécrétées peut être surveillée tandis que les cellules dans le milieu maturate partagé. Cette possibilité est particulièrement importante, car les astrocytes libèrent des facteurs solubles tels que les cytokines, les facteurs de croissance et des molécules de la matrice extracellulaire ^10,11, régulant ainsi la croissance neuronale et fonctionnent de ^7,12. Ainsi, il a été démontré que l'addition de la thrombospondine aux cellules ganglionnaires de la rétine in vitro induit la formation de synapses ^13. Cependant, d' autres facteurs encore inconnus sont nécessaires pour rendre les synapses fonctionnelles ^13. En outre, les molécules libérées par les astrocytes doivent être identifiés afin de comprendre la base des interactions neurone-glie.

La culture des neurones primaires et des astrocytes de rat et la souris a été décrit précédemment ^14-16. ici, nousprésenter un outil élégant et polyvalent de combiner les deux types de cellules dans une approche indirecte de coculture. Étant donné que les deux cultures sont physiquement séparés encore partager le même milieu, l'impact des neurones, des astrocytes et des molécules solubles, peuvent être analysées séparément, créant ainsi un outil puissant pour les études d'interaction neurone-glie.

Protocole

Les expériences avec des souris étaient conformes à la loi allemande et la Société allemande pour les directives de Neurosciences de l'élevage. Les soins des animaux et de l'utilisation des comités de la Ruhr-Universität Bochum ont accordé les permis appropriés.

1. Préparation et culture de corticale astrocytes

Remarque: Effectuez ces étapes du protocole au moins 7 jours avant de procéder aux étapes suivantes, comme les cultures d'astrocytes devraient se développer en monocouches confluentes avant que les neurones sont préparés. astrocytes primaires sont dérivées de cultures gliales mélangées obtenues à partir souriceaux autour jour post-natal (P) 0-3. Trois cerveaux corticales (6) par flacon T75 doivent être utilisés.

1. Préparer le milieu des astrocytes en complétant milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% v / v de sérum de cheval et 0,1% v / v de gentamycine dans des conditions stériles. Conserver le milieu à 4 ° C pendant 2 semaines.
2. Manteau 3x T75 flacons wie 10 pg / ml de poly-D-lysine (PDL, dans l' eau de culture cellulaire grade) pendant au moins 1 h à 37 ° C en présence de 6% v / v de CO _2. Après le revêtement, lavez les flacons deux fois avec un tampon phosphate salin (PBS) pour éliminer les cations non liés, et ajouter 9 ml de milieu d'astrocytes.
3. Pour la préparation du cerveau, ajouter une solution saline équilibrée de Hank 10 ml (HBSS) jusqu'à 1 x 10 cm de boîte de Pétri et 1 ml de HBSS à 1x 15 ml tube (quel que soit le nombre de cerveaux qui sera utilisé). Gardez une paire de ciseaux chirurgicaux, 2 pinces fines et une paire de jumelles à la portée de la procédure.
4. Décapitez 3 chiots rapidement avec les ciseaux chirurgicaux et de recueillir les têtes dans une boîte de 10 cm vide.
   1. Effectuer la préparation des corticales sous la binoculaire. En utilisant deux pinces fines, enlever la peau dorsale du crâne sur la ligne médiane, à partir du cou vers le haut vers le niveau des yeux. Par la suite, le cerveau et ses vaisseaux sanguins est visible sous le crâne.
   2. Fixer la tête à l'extrémité rostrale avec une paire de pinces et incise la ligne médiane du crâne, à partir de l'extrémité postérieure. Par la suite, un clip au large de la droite et les moitiés gauche du crâne pour exposer le cerveau.
   3. Fermez la pointe de la pince et le positionner ventralement sous le cerveau. Soulevez le cerveau sur le crâne et le transférer dans le plat HBSS rempli 10 cm de Pétri. Procédez de la même manière avec l'échantillon restant jusqu'à ce que tous les cerveaux sont rassemblés dans le plat.
5. Après avoir recueilli les cerveaux, commencer par la séparation des corticales par pincement le cerveau postérieur en utilisant une paire de pinces, comme une paire de ciseaux. Effectuer une incision médiane entre les deux hémisphères avec une paire de forceps. Fixez soigneusement le cerveau avec une pince et couper le mésencéphale et les bulbes olfactifs à l'aide d'un deuxième pince pour se retrouver avec les moitiés corticales.
6. Fixer la moitié corticale avec une paire de pinces et éplucher les méninges des hémisphères en les détachant felon le bord latéral, puis en les tirant de la surface corticale à l'aide d'un second forceps.
7. Retournez la moitié corticale avec sa surface orientée vers le bas vers le plat; soigneusement disséquer et retirer l'hippocampe en forme de croissant à l'aide d'une paire de pinces. Transférer les corticales simples dans le tube 15 ml conique en utilisant une pince fermée pour porter un cortex individuel.
8. Après avoir recueilli tous les corticales, de transit à la hotte à flux laminaire stérile et commencer les préparatifs de la dissociation du tissu cortical.
9. Ajouter 1 mL de DMEM à un tube réactionnel 2 ml et on ajoute 0,1% p / v de la papaïne (30 unités). Incuber la suspension dans un bain d'eau à 37 ° C jusqu'à ce qu'une solution clarifiée se développe (environ 3 minutes). Ajouter 0,24 mg / mL L-cystéine et 20 pg / ml de DNAse et agiter doucement.
   Remarque: Pour la digestion, environ 1 ml de solution d'enzyme est nécessaire.
10. Filtre (0,22 um de taille des pores) pour obtenir une solution stérile de 1 mL avant d'ajouterau tissu cortical. Incuber les tubes pendant 30 min - 1 heure à 37 ° C ( par exemple, dans un bain _d'eau).
    REMARQUE: Les étapes de 1,11 à 1,14 sont essentielles et devraient être achevés dans les 15 min.
11. Pour mettre fin à la réaction de digestion, ajouter 1 ml de milieu d'astrocytes et triturer avec soin le tissu digéré à l'aide d'une pipette de 1 mL. Pour la trituration, la déplacer doucement sur le piston de la pipette, en aspirant ainsi l'extrusion et la suspension de tissu cortical.
12. Une fois que le tissu a été dissocié en une suspension à cellule unique, ajouter 5 ml de milieu de astrocyte et centrifuger pendant 5 min à 216 x g.
13. Aspirer le surnageant avec précaution du culot résultant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu d'astrocytes.
14. Ajouter les suspensions de cellules dans des flacons T75 réapprovisionnés avec 9 milieu de astrocyte mL (voir 1.2).
15. Incuber les cellules à 37 ° C dans l'incubateur en présence de 6% v / v de CO _2. Après 4 d, effectuer le premier changement de milieu complet (10 ml). Par la suite, changer le milieu de culture tous les 2 - 3 d.
16. Après 7 jours, vérifier si les cellules ont formé une monocouche confluentes. Sinon, attendre encore 2 - 3 jours jusqu'à confluence complète de la culture est atteinte.
    REMARQUE: Les astrocytes présentent de grandes masses de cellules aplaties, localisent au fond du flacon et ne développent pas de processus cellulaires notables. Ils diffèrent des petites cellules progénitrices lumineuses à contraste de phase et la microglie se trouvant sur le dessus de la monocouche ^17.
17. Afin de se débarrasser des cellules progénitrices et obtenir une culture d'astrocytes pure, placer les flacons T75 sur un agitateur orbital et agiter les cultures O / N à 250 rpm. Veiller à ce que la température est réglée à 37 ° C et que le filtre de la fiole est scellée avec un film de laboratoire pour empêcher l' évaporation du CO _2.
18. Le lendemain, aspirer le milieu et ajoutez milieu de culture frais 10 mL réapprovisionné avec 20 uM cytosine-1-β-D-arabinofuranoside (AraC) à Eliminales cellules de séparation résiduelle Te.
    REMARQUE: l' incubation avec de l' AraC pour les 2 - 3 jours dans l'incubateur à 37 ° C, 6% de CO ₂ se traduira par une culture d'astrocytes pur.
19. Surveiller la pureté des cultures d'astrocytes par inspection visuelle au microscope optique. Si résiduelle contraste de phase des cellules progénitrices lumineux et microglie résident toujours au - dessus de la monocouche astrocytaire ¹⁷ (voir l' étape 1.16), répétez les étapes 1,18 et 1,19.
    NOTE: Le confluentes et monocouches d'astrocytes purs peuvent être conservés jusqu'à 14 jours dans l'incubateur (37 ° C, 6% v / v de CO ₂₎ avant de passer à l'étape suivante. Changer la moitié du milieu tous les 3 jours. Ne pas recueillir, gel et de dégel des astrocytes, ces cellules vont perdre leurs propriétés de soutien neuronales à travers la procédure de stockage.

2. astrocytes Préparation pour la coculture indirecte

Note: 48 - 72 h avant de préparer les neurones, les astrocytes de transfert à l'celinserts l-culture. En règle générale, un seul flacon T75 délivre un nombre suffisant de cellules pour soutenir les cultures de neurones obtenus avec une préparation.

1. Placez autant inserts au besoin dans 24 puits de plaques. Enrober chaque insert avec 10 pg / ml PDL (dissous dans de l' eau de culture cellulaire grade) pendant environ 1 h à 37 ° C, 6% v / v de CO _2. Après l'incubation, les inserts de lavage deux fois avec du PBS. Dans l'intervalle, procéder à la préparation des astrocytes.
   NOTE: Les inserts remplis de PBS peuvent être conservés jusqu'à ce que la suspension de cellules astrocytes est prêt à l'emploi.
2. Aspirer le milieu de astrocyte (avec AraC) et laver la culture une fois avec 10 ml de PBS pour assurer tout sérum résiduel est éliminé.
3. Ajouter 3 ml de trypsine-EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) à 0,05% dans les flacons et on incube les cellules pendant trypsination à 37 ° C, 6% v / v de CO ₂ pendant environ 10 min.
4. Contrôler le détachement des cellules par inspection visuelle à l'aide d'un microscope et facilitatE le détachement des cellules en tapant sur le côté des flacons contre le bureau.
   REMARQUE: Les étapes 02.05 à 02.08 sont critique et devrait être terminé sous 15 - 20 min.
5. À la suite de la trypsinisation doucement resuspendre les cellules dans 7 ml de milieu d'astrocytes et de transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml. Centrifugeuse pendant 5 min à 216 x g.
6. Aspirer délicatement le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans 1 ml de milieu d'astrocytes.
7. Compter les cellules en utilisant une chambre de comptage.
8. Remplissez le fond des puits de la-bien-plaque 24 avec 500 ul milieu astrocytes et transférer 25.000 cellules dans 500 pi de milieu de astrocyte dans chaque insert individuel. Incuber la culture à 37 ° C, 6% v / v de CO _2.
   NOTE: Après 42-72 h les cultures atteindra environ 100% de confluence. A ce stade , la pureté de la culture peut être contrôlée par immunocytochimie ^11. Les cultures confluentes peuvent être maintenues pendant jusqu'à 7 jours avant de procéder à l'L'étape suivante. Changer la moitié du milieu tous les 3 jours.

3. Préparation du primaire hippocampique Neurones

Remarque: les neurones hippocampiques de souris primaires devraient être dérivées de E15.5 - E16 embryons de souris enceintes chronométrées.

1. Préparer le milieu neurone (MEM pyruvate de sodium 10 mM, 0,1% p / v ovalbumine, 2% v / v milieu supplément B27 et 0,1% v / v de la gentamicine (stérilisée par filtration)), et le milieu de préparation (HBSS avec 0,6% en poids / v de glucose et 10 mM de HEPES (acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-éthanesulfonique pipérazine)). Pré-équilibrer préchauffer et le milieu des neurones dans des flacons de filtre à 37 ° C, 6% v / v de CO _2.
2. Placez le verre-lamelles (diamètre 12 mm) dans les puits de 24 puits de plaques (utiliser les lamelles spéciales, qui sont entaillées pour l'utilisation avec des inserts de culture cellulaire).
   1. Manteau pendant au moins 1 h avec 15 pg / ml Poly-DL-ornithine dans l'eau (culture cellulaire de qualité) à 37 ° C. Utiliser au moins 500 pi par puits pour assurer queles lamelles sont complètement couverts. Laver les puits deux fois avec PBS. Laissez le PBS dans les puits jusqu'à ce que l'étalement des cellules. Veiller à ce que les puits ne sèchent pas.
3. Pour disséquer les hippocampes, préparer 3x 10 cm plats remplis de milieu de préparation et 1x tube 2 ml avec 1 ml milieu de préparation. Préparer des ciseaux et 2 pinces fines.
4. Sacrifiez la souris enceinte par dislocation cervicale, stériliser l'abdomen par lavage avec 70% v / v d'éthanol, et d'ouvrir l'abdomen à l'aide des ciseaux pointus. Exciser l'utérus de perles soigneusement avec des ciseaux et transférer l'organe en 1x boîte de 10 cm rempli de milieu de préparation.
5. Ensuite, retirez les embryons de l'utérus. inciser soigneusement l'utérus et retirer l'amnios sans nuire aux embryons en utilisant 2 pinces. Par la suite, décapite chaque embryon avec une paire de ciseaux et transférer les têtes dans une seconde boîte de 10 cm fourni avec milieu de préparation.
6. Procéder à la préparation des têtes (similaire à la préparation décrite dans 1,4 à 1,7).
   1. Immobiliser la tête avec une paire de pinces et inciser le crâne et la peau dans la région du cou à proximité du rhombencéphale, perpendiculaire à l'axe cérébro-spinal. Utilisez une deuxième paire de pinces pour soulever deux crâne et la peau recouvrant, et pliez la calotte crânienne douce vers la fin rostrale de la tête, exposant ainsi le cerveau.
   2. Avec l'aide de 2 pinces, détacher le cerveau de la cavité crânienne. Pour cela, fermer 1 paire de pinces faire et séparer le cerveau du crâne à partir de bulbes olfactifs et se déplaçant vers le rhombencéphale. Recueillir les cerveaux dans une autre boîte de 10 cm rempli de milieu de préparation.
7. Disséquer les hippocampes des fragments de cortex, comme décrit ci-dessus pour la préparation des astrocytes (étape 1.6). Retirez le hippocampes de chaque hémisphère et les recueillir dans le tube 2 mL rempli de milieu de préparation.
8. Après avoir terminé la dissection, transférer le tube sur le banc stérile à flux laminaire et Digest le tissu hippocampique avec 1 solution de digestion ml contenant de la papaïne. Préparer la solution de digestion comme décrit à l'étape 1/9 à 1/10, mais utiliser MEM à la place DMEM.
   REMARQUE: Les étapes 03.09 à 03.12 sont essentielles et devraient être achevés dans les 10 - 15 min.
9. Après l'achèvement de la digestion, retirer avec soin la solution de digestion par aspiration douce avec une pipette.
10. Laver le hippocampes 3 fois avec un milieu de neurone en ajoutant séquentiellement et ensuite aspirer soigneusement 1 ml de milieu de culture frais par cycle de lavage. Ne pas centrifuger la suspension cellulaire.
11. Après l'étape finale de lavage, on triture soigneusement le tissu dans 1 ml de milieu neuronal.
12. Compter les cellules en utilisant une chambre de comptage et de la plaque 35.000 cellules dans 500 ul de milieu de neurone par un seul puits d'une 24 bien-plaque (la plaque mentionnée au point 3.2).
    NOTE: En option, une partie aliquote de cellules peut être de contraste avec le bleu trypan pour évaluer la vitalité de la préparation cellulaire. Contrôle de la densité de placage par inspection visuelleion à l'aide du microscope (typiquement 90 - 110 cellules par champ visuel d'un objectif 10X standard).
13. Placer les neurones dans l'incubateur à 37 ° C, 6% v / v de CO ₂ pendant 1 h.
14. Diffusez incubation, prendre les inserts préparés (ensemencées avec des monocouches confluentes astrocytes) hors de l'incubateur (voir étape 2.8). Remplacez le milieu par aspiration du milieu astrocytes et le remplacer par 500 ul de milieu de neurone frais.
    NOTE: Les inserts doivent abriter des monocouches d'astrocytes confluentes après 2 - 3 DIV (Days In Vitro).
15. Placez les inserts avec astrocytes avec précaution dans les puits qui contiennent les cultures de neurones (étape 3.13) à l'aide de pinces stériles.
16. Placez le neurone indirect-astrocyte coculture résultant de nouveau dans l'incubateur à 37 ° C, 6% v / v CO _2.
    NOTE: Dans ces conditions, les neurones peuvent être cultivées pendant jusqu'à 4 semaines dans un milieu complètement défini. Aucun changement de milieu est nécessaire. Pour les cultures de longue date, il est recommandé de remplir epuits mpty avec de l'eau stérile afin de réduire l'évaporation du puits-plaque 24.
17. Effectuer des analyses in vitro cellulaire après des périodes de culture souhaitée (par exemple, pour immunocytochimie, PCR, Western blot, les enregistrements électrophysiologiques (clamp patch ou tableau multiélectrodes)) ^7,15,18.
    NOTE: Le système de culture est également adapté pour le traitement pharmacologique aiguë et chronique des cultures ^11.

Résultats

L'analyse des cultures de neurones par l'intermédiaire du système de co-culture indirecte est multiple et peut être effectuée à différents stades de la maturation de la culture. En raison du fait que les cellules peuvent être maintenues pendant jusqu'à 4 semaines, des études à long terme des cultures sont possibles.

Le schéma dans le panneau gauche du milieu de la figure 1 montre la conf...

Discussion

L'objectif principal du protocole actuel est de cultures neuronales et astrocytaires complètement séparés, tout en les maintenant dans un milieu partagé. Pour cette raison, la pureté des cultures obtenues doivent être vérifiées au début de la procédure. Nous recommandons l'utilisation de la tubuline spécifique des neurones, neurofilaments ou protéine NeuN comme marqueurs neuronaux, GFAP comme marqueur astrocytaire, antigène O4 comme marqueur de précurseurs d'oligodendrocytes et de protéines Ib...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
B27	Gibco (Life Technologies)	17504-044
Cell-culture-grade water	MilliQ
Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC)	Sigma-Aldrich	C1768	CAUTION: H317, H361
DMEM	Gibco (Life Technologies)	41966-029
DNAse	Worthington	LS002007
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1397	CAUTION: H317-334
Glucose	Serva	22700
HBSS	Gibco (Life Technologies)	14170-088
HEPES	Gibco (Life Technologies)	15630-056
Horse serum	Biochrom AG	S9135
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C-2529
MEM	Gibco (Life Technologies)	31095-029
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A7641	CAUTION: H334
Papain	Worthington	3126
PBS	self-made
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P0899
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P3655
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636
Trypsin-EDTA	Gibco (Life Technologies)	25300054
Equipment
24-well-plates	Thermoscientific/Nunc	142475
24-wells-plate (for the  indirect co-culture)	BD Falcon	353504
Binocular	Leica	MZ6
Cell-culture inserts	BD Falcon	353095
Centrifuge	Heraeus	Multifuge 3S-R
Counting Chamber	Marienfeld	650010
Forceps	FST Dumont (#5)	11254-20
glass cover slips (12 mm)	Carl Roth (Menzel- Gläser)	P231.1
Incubator	Thermo Scientific	Heracell 240i
Micro-tube (2 mL)	Sarstedt	72,691
Microscope	Leica	DMIL
Millex Syringe-driven filter unit	Millipore	SLGV013SL
Orbital shaker	New Brunswick Scientific	Innova 4000
Parafilm	Bemis	PM-996
Petri dishes (10 cm)	Sarstedt	833,902
pipette (1 mL)	Gilson	Pipetman 1000
Sterile work bench	The Baker Company	Laminar Flow SterilGARD III
Surgical scissors	FST Dumont	14094-11
Syringe	Henry Schein	9003016
T75 flask	Sarstedt	833,911,002
tube (15 mL)	Sarstedt	64,554,502
Water bath	GFL	Water bath type 1004