A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up para a investigação detalhada da Relação Neuron-glia

Resumo

Este protocolo descreve a co-cultura neurônio-astrócito indireta para análise compartimentada das interações neurônio-glia.

Resumo

desenvolvimento neuronal adequada e função é o pré-requisito do desenvolvimento e do cérebro adulto. No entanto, os mecanismos subjacentes à formação altamente controlada e manutenção de redes neuronais complexas não estão completamente compreendidos, até agora. As questões em aberto sobre neurônios na saúde e na doença são diversas e alcance da compreensão do desenvolvimento básico para investigar patologias relacionadas com humanos, por exemplo, doença de Alzheimer e esquizofrenia. A análise mais detalhada dos neurónios pode ser realizado in vitro. No entanto, os neurônios estão exigindo células e precisam do apoio adicional dos astrócitos para a sua sobrevivência a longo prazo. Esta heterogeneidade celular está em conflito com o objectivo de dissecar a análise de neurónios e astrócitos. Apresentamos aqui um ensaio de cultura de células que permite a co-cultura a longo prazo de neurónios e astrócitos primários puros, que partilham o mesmo meio definido quimicamente, sendo fisicamenteseparados. Nesta configuração, as culturas sobreviver por até quatro semanas e o ensaio é adequado para uma diversidade de investigações relativas a interação neurônio-glia.

Introdução

Ao longo das últimas décadas, a interpretação geral da função neuroglia evoluiu a partir da atribuição de um apoio meramente no sentido de um papel regulador activa a respeito da função neuronal ^1. Por causa de seu impacto importante na homeostase cerebral na saúde e na doença ^2, os astrócitos são de especial interesse para a comunidade científica. Nos últimos anos, uma diversidade de estudos concentraram-se em interacções neurónio-glia in vivo e in vitro ^3. No entanto, a maioria dos sistemas de cultura não permitem a análise em separado de ambos os tipos de células e de seus respectivos secretomes.

Várias abordagens explorar o co-cultivo direta dos neurônios e da glia para alcançar a sobrevivência duradoura e de desenvolvimento da rede neuronal fisiologicamente relevante ^4-6. O presente protocolo atinge os mesmos objetivos, mantendo ambos os tipos de células separadas fisicamente ^7. Em comparação com conditioned média se aproxima ^{de 8,9,} o nosso sistema permite estudar a comunicação bidirecional entre neurónios e astrócitos. A expressão de moléculas de sinalização segregadas pode ser monitorizada, enquanto as células maturam no meio compartilhado. Esta possibilidade é especialmente relevante, tal como astrócitos libertam factores solúveis, tais como citoquinas, factores de crescimento e moléculas da matriz extracelular ^10,11, regulando desse modo o crescimento neuronal e função ^7,12. Assim, foi demonstrado que a adição de trombospondina de células do gânglio retinal in vitro, induz a formação de sinapses ^13. No entanto, outros fatores ainda desconhecidos são necessárias para tornar as sinapses funcionais ^13. Além disso, as moléculas liberadas por astrócitos têm de ser identificados, a fim de compreender a base de interações neurônio-glia.

A cultura de neurónios e astrócitos primários de ratinho e rato foi previamente descrito ^14-16. Aqui nósapresentar uma ferramenta elegante e versátil para combinar ambos os tipos de células em uma abordagem co-cultura indirecta. Uma vez que as duas culturas são fisicamente separadas mas que partilham a mesma forma, o impacto de neurónios, astrócitos e as moléculas solúveis, podem ser analisados ​​separadamente, criando assim uma ferramenta poderosa para estudos de interacção Neuron-glia.

Protocolo

Os experimentos com camundongos estavam em conformidade com a Lei alemã e da Sociedade Alemã de diretrizes neurociência da criação de animais. As comissões de cuidados de animais e utilização do Bochum Ruhr-University concederam as licenças apropriadas.

1. Preparação e Cultivo de Cortical astrócitos

Nota: Conclua estas etapas do protocolo, pelo menos, 7 d antes de prosseguir para as próximas etapas, como as culturas de astrócitos devem desenvolver em monocamadas confluentes antes que os neurônios estão preparados. astrócitos primários são derivados de culturas gliais mistos obtidos a partir de filhotes de rato ao redor dia pós-natal (P) 0-3. Três cérebros (6 córtices) por frasco T75 são para ser usados.

1. Prepara-se o meio de astrócitos, completando de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) com 10% de soro de v / v de cavalo e 0,1% v / v de gentamicina sob condições estéreis. Armazenar o meio a 4 ° C durante até 2 semanas.
2. Brasão 3x T75 frascos with 10 ug / ml de poli-D-lisina (PDL; em água-cultura de grau célula) durante pelo menos 1 h a 37 ° C na presença de 6% v / v _{de CO2.} Após o revestimento, os frascos de lavagem duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover catiões não ligados, e adicionar 9 ml de meio de astrócitos.
3. Para a preparação dos cérebros, adicionar Solução Salina Equilibrada de Hank 10 ml (HBSS) para 1x 10 centímetros de Petri e 1 ml de HBSS a 1 x 15 mL tubo (independentemente do número de cérebros que vai ser utilizado). Manter um par de tesouras cirúrgicas, 2 pinça fina e um binóculo ao alcance para o procedimento.
4. Decapitar 3 filhotes rapidamente com as tesouras cirúrgicas e recolher as cabeças em um vazio placa de 10 cm.
   1. Realizar a preparação dos córtices sob a binocular. Utilizando duas pinças finas, remover a pele dorsal a partir do crânio na linha mediana, a partir do pescoço para cima em direcção ao nível dos olhos. Depois disso, o cérebro com os seus vasos sanguíneos é visível sob o crânio.
   2. Fixar a cabeça na extremidade rostral com um par de fórceps e inciso linha média do crânio, começando na extremidade posterior. Posteriormente, cortaria a direita e as metades esquerda do crânio para expor o cérebro.
   3. Fechar a ponta do fórceps e posicioná-lo sob ventral do cérebro. Levantar o cérebro fora do crânio e transferi-lo para o HBSS-cheia 10 centímetros de Petri. Proceda da mesma forma com o modelo restantes até que todos os cérebros são recolhidas no prato.
5. Após a coleta dos cérebros, comece com a separação dos córtices por beliscar fora da parte posterior do cérebro usando um par de fórceps, como um par de tesouras. Executar uma incisão na linha média entre os dois hemisférios com um par de pinças. Cuidadosamente corrigir o cérebro com uma pinça e cortar o mesencéfalo e os bulbos olfatórios utilizando uma segunda pinça para acabar com as metades corticais.
6. Fix metade cortical com um par de fórceps e descascar as meninges dos hemisférios destacando-los from a aresta lateral e, subsequentemente, puxando-os da superfície cortical utilizando uma segunda pinça.
7. Virar o meia cortical com a sua superfície orientada para baixo para o prato; dissecar cuidadosamente e remover o hipocampo em forma de crescente, usando um par de fórceps. Transfira os córtices individuais dentro do tubo cônico de 15 mL usando uma pinça fechadas para realizar um córtex individual.
8. Depois de recolher todos os córtices, o trânsito para a capela de fluxo laminar estéril e começar com os preparativos para a dissociação do tecido cortical.
9. Adicionar 1 ml de DMEM a um tubo de reacção de 2 mL e adicionar 0,1% w / v de papaína (30 unidades). Incubar a suspensão num banho de água a 37 ° C até que uma solução clarificada desenvolve (cerca de 3 min). Adicionar 0,24 mg / mL L-cisteína e 20 ng / mL DNAse e agitar suavemente.
   NOTA: Para a digestão, aproximadamente, 1 mL de solução de enzima é necessária.
10. Filtro (0,22 mM tamanho dos poros) para obter uma solução estéril mL antes de adicionar-lo para o tecido cortical. Incubar os tubos durante 30 minutos - 1 hora a 37 ° C (ou seja, em um banho de _água).
    NOTA: As etapas 1,11-1,14 são críticos e devem ser concluídas dentro de 15 min.
11. Para terminar a reacção de digestão, adicionar um meio de astrócitos mL e tritura-se cuidadosamente o tecido digerido utilizando uma pipeta de 1 mL. Para trituração, e mover-se suavemente o êmbolo da pipeta, aspirando assim, e extrusão da suspensão de tecido cortical.
12. Uma vez que o tecido foi dissociado para uma suspensão de uma única célula, adicionam-se 5 mL de meio de astrócitos e centrifugar durante 5 minutos a 216 x g.
13. Aspirar o sobrenadante com cuidado a partir do sedimento resultante e voltar a suspender as células em um meio de astrócitos mL.
14. Adicione as suspensões de células para frascos T75 reabastecidos com 9 meio de astrócitos mL (ver 1.2).
15. Incubar as células a 37 ° C na incubadora, na presença de 6% v / v _{de CO2.} Após 4 d, realizar a primeira mudança meio completo (10 mL). Depois disso, mudar o meio de cultura a cada 2-3 d.
16. Após 7 d, verificar se as células formaram uma monocamada confluente. Se não, esperar durante mais de 2 - 3 dias até confluência completa da cultura é atingido.
    NOTA: Os astrócitos exibir grandes corpos celulares achatados, localizar-se no fundo do frasco e não se desenvolvem os processos celulares notáveis. Eles diferem das pequenas células progenitoras brilhantes de contraste de fase e a microglia que residem no topo da monocamada de ^17.
17. A fim de se livrar das células progenitoras e obter uma cultura de astrócitos pura, coloque os frascos T75 em um agitador orbital e agitar as culturas O / N a 250 rpm. Certifique-se de que a temperatura é ajustada a 37 ° C e que o filtro do balão é selada com filme de laboratório para evitar a evaporação do CO _2.
18. No dia seguinte, Aspirar o meio e adicionar meio de cultura de 10 mL fresco reabastecido com 20 uM citosina-1-β-D-arabinofuranósido (AraC) para Eliminacélulas em divisão residuais te.
    NOTA: incubação com AraC para 2-3 d na incubadora a 37 ° C, 6% de CO ₂ vai resultar em uma cultura de astrócitos puro.
19. Monitorar a pureza das culturas de astrócitos por inspecção visual ao microscópio de luz. Se residual de contraste de fase de células progenitoras brilhante e microglia ainda residem no topo da monocamada astrocitária ¹⁷ (veja o passo 1.16), repita os passos de 1,18 e 1,19.
    NOTA: O confluente e monocamadas de astrócitos puros pode ser mantido durante até 14 d na incubadora (37 ° C, 6% v / v _{de CO2)} antes de prosseguir para o próximo passo. Mudar metade do meio a cada 3 d. Não coletar, congelar e descongelar os astrócitos, uma vez que estas células irão perder as suas propriedades favoráveis ​​neuronais através do procedimento de armazenamento.

2. Os astrócitos preparando para o Coculture indireta

Nota: 48 - 72 h antes de preparar os neurônios, astrócitos transferência para o celinserções l-cultura. Geralmente, um único frasco T75 proporciona um número suficiente de células para suportar as culturas neuronais obtidos com uma preparação.

1. Coloque como muitos inserções conforme necessário para 24 poços placas. Revestimento cada inserção com 10 ug / mL PDL (dissolvido em água de grau de cultura de células) durante cerca de 1 h a 37 ° C, 6% v / v _{de CO2.} Após a incubação, as inserções de lavar duas vezes com PBS. Nesse meio tempo, prosseguir com a preparação de astrócitos.
   NOTA: As inserções cheias com PBS pode ser mantido até que a suspensão de células de astrócitos está pronto para uso.
2. Aspirar o meio do astrócito (com AraC) e lava-se a cultura de uma vez com 10 mL de PBS para garantir qualquer soro residual é removido.
3. Adicionar 3 ml de 0,05% de tripsina-EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) aos frascos e incubar as células durante tripsinização a 37 ° C, 6% v / v _{de CO2,} durante cerca de 10 min.
4. Controlar a separação celular por inspeção visual usando um microscópio e Facilitate o descolamento das células tocando no lado dos frascos contra a área de trabalho.
   NOTA: As etapas 2,5-2,8 são críticos e deve ser concluído dentro de 15 - 20 min.
5. Após o tratamento com tripsina, gentilmente re-suspender as células em meio de astrócitos 7 mL e transferir a suspensão de células para um tubo de 15 mL. Centrifugar durante 5 minutos a 216 x g.
6. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 1 mL de meio de astrócitos.
7. Contar as células utilizando uma câmara de contagem.
8. Encha o fundo das cavidades da 24 poços da placa com meio de astrócitos 500 uL e transferir 25.000 células em meio de astrócitos 500 ul em cada inserção individual. Incubar a cultura a 37 ° C, 6% v / v _{de CO2.}
   NOTA: Depois de 42-72 h as culturas irá atingir cerca de 100% de confluência. Nesta fase, a pureza da cultura pode ser verificada por meio de imunocitoquímica ^11. As culturas confluentes podem ser mantidos durante até 7 d até se proceder àpróximo passo. Mudar metade do meio a cada 3 d.

3. Preparação de primário neurônios do hipocampo

Nota: os neurônios do hipocampo de rato primária deve ser derivado de E15.5 - embriões E16 de ratos grávidas cronometrados.

1. Preparar o meio neuronal (MEM com piruvato de sódio 10 mM, 0,1% w / v de ovalbumina, 2% v / v de suplemento de meio B27, e 0,1% v / v de gentamicina (filtrado estéril)), e meio de preparação (HBSS com 0,6% w / v de glucose e 10 mM HEPES (ácido 4- (2-hidroxietil) -1-etanossulf único piperazina)). Pré-aquecido e pré-equilibrar a forma neurónio em frascos de filtro a 37 ° C, 6% v / v _{de CO2.}
2. Coloque as lamelas de vidro-(12 mm de diâmetro) para os poços de 24 poços-placas (use as lamelas especiais, que são entalhadas para o uso com inserções de cultura de células).
   1. Revestimento durante pelo menos 1 h com 15 ug / ml de poli-DL-ornitina em água (cultura celular de grau) a 37 ° C. Use pelo menos, 500 uL por poço para assegurar queas lamelas estão completamente cobertos. Lavar as cavidades duas vezes com PBS. Deixar o PBS nos poços até plaqueamento das células. Certifique-se de que os poços não sequem.
3. Para dissecar os hipocampos, prepare 3x 10 cm pratos cheios com meio de preparação e 1x tubo de 2 mL com um meio de preparação mL. Prepare uma tesoura e 2 pinça fina.
4. Sacrificar o mouse grávida por deslocamento cervical, esterilizar o abdómen por lavagem com 70% v / v de etanol, e abrir o abdômen usando uma tesoura afiada. Excisão do útero frisado cuidadosamente com uma tesoura e transferir o órgão em 1x placa de 10 cm cheios com meio preparação.
5. Em seguida, retire os embriões do útero. Cuidadosamente inciso do útero e remover a membrana amniótica sem prejudicar os embriões usando 2 fórceps. Em seguida, decapitar cada embrião com um par de tesouras e transferir as cabeças para uma segunda placa de 10 cm com meio de preparação fornecido.
6. Prosseguir com a preparação das cabeças (semelhante ao preparção descrita em 1,4-1,7).
   1. Imobilizar a cabeça com um par de pinças e incisão no crânio e a pele na região do pescoço próximo da parte posterior do cérebro, perpendicular ao neuroeixo. Usar um segundo par de fórceps para levantar tanto crânio e cobrindo a pele, e dobrar o gorro macio para a extremidade rostral da cabeça, expondo assim o cérebro.
   2. Com a ajuda de uma pinça 2, retire o cérebro da cavidade craniana. Para fazer isso, par próximo 1 de fórceps e separar o cérebro do crânio começando pelos bulbos olfatórios e se movendo em direção à parte posterior do cérebro. Recolher os cérebros em outra placa de 10 cm cheios com meio preparação.
7. Dissecar a hipocampos a partir das porções do córtex, tal como descrito acima para a preparação de astrócitos (passo 1.6). Remova o hipocampo de cada hemisfério e recolhê-las no tubo de 2 mL cheio com meio de preparação.
8. Depois de completar a dissecção, transferir o tubo para o banco de fluxo laminar estéril e Digest o tecido do hipocampo com uma solução de digestão mL contendo papaína. Preparar a solução de digestão tal como descrito no passo 1,9-1,10, mas em vez disso utilizar MEM DMEM.
   NOTA: os passos 3,9-3,12 são críticos e devem ser concluídas dentro de 10 - 15 min.
9. Após a conclusão da digestão, retirar-se cuidadosamente a solução de digestão por sucção suave com uma pipeta.
10. Lave o hipocampo 3 vezes com meio neurônio adicionando sequencialmente e, posteriormente, aspirando cuidadosamente 1 mL meio de cultura fresco por ciclo de lavagem. Não centrifugar a suspensão de células.
11. Após o passo de lavagem final, tritura-se cuidadosamente o tecido em 1 ml de meio neuronal.
12. Contar as células utilizando uma câmara de contagem e a placa 35.000 células em 500 uL de meio por neurónio um único poço de uma de 24 cavidades de placa (a placa mencionado em 3.2).
    NOTA: Opcionalmente, uma alíquota de células podem ser contrastadas com azul de tripano para avaliar a vitalidade da preparação celular. Controlar a densidade de revestimento por inspecionar visuaisiões utilizando o microscópio (tipicamente 90 - 110 células por campo visual de um objectivo padrão 10X).
13. Neurónios colocar no incubador a 37 ° C, 6% v / v _{de CO2,} durante 1 h.
14. Publique incubação, tomar as inserções preparados (semeada com monocamadas confluentes de astrócitos) para fora da incubadora (veja o passo 2.8). Trocar o meio por aspiração do meio astrócitos e substituí-lo com 500 ul fresco neurônio médio.
    NOTA: As inserções devem abrigar monocamadas de astrócitos confluentes após 2-3 DIV (dias in vitro).
15. Coloque as inserções com astrócitos com cuidado para os poços que contêm as culturas de neurônios (passo 3.13) usando uma pinça estéril.
16. Coloque a co-cultura de neurónios-astrócitos indirecta resultante de volta na incubadora a 37 ° C, 6% v / v _{de CO2.}
    Nota: Sob estas condições, os neurónios podem ser cultivada por até quatro semanas em meio completamente definido. Nenhuma mudança médio é necessário. Para as culturas de longa data, recomenda-se a encher eMtpa poços com água estéril, a fim de reduzir a evaporação a partir da placa bem-24.
17. Execute in vitro de células análises após períodos de cultura desejada (por exemplo, por imunocitoquímica, PCR, Western Blot, registros eletrofisiológicos (patch clamp ou matriz multieletrodo)) ^7,15,18.
    NOTA: O sistema de cultura também é adequado para o tratamento farmacológico aguda e crónica das culturas ^11.

Resultados

A análise das culturas neuronais através do sistema de co-cultura indirecta é heterogénea e pode ser realizada em diferentes estágios de maturação da cultura. Devido ao facto de que as células podem ser mantidas durante até 4 semanas, as investigações a longo prazo das culturas são possíveis.

O esquema no painel central esquerdo da Figura 1 demonstra a configuração de co-cultura. Com a utilizaç...

Discussão

O principal objetivo do protocolo atual é a de culturas neuronais e astrócitos completamente separadas, mantendo-os em meio compartilhado. Por esta razão, a pureza das culturas obtidas deverá ser verificada no início do procedimento. Recomendamos o uso de neurônio-específica tubulina, neurofilaments ou proteína NeuN como marcadores neuronais, GFAP como marcador de astrócitos, o antígeno O4 como marcador precursor oligodendrócitos e proteína Iba1 para identificar microglia.

Preste...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
B27	Gibco (Life Technologies)	17504-044
Cell-culture-grade water	MilliQ
Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC)	Sigma-Aldrich	C1768	CAUTION: H317, H361
DMEM	Gibco (Life Technologies)	41966-029
DNAse	Worthington	LS002007
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1397	CAUTION: H317-334
Glucose	Serva	22700
HBSS	Gibco (Life Technologies)	14170-088
HEPES	Gibco (Life Technologies)	15630-056
Horse serum	Biochrom AG	S9135
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C-2529
MEM	Gibco (Life Technologies)	31095-029
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A7641	CAUTION: H334
Papain	Worthington	3126
PBS	self-made
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P0899
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P3655
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636
Trypsin-EDTA	Gibco (Life Technologies)	25300054
Equipment
24-well-plates	Thermoscientific/Nunc	142475
24-wells-plate (for the  indirect co-culture)	BD Falcon	353504
Binocular	Leica	MZ6
Cell-culture inserts	BD Falcon	353095
Centrifuge	Heraeus	Multifuge 3S-R
Counting Chamber	Marienfeld	650010
Forceps	FST Dumont (#5)	11254-20
glass cover slips (12 mm)	Carl Roth (Menzel- Gläser)	P231.1
Incubator	Thermo Scientific	Heracell 240i
Micro-tube (2 mL)	Sarstedt	72,691
Microscope	Leica	DMIL
Millex Syringe-driven filter unit	Millipore	SLGV013SL
Orbital shaker	New Brunswick Scientific	Innova 4000
Parafilm	Bemis	PM-996
Petri dishes (10 cm)	Sarstedt	833,902
pipette (1 mL)	Gilson	Pipetman 1000
Sterile work bench	The Baker Company	Laminar Flow SterilGARD III
Surgical scissors	FST Dumont	14094-11
Syringe	Henry Schein	9003016
T75 flask	Sarstedt	833,911,002
tube (15 mL)	Sarstedt	64,554,502
Water bath	GFL	Water bath type 1004