Évaluation de la procédure pour effectuer une cystéromie éveillée dans un modèle de souris

Résumé

Cette étude décrit les procédures chirurgicales et les techniques expérimentales pour effectuer une cystométrie éveillée dans une souris qui se déplace librement. En outre, il fournit des preuves expérimentales pour soutenir son optimisation et sa standardisation.

Résumé

La cystométrie de remplissage éveillée a été utilisée pendant longtemps pour évaluer la fonction de la vessie chez les souris qui se déplacent librement, mais les méthodes spécifiques utilisées varient selon les laboratoires. L'objectif de cette étude était de décrire la procédure microchirurgicale utilisée pour implanter un tube intravésical et la technique expérimentale pour l'enregistrement de la pression de la vessie dans une souris éveillée et en mouvement libre. En outre, des données expérimentales sont présentées pour montrer comment la chirurgie, ainsi que le type et la taille du tube, affectent la fonction inférieure du système urinaire et la sensibilité de l'enregistrement. L'effet du diamètre du tube sur l'enregistrement sous pression a été évalué dans des tubes en polyéthylène et en polyuréthane avec des diamètres internes différents. Par la suite, le tube le plus performant des deux matériaux a été implanté chirurgicalement dans le dôme de la vessie de souris mâles C57BL / 6. Une fréquence de miction de douze heures et une nuit a été enregistrée chez des animaux et des animaux sains, intacts 2, 3, 5 et 7 jours après la chirurgie. À la récolte, les vessies wOn a évalué les signes de gonflement en utilisant une observation brute et ont ensuite été traités pour une analyse pathologique. La plus grande étendue du gonflement de la vessie a été observée au jour 2 et 3, ce qui était en corrélation avec les données de mictions comportementales montrant une déficience significative de la fonction de la vessie. Au jour 5, l'histologie de la vessie et la fréquence d'annulation ont été normalisées. Sur la base de la littérature et des preuves fournies par nos études, nous proposons les étapes suivantes pour l' enregistrement in vivo de la pression intravésicale et du volume annulé dans une souris éveillée: 1) Effectuer la chirurgie à l'aide d'un microscope opérationnel et d'outils microchirurgicaux, 2) Utiliser du polyéthylène-10 Tubes pour minimiser les artefacts de mouvement, et 3) Effectuer la cystométrie le jour 5 après l'opération, lorsque le gonflement de la vessie se résout.

Introduction

La cystométrie de remplissage (FC) est une méthode de diagnostic consistant à placer un cathéter dans la vessie pour enregistrer la pression pendant le remplissage lent de la vessie. Introduit en 1927 en tant que méthode de diagnostic clinique pour évaluer la fonction des voies urinaires inférieures, il est resté largement utilisé. ¹ Dans les applications de recherche, le FC peut être utilisé pour tester la fonction de la vessie dans des modèles animaux sains et malades et pour étudier les effets des agents pharmacologiques. Les modèles animaux de rongeurs sont couramment utilisés pour étudier la fonction des voies urinaires inférieures. ² Dans ce groupe de mammifères, le FC a d'abord été développé pour être utilisé chez des rats. ³ Ici, la méthodologie pour implanter un tube dans la vessie et effectuer le FC a été bien décrite et utilisée par de nombreux chercheurs avec un niveau de reproductibilité acceptable. ⁴ La disponibilité de souches transgéniques et knock-out fait de la souris une espèce précieuse pour de nombreuses zones de recherche,Y compris le domaine du dysfonctionnement des voies urinaires inférieures. La méthodologie utilisée pour effectuer la cystométrie de souris varie sensiblement entre les laboratoires, ce qui rend difficile la comparaison des résultats. ⁵

Par rapport aux modèles ex vivo , le FC préserve l'anatomie des voies urinaires inférieures, ce qui permet d'évaluer la fonction coordonnée entre la vessie et sa sortie pendant les phases de stockage et de mictions du cycle de la miction. Des recherches antérieures montrent que de nombreux anesthésiques couramment utilisés suppriment la contraction de la miction. Les agents qui préservent la contraction des muscles lisses de la vessie urinaire (uréthane, α-chloralose, kétamine et xylazine), permettant à l'animal de se moudre, réduisent encore considérablement la capacité fonctionnelle de la vessie et suppriment la neurotransmission. ^{6 , 7 , 8 , 9} Bien que techniquement plus difficile, FC a joué en awLes animaux ambulants conservent l'intégrité fonctionnelle du réflexe de miction.

La fonction des voies urinaires inférieures est influencée par de multiples facteurs, y compris l'enflure post-opératoire de la vessie, le stress dû à la douleur et à l'inconfort et les influences environnementales. L'utilisation d'une technique chirurgicale qui minimise les dommages aux tissus pendant l'implantation du tube et les méthodes d'enregistrement qui réduisent le mouvement du tube, tout en permettant simultanément à l'animal d'ambuler, sont essentielles pour obtenir des enregistrements précis et reproductibles.

Si elle est effectuée de manière adéquate, in vivo Le FC dans les animaux en mouvement libre peut fournir des données qui reflètent fidèlement la fonction physiologique de la vessie. ¹⁰ FC dans les animaux en mouvement libre peuvent fournir des données sur les paramètres suivants; Pression basale ou de base: pression minimale entre deux mictions. Pression d'intermittence: pression moyenne entre deux mictions. Pression de seuil: pression intra-survie immAvant la miction. Pression maximale: Pression maximale de la vessie pendant un cycle de miction. Activité spontanée (ou pression oscillatoire moyenne d'interconnexion): pression d'intermittence moins pression basale. Contractions non annulatoires: Augmentation de la pression intravésicale pendant la phase de remplissage, non associée à la libération de fluide. Conformité à la vessie: capacité de la vessie divisée par la pression de seuil moins la pression basale. Fréquence de miction: Nombre de mictions par unité de temps. Intervalle d'intermédiation: Période comprise entre deux pressions annulantes maximales. Capacité de la vessie: volume infusé divisé par le nombre de mictions. Une description détaillée de ces paramètres et de la terminologie standardisée a déjà été publiée. ¹¹

Le FC peut être effectué en utilisant une méthode de perfusion intravésique en continu ou à cycle unique. La cystométrie continue permet d'enregistrer de multiples cycles de miction et de sélectionner des données représentatives baséesSur la reproductibilité. Sa précision dans la mesure de la capacité de la vessie est limitée en raison du volume résiduel inconnu. En outre, il est difficile de collecter de petits volumes annulés (qui, selon la tension et le sexe, varient entre 30 et 184 μL) chez des souris ambulantes. L'utilisation de cette méthode pour enregistrer le volume annulé est moins précise par rapport à une préparation anesthésiée, mais elle est supérieure car elle évite les effets suppressifs des anesthésiques sur la fonction de la vessie. La cystométrie à cycle unique doit être utilisée pour évaluer la capacité de la vessie. Dans cette méthode, la vessie est vidée par aspiration avant la perfusion et la capacité est calculée en fonction de la vitesse de perfusion multiplié par le temps à la pression maximale.

Bien que la technique d'exécution de la cystométrie chez les petits rongeurs ait été publiée, elle décrit la chirurgie effectuée chez un rat et a recommandé que la cystométrie de la souris soit réalisée sous anesthésie uréthane. ¹⁰ Le but de cette communication est tO décrire à la fois les techniques microchirurgicales utilisées pour implanter un tube intravésical dans le dôme de la vessie et la mise en place expérimentale utilisée pour enregistrer la fonction du tractus urinaire inférieur, in vivo , lors du remplissage continu de la vessie et de la miction sur une souris éveillée en mouvement libre. De plus, des expériences ont été effectuées pour déterminer comment la longueur, le diamètre et le matériau de la tubulure, ainsi que la méthodologie pour effectuer le FC in vivo , affectent l'enregistrement. Ce protocole expérimental résume les techniques publiées précédemment et propose un certain nombre de modifications basées sur des résultats expérimentaux.

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Protocole

Les animaux ont été hébergés dans l'établissement de soins des animaux de l'Université de Vermont selon les lignes directrices institutionnelles. Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément au guide des instituts nationaux de la santé pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Intravesical Tube Implantation

1. Préparation de tubes et d'instruments pour la procédure chirurgicale
   1. Couper un morceau de PE10 de 7 cm pour former le cathéter pour l'implantation.
   2. Créez une étincelle à une extrémité du tube PE10 en avançant lentement l'extrémité vers une flamme nue.
      REMARQUE: Retirez rapidement le tube dès que l'évasement se développe.
   3. Appliquer trois gouttes de colle chaude polyvalente, en utilisant le réglage de chaleur faible sur un pistolet à colle, à 4,5, 5 et à 5,5 cm de l'extrémité évasée à l'extérieur du tube PE10. Ceux-ci aideront à sécuriser le tube au dos de l'animal. ( Figure 1 )
   4. Stériliser le tube en le trempant dans 70%Éthanol, puis rincer avec du NaCl stérile à 0,9% avant utilisation. Laissez le tube rempli pour éviter d'introduire des bulles d'air dans le système.
   5. Créez une fiche de calibre 30 pour sceller l'extrémité du cathéter PE10 en séparant une aiguille de calibre 30 du moyeu en manipulant manuellement l'extrémité proximale côte à côte. Appliquer une goutte de colle chaude à la fin. Assurez-vous que le joint est étanche. ( Figure 2 )
   6. Utilisez les instruments microchirurgicaux suivants: Deux paires de microforceps courbes Dumont # 7, deux paires de microforceps courbes Dumont # 5, une aiguille 21 G, un hémostatique droit ultrafine, des microcisifs, de petits ciseaux à dissection et un porte-micro-aiguille.
   7. Stériliser tous les instruments avant de commencer la procédure.
2. Préparation de l'animal
   1. Après avoir anesthésié l'animal, raser d'abord la moitié inférieure de l'abdomen, puis tourner l'animal enclin et se raser et nettoyer la zone du haut du dos avec 70% d'alcool suivi de la betadine. Appliquer une pommade vétérinaire aux yeux pour éviter la sécheresse. Ensuite, utilisez une paire de ciseaux droites et émoussés et une paire de microforceps courbes Dumont # 7 pour effectuer une incision cutanée de 1,5 cm de long entre l'omoplate et placer l'animal en décubitus sur un coussin chauffant (37 ° C) recouvert de rideaux stériles.
   2. Enfin, nettoyez l'abdomen avec de l'alcool et de la betadine.
3. Opération chirurgicale
   REMARQUE: Effectuez toutes les interventions chirurgicales sous un microscope d'exploitation avec un grossissement allant de 3.15X à 20X. Après avoir placé l'animal sur les rideaux stériles, mettre des gants stériles. Continuez à utiliser des procédures stériles tout au long de la chirurgie.
   1. Placez l'animal dans une boîte d'induction et anesthésie en utilisant 2% d'isoflurane inhalé avec un support d'oxygène (1 L / min). Maintenir l'anesthésie tout au long de la procédure en plaçant la tête de l'animal dans un cône de nez et en utilisant 2% d'isoflurane inhalé avec un support d'oxygène (1 L / min). Commencez la chirurgie après avoir reçu un négRéponse positive du test de pincement.
   2. Utilisez une paire de ciseaux francs et émoussés et une paire de microforceps courbes Dumont # 7 pour réaliser une incision abdominale inférieure de 1,5 cm dans la peau. Par la suite, créez une incision correspondante à travers le fascia le long du linea alba et du muscle pour exposer le dôme et la moitié supérieure de la vessie. Évitez de blesser la vessie en appliquant une traction vers le haut à chaque couche de tissu en utilisant une paire de microforceps courbes Dumont # 7. Garder les viscères abdominaux de la dessiccation en ajoutant des gouttes de solution saline physiologique chaude.
   3. Faites pivoter l'animal sur son côté pour accéder à l'incision sur la nuque. Poussez un hémostatique étroit par voie sous-cutanée par l'incision. Le canal sous-cutané devrait commencer par le dos et continuer le long du côté.
   4. Une fois que la pointe de l'instrument atteint le fond de la cage thoracique, tournez la pointe vers la ligne médiane et à l'intérieur de l'abdomen (il y aura une légère pop lors du perçage des muscles de la paroi abdominale). Continuez à avancer l'hémostatique jusqu'à ce que la pointe soit exposée à l'incision abdominale sous la couche musculaire. ( Figure 3 )
   5. Saisissez l'extrémité "non évasée" du tube avec l'hémostatique et retirez lentement l'outil, en tirant la fin du tube par l'incision à l'arrière du cou. Réglez l'extrémité évasée du tube afin qu'il soit directement au-dessus du dôme de la vessie.
   6. Faites une baguette lâche de la suture monofilamentée 6-0 (non absorbable) et placez-la sur le sommet de la vessie. Cette cravate sera utilisée plus tard pour sécuriser le tube dans la vessie.
   7. Placez un petit rouleau de tissu sans peluches dans l'abdomen et derrière la vessie pour aider à la stabiliser et à l'élever.
   8. Préparez-vous à insérer l'extrémité évasée du cathéter PE10 dans la vessie.
      1. Dans la main non dominante, maintenez le dôme de la vessie avec des microforceps courbes Dumont # 7 et maintenez cette poignée jusqu'à ce que le cathéter soit placé dans la vessie.
      2. Utilisez une aiguille de calibre 21 tO faire une cystotomie dans le sommet du dôme. Essuyez doucement la cystotomie avec une paire fermée de microforceps courbes n ° 5 pour s'assurer que le cathéter peut facilement passer à travers le trou.
      3. Tout en maintenant le dôme de la vessie dans la main non dominante, placez l'extrémité évasée du cathéter PE10 dans la vessie (enfoncez le flare vers le bas vers le col de la vessie afin qu'il ne glisse pas en le fixant).
      4. Attachez la suture monofilamentée 6-0 autour du dôme de la vessie et du tube avec la cravate placée antérieurement à la tubulure. Assurez-vous d'attacher la suture aussi haut que possible sur la vessie pour éviter de réduire artificiellement la capacité de la vessie. ( Figure 4 )
      5. Alternativement, fixez le cathéter à l'aide d'une suture à cordon de sac à main comme suit. Faire une suture de cordon de sac à main lâche sur le dôme de la vessie en utilisant un monofilament 6-0. Suivre les étapes 1.3.8.1 - 1.3.8.3 pour effectuer la cystotomie et insérer le cathéter. Fixez le tube en attachant la suture du cordon. ( Figure 5 )
   9. Testez la perméabilité et le joint du tube dans la vessie en attachant une seringue à insuline de 0,5 mL avec une aiguille de calibre 30 à l'extrémité distale du tube. Remplir lentement la vessie avec 0,1 à 0,2 ml de NaCl 0,9% jusqu'à ce qu'une goutte apparaisse à l'orifice de l'urètre, puis vider la vessie par aspiration. Il est important que la vessie soit à la fois remplie et vidée.
   10. Si aucune fuite ne se produit dans le dôme, appuier la vessie avec une paire de microforceps courbes et tirer doucement sur le tube jusqu'à ce que la flambée repose contre l'intérieur du dôme de la vessie.
   11. Avant de fermer, retirez le petit rouleau de papier et assurez-vous que la vessie est dans sa position normale.
   12. Fermez la paroi abdominale en deux couches (muscle et peau) avec une suture de course de 6-0. Il est préférable d'approcher le muscle du rectus abdominis en suturant uniquement les arêtes du fascia antérieur abdominal (paroi antérieure de la gaine rectale).
   13. Pour sécuriser le tube à l'arrière des animaux, doucementTate l'animal sur son abdomen. Insérer la partie sous-cutanée de l'ancre métallique dans l'incision interculturelle. ( Figure 12 ) Utilisez une suture 6-0 pour fixer le tube et l'ancre en les encerclant avec une suture de matelas verticale.
   14. Assurez-vous qu'une bulle de colle reste au-dessus et au-dessous de la peau pour éviter que le tube ne s'arrête. Couper le tube à environ 2 cm au-dessus de la peau.
   15. Insérez délicatement la fiche à calibre 30 (étape 1.1.5) dans l'extrémité du tube pour empêcher l'urine de fuir.
4. Injecter par voie sous-cutanée 0,5 ml de NaCl à 0,9% pour l'hydratation. Donner une analgésie post-opératoire immédiatement après la chirurgie et maintenir pendant 48 h.
   1. Placez l'animal dans sa cage située sous une lampe infrarouge. Maintenir une observation constante jusqu'à ce que l'animal se déplace librement dans la cage.
5. Surveillez quotidiennement l'animal et laissez-le récupérer pendant 5 jours avant l'enregistrement.

2. Kysté réveilléEnregistrement d'ometrie

1. Préparation du programme d'enregistrement, du transducteur de pression et de la pompe à perfusion.
   1. Avant d'anesthésier l'animal, connectez la pompe à perfusion, le transducteur de pression et le pivot 22 G à l'aide de tubes PE50. ( Figure 6 )
   2. Ouvrez le programme d'enregistrement (voir la table des matières pour un exemple), sur un ordinateur pour étalonner la pression du système et préparer l'enregistrement. Assurez-vous d'utiliser les mêmes paramètres pendant l'étalonnage et l'enregistrement.
      1. Remplir une seringue de 20 ml avec 10 à 15 ml de température ambiante 0,9% de NaCl et charger dans la pompe à perfusion. Programmer la pompe pour infuser à un taux de 0,6 mL / h.
      2. Fixez le transducteur de pression à la même hauteur que la vessie de l'animal ou le fond de la cage d'enregistrement.
      3. Fixez le pivot de calibre 22 à la fin du transducteur de pression (PE50 - tube - transducteur de pression pour pivoter)
         REMARQUE: le pivot est utilisé pour empêcher le tube de tordre ou de tordre unS l'animal se déplace.
      4. Avancez la pompe de la seringue pour rincer 0,9% de NaCl dans le système. Assurez-vous d'enlever toutes les bulles d'air avant d'étalonner.
      5. Lorsque le programme d'enregistrement fonctionne, utilisez une règle pour étalonner la pression (cm / H ₂ O). Déplacez lentement la longueur de l'attache PE50 de 0 à 30 cm. Ajustez le zéro si nécessaire.
         REMARQUE: La marque de 0 cm doit être à la même hauteur que le sol de la cage d'enregistrement et du transducteur de pression.
   3. Suspendre le pivot de calibre 22 au-dessus du centre de la cage d'enregistrement. Assurez-vous que le fond de la cage permet à l'urine de tomber sur le collecteur de la balance positionnée au-dessous de la cage. Réglez la hauteur de l'attache afin que la souris puisse se déplacer librement autour de la cage sans forcer ou étirer le tube. ( Figure 7 )
   4. Une fois terminé, vérifiez que le système et le tube externe PE50 sont remplis de NaCl à 0,9% et toutes les bulles d'air ont été retirées.
2. PréparationL'enregistrement de l'animal pour l'enregistrement
   1. Anesthésier l'animal avec 2% d'isoflurane inhalé et le placer sur son abdomen. Retirez la fiche de calibre 30 et faites glisser le tube PE10 (cathéter vessie) à l'extrémité de la sangle PE50. Utilisez de la colle chaude pour former un joint étanche à l'eau.
   2. Éteignez l'anesthésie et placez l'animal dans la cage d'enregistrement avec un plancher en fil parallèle, ce qui permettra à l'urine de tomber directement sur un dispositif collecteur placé sur une balance analytique. ( Figure 7 )
   3. Commencez l'enregistrement une fois que l'animal est dans la cage, mais ne commencez pas à infuser. Surveillez l'animal jusqu'à ce qu'il récupère complètement de l'anesthésie. Une fois que la pression de la vessie se stabilise, commencer à infuser 0,9% de NaCl à un taux de 0,6 mL / h.
      REMARQUE: Effectuez une note dans le programme d'enregistrement lorsque des modifications sont apportées. Il est important d'avoir un compte rendu de la début de la perfusion, des arrêts ou des irrégularités.
   4. Vérifiez le système pour détecter les fuites et assurez-vous que l'animal a facilement accEssence et eau.
   5. Continuer l'enregistrement dans une pièce tranquille jusqu'à ce que trois cycles de miction puissantes soient obtenus.
      REMARQUE: l'animal doit être totalement perturbé tout au long de l'enregistrement. De préférence, utilisez la surveillance vidéo à distance pour observer le comportement.

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Résultats

Il n'y avait pas de différence significative entre les matériaux et les diamètres des tubes dans la consistance de l'augmentation de la pression et tombent dans le système pendant l'occlusion du tube. L'implantation du tube intravésical après gonflement de la paroi de la vessie était significative pour les matériaux en polyéthylène (PE) et en polyuréthane (PU). Le jour 2, un gonflement sous-muqueux sévère s'est développé. Il occupait la moitié de la se...

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Discussion

Matériau optimal et taille du tube intravésiculaire

Pour déterminer l'effet du diamètre du tube sur les enregistrements de pression, nous avons testé différents tubes microfluidiques; PE50 (0,58 mm ID), polyuréthane PU027 (0,4 mm ID), PE25 (0,46 mm ID) et PE10 (0,28 mm ID). Pour chaque tube, la pression a été enregistrée avec la pompe à perfusion à 1 mL / h, tout en déplaçant rapidement le tube verticalement de 0 à 30 cm. Les expériences initiales in vivo ont tenté d'ut...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene (PE) 10 tubing	Instech	BTPE-10	Fits 30G connectors/plugs
Polyethylene (PE) 50 tubing	Instech	BTPE-50	Fits 22G connectors/plugs
22 G single channel stainless steel swivel	Instech	375/22
High Carbon Steel Utility Extension Spring (9/64" OD)	Grainger	1NAH1	Protects PE50 tubing - Cut to length
22 G connector	Instech	SP22/12
Yutaoz Professional Hot Melt Adhesive Glue Gun	Yutaoz		Use low temperature setting (100 °C) - Any hot melt glue gun with an adjustable temperature range will work
Surebonder DT-2010 all purpose glue stick	Surebonder		Any all purpose hot glue will work
Dumont #5 curved microforceps	World Precision Instruments	500232
Dumont #7 curved microforceps	World Precision Instruments	14188
Mini dissecting scissors - straight	World Precision Instruments	503240
Micro mosquito forceps (12.5 cm)	World Precision Instruments	500451
Dissecting scissors - straight	World Precision Instruments	14393
Castroviejo Needle Holder	World Precision Instruments	503258
Isoflurane, USP	Phoenix		2%, 1 L/min flow rate
Buprenorphine			0.05 mg/kg
0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP	Baxter
6-0 Ethilon black monofilament, non-absorbable suture	Ethicon		Bladder tie
6-0 Vicryl violet braided, absorbable suture	Ethicon		Muscle suture, running
6-0 Prolene blue monofilament, non-absorbable suture	Ethicon		Skin suture, vertical mattress, buried interrupted
KD Legato 210 infuse/withdraw pump	KD Scientific		1.5 mL/hr
Disposable pressure transducer	Digitimer	NL108T2
Pressure Amplifier	Digitimer	NL108A
Power1401-3 data acquisition interface	Digitimer
Spike2	Cambridge Electronic Design Limited		PC pressure recording software
Leica MZ6 surgical operating microscope (3.2 - 20X)	Leica Microsystems		Magnification